Несмотря на существенные достижения в последние 20 лет в понимании, как работает этот процесс и каким целям он служит, остаются вопросы—как формируются аутофагосомы? Более специфически, где образуются их не один, а два липидных бислоя? Аутофагосомы не являются предварительно созданными органеллами, которые становятся активными после индукции аутофагии; они образуются на царапинах в любой момент времени, когда необходимы клетке, чтобы дегенерировать один или более из её составляющих. И они являются гигантскими пузырьками со средним диаметром приблизительно в 700–800 nanometers, которые могут ещё больше расширяться, чтобы приспособиться к таким крупным структурам, как клеточные органеллы и бактерии, и которые возникают в больших количествах в условиях, индуцирующих аутофагию. Как результат прогрессия аутофагии нуждается в готовности поставлять липиды. Этот аспект процесса интригует исследователей с момента открытия аутофагии в 1950s и ’60s. Понимание биогенеза аутофагосом д. базироваться на информации, как клетки генерируют новые компартменты в ответ на внутренние и внешние сигналы и это должно привести к четкой концепции клеточного гомеостаза.
Infographic: How Autophagy Works
View full size JPG | PDF
Maria and Peter Hoey
Важным для вопроса о происхождении аутофагосом является источник липидов, необходимых для построения пузырьков с двойной мембраной, и способа их доставки. Одним из основных затруднений в этом вопросе является то, что аутофагосомы не содержат маркерных белков, которые бы определенным образом связывали их с известными субклеточными органеллами, это затрудняет определение их источника. В самом деле, аутофагосомы отличаются от всех др. органелл в клетке как по структуре, так и составу белков. Недавние успехи в микроскопической технике и биохимических подходах стимулировали серию исследований по этому вопросу, но резуьтаты оказались противоречивыми, по крайней мере, на первый взгляд, при этом разные группы идентифицировали доказательства вкладов из плазматической мембраны клетки, эндоплазматического ретикулума, митохондрий и комплекса Гольджи. Из каких из этих органелл происходят аутофагосомы или участвуют они все? Ответ на этот вопрос является обязательным для понимания и манипулирования механизмом аутофагии. В свою очередь, это знание важно для разработки тераии и лекарств, которые были нацелены на этот путь, чтобы воздействовать или даже излечивать болезнь, при которой аутофагия нарушена или блокирована.
Биогенез и использование аутофагосом могут быть подразделены на 5 самостоятельных ступеней: индукция, экспансия, завершение образования пузырьков, слияние и деградация груза. Инициальным событием по индукции является образование мембранозных цистерн, наз. фагофорами, или выделение мембран. Этот компартмент, по-видимому, генерируется из нечто такого, что определяется у дрожжей как место сборки фагофор (PAS) или пре-аутофагосомная структура, предполагаемый ранний предшественник аутофагосом, который образуется в результате последовательной ассоциации, по крайней мере, субнабора Atg белков, которые, как известно, специфически участвуют в аутофагии. Последующая экспансия фагофор путем приобретения дополнительных липидов делает возможным включение внутрь внутриклеточного матриала, нуждающегося в деструкции. Пузырьки с двойной мембраной образуются, когда внутренний и наружный бислой сливаются, чтобы сформировать две самостоятельные мембраны, одна внутри другой. Сформированные аутофагосомы сначала сливаются с эндосомными структурами, чтобы сформировать amphisomes (событие, которое, по-видимому, не происходит у дрожжей), и затем с лизосомами у млекопитающих или дрожжевыми и растительными вакуолями, это делает возможной деградацию внутреннего пузырька и его груза с помощью кислых гидролаз, располагающихся в литических компартментах. Наконец, генерируются основные метаболиты в результате этого катаболического процессинга биологических макромолекул и транспортируются в цитоплазму, где они повторно используются или в качестве источника энергии или как строительные блоки для новых белков и липидов.
Mixed membrane messages
THE ENDOPLASMIC RETICULUM
Endoplasmic reticulum
Maria and Peter HOey
Первой органеллой предположенной в качестве источника аутофагосомных мембран стал эндоплазматический ретикулум (ER), компартмент, ответственный за продукцию белков и липидов, которые составляют клетку. Морфологические исследования, проведенные в 1970s, уже показали возможную функциональную связь между аутофагосомами и ER, поскольку эти две органеллы часто наблюдались в тесной близости. Эти наблюдения были в дальнейшем подтверждены иммуно-ультраструктурным анализом, осуществленным Bill Dunn из University of Florida в 1990, в котором интегральные мембранные белки грубого ER были обнаружены как во внутренней, так и наружной мембранах ацтофагосом.
Сравнительно недавно, используя ЭМ томографию для изучения трехмерной организации этих органелл, две ruheggs подтвердили и углубили эти пионерские наблюдения, открыв существование физической связи между ER и формирование аутофагосом. В 2009, Mitsuko Hayashi-Nishino с коллегами из Osaka University в Японии осуществили 3-D реконструкцию клеток, экспрессирующих мутантный ген, который вызывает дефекты образования фагосом, эффективно приостанавливая процесс на ранних стадиях образования аутофагосомных мембран (т.e., на ст.фагофор).1 Этот анализ выявил, что ER и растущая фагофора интимно ассоциированы, это указывает на то, что зарождающиеся аутофагосомы ответвляются от ER. Фактически грубый ER соединен посредством единственной точки контакта и с наружной и с внутренней мембранами фагофоры, это подтверждает мнение, что липиды должны быть предоставлены посредством прямого переноса в месте контакта мебран. Неясно однако, начинается ли образование мембрны фагофор на ER, или мембраны просто растут после процесса, инициированного где-то в др. месте. Paivi Yla-Anttila из University of Helsinki и сотруюники получили сходные данные на др. типе клеток, но они сообщили о существовании нескольких точек контакта между этими двумя органеллами.2
Дальнейшее сообщение о вовлечении ER в образование аутофагосом получены в исследовании phosphatidylinositol-3-phosphate [PI(3)P], липида, важного для образования аутофагосом. В 2008 исследователи установили, что PI(3)P концентрируется в специфических регионах ER, где обнаруживаются аутофагосомы, отрывающиеся при условиях, вызывающих аутофагию.3 Та же самая группа показала, что бокало-подобные структуры, наз. ими omegasomes, которые могут быть предшественникми аутофагосом (возможно промежуточное состояние экспансии фагофор), возникают из этих богатых PI(3)P субдоменов. Эти находки были подкреплены новым сообщением, показавшим, что Atg14L, субъединица комплекса, участвующего в синтезе PI(3)P, ассоциирует с поверхностью ER.4 Сходным образом, DFCP1, белок, в основном расположенный на ER, обнаружен в ассоциации как с омегосомами2, так и аутофагосомными мембранами, соединенными с ER.1
Итак, эти данные подтверждают, что аутофагосомы возникают из ER. Однако 30% предшественников аутофагосом обнаруживаются при 3-D томаграфии не ассоциированными с ER, следовательно, возникает возможность, что д. существовать др. источник мембран для аутофагосом.
1
THE MITOCHONDRION
Mitochondrion
Maria and Peter HOey
В 2010 группа Jennifer Lippincott-Schwartz’s из National Institutes of Health в Bethesda предположила, что наружная мембрана митохондрий может служить основным источником липидного двойного слоя аутофагосом.5 Их находки были получены в результате обширного анализа клеток с помощью световой микроскопии, экспрессирующих флюоресцентно нагруженные меркерные белки для аутофагосом и белки, локализованные на наружной мембране митохондрий. В условиях аминокислотного голодания, который инициирует аутофагию, эти два набора маркерных белков были найдены совместно локализованными на зарождающихся аутофагосомах, указывая тем самым, что существует функциональная связь между митохондриями и аутофагосомами. Исследователи также наблюдали мощные прямые физические соединения между двумя этими органеллами, при этом аутофагосомы росли в тесной близи к митохондриям, что привело авторов к предположению, что митохондрии jm,tcgtxbdf.n формирование аутофагосом вновь синтезируемыми фосфолипидами.6-8 Сравнительно недавно, однакодр. группа установила, что Salmonella-содежащие структуры аутофагосом были негативны по этому самому митохондриальному маркерному белку, демонстрируя, что митохондриальные липиды не могут участвовать в биогенезе всех аутофагосом.9
Группа Lippincott-Schwartz’s также показала, что связь между митохондриями и ER является критической для формирования аутофагосом. Митохондрии обычно ассоциированы с ER посредством дискретных точек контакта, которые известны как mitochondrial-associated membranes (MAMs). В отсутствие MAMs, биосинтез фосфолипидов нарушается, указывая на их важную роль в обмене липидами между ER и митохондриями. Когда MAMs разрушены путем нокдауна одного из генов, участвующих в их поддержании, то голоданием индуцируемые аутофагосомы не образуются.
5 Это наблюдение привело к гипотезе, что вклад ER в качестве поставщика мембраны для аутофагии может быть важным как и вклад митохондрий. Др. возможная интерпретация заключается в том, что потеря соединения между двумя органеллами может приводить к нарушению некоторых функций ER, это, в свою очередь, может нарушать его вклад в биогенез и/или эксппансию фагофор и аутофагосом.
THE PLASMA MEMBRANE
Ещё один возможный участник в двойные мембраны аутофагосом является клеточная плазматическая мембрана. В 2010 лаб. David Rubinsztein в University of Cambridge сообщила. что некоторые пузырьки, формируемые плазматической мембраной, позитивны в отношении аутофагосомного маркера Atg16L1, и сливаются с подобными пузырьками, чтобы создавать раннеи предшественники аутофагосом, возможно фагофоры или омегафоры.
10 Дополнительные исследования той же самой группы выявили, что созревание Atg16L1-позитивных пре-аутофагосомных пузырьков необходимо для их слияния посредством действия белка плазматической мембраны SNARE и взаимодействующих с ним партнёров. Участие SNAREs плазматической мембраны, которые обеспечивают слияние пузырьков и экзоцитоз, на ранних ступенях аутофагии также было подкреплено исследованиями на дрожжах. Дополнительным подтверждением роли плазматической мембраны в биогенезе аутофагосом получены в результате открытия, что компоненты экзоциста—закрепляющий комплекс, который действует сочетанно с SNAREs, чтобы обеспечить слияние пузырьков, производных аппарата Гольджи, с плазматической мембраной—ассоциирует с зарождающимися аутофагосомами и что они важны для аутофагии, вызываемой голоданием.
THE GOLGI APPARATUS
Golgi apparatus
Maria and Peter HOey
Потенциальное участие экзоциста в формировании аутофагосом открывает также возможность, что аппарат Гольджи также является потенциальным источником мембран аутофагосом, т.к. комплекс экзоциста присутствует в Гольджи , а также в пузырьках, происходящих из него. Гольджи является органеллой, предназначенной для посттрансляционных модификаций и сортировки белков. Работа по дрожжевым из плазматической мембраны SNAREs показала, что эти белки регулируют организацию органелл, содержащих Atg9, трансмембранный белок, существенный для аутофагии. У дрожжей эти органеллы, которые были названы Atg9 резервуарами, по-видимому, происходят из Гольджи и играют центральную роль в обеспечении инициальными мембранами, необходимыми для генерации фагофор.
11 Уже в начале 1990s предполагалось участие Гольджи в биогенезе аутофагосом в клетках млекопитающих, поскольку растущие фагофорыЮ а также завершенные аутофагосомы, были декорированы белками. которые связывают цепочки сахаров исключительно присутствуя на post-Golgi мембранах. Эта концепция была недавно перепроверена на дрожжах и было установлено, что два комплекса, участвуюobt в мембранном трафике через Golgi, существенны для аутофагии.
A single model?
Поскольку исследователи накопили безусловно запутанные доказательства участия множественнх органелл в формировании аутофагосом, то возникающие в результате гипотезы взаимоисключающие. Необходимы дальнейшие исследования чтобы отсортировать какие органеллы вонсть вклад в биогенез аутофагосом, у каких видов и при каких условиях.
Очевидное расхождение между заключениями, к которым пришли разные лаб. относительно источника аутофагосомных мембран могут быть частично обусловлены разными эксперментальными подходами и техниками. Особенно важно, что разные вклады могут варьировать в зависимости от типа клеток и ткани и условий, использованных для запуска аутофагии, с клетками, использующими мембраны из наиболее подходящих или расходуемых источников. Так, в ткани с опрделенной функцией в ответ на специфические стрессовые стимулы растущие аутофагосомы д. подпитываться мембранами из наиболее оптимального резервуара: органелл, которые гарантируют доставку больших количеств липидов, но чье истощение идеально не должно негативно сказываться на функции ткани. the function of the tissue. Поверхностный взгляд на современные доступные данные могут привести к заключению, что голодающие животные используют ER, тогда как истощенные недостатком азота дрожжи используют Golgi, напр. Однако аккуратное сравнительное исследование необходимо для определения, верна ли эта тенденция для широкого разнообразия типов клеток и стрессовых условий.
Др. возможность заключается в том, что нельзя исключить a priori , что аутофагосомы могут обладать мозаичными мембранами, происходящими из более чем одной органеллы. Напр., фагофоры могут возникать из одной органеллы, тогда как дополнительные липидные бислои, необходимые для экспансии получаются из др. источника. Имея спектр мембранных источников для выбора это может помочь гарантировать доступность крупных поставок липидов, чтобы поддерживать прогрессирующую аутофагию. Можно представить, что одиночная внутриклеточная органелла не сможет предоставить достаточное количество липидов, чтобы генерировать множество аутофагосом в течение продолжительного периода голодания или стресса.
Наконец. всё ещё предстоить определить, могут ли различные органеллы, участвующие в биосинтезе аутофагосом вносить вклад в невыбираемую массу аутофгий или в селективные формы аутофагий, такие как mitophagy (избирательная деградация митохондрий), pexophagy (избирательная деградация пероксисом) или reticulophagy (избирательная деградация ER). В этом отношении наблюдение связи ER или митохондрий с мембранами фагофор, напр., может указывать но это скорее, чем вклад в формирование аутофагосом, эти органеллы действительно являются объектами процесса деградации.
Autophagosomal membranes and drug therapies
Экспериментальные доказательства показывают, что биогенез аутофагосом, по-видимому, очень сложный процесс на нескольких уровнях, включая его регуляцию в ответ на различные клеточные и средовые сигналы и факторы, управляющие выбором источника мембран.
Существуют ли какие-либо терапевтические данные для детерминации источника аутофагосомных мембран? Мы думаем, что выяснение этого процесса д. в конечном итоге предоставить новые лекарственные мишени для лечения болезни, которые могли бы облегчить или вылечить с помощью активации аутофагии, включая специфические мышечные дистрофии, персистирующие инфекции и нейродегенеративные нарушения (атаксии, болезни Гентнгтона и Паркинсона). Понимание источников и процессов, с помощью которых липидные бислои аутофагосом поставляются, будет без сомнения выявлять критические новые белки и выяснять из функции, это позволит исследователям выявлять специфические части пути.
Важно, что аутофагия также ассоциирует с раком. Напр., потеря одной из двух копий
Beclin1/Atg6, гена, участвующего в аутофагии, часто обнаруживается при раке груди, яичников и простаты человека.
12 Сходным образом альтерации факторов, регулирующих трафик трансмембраннго белка Atg9, обнаружены как прямая причина туморогенеза. Эти наблюдения подтверждают возможность, что специфические болезни могут быть феноменологическим проявлением неправильной регуляции притока липидных бислоев во время аутофагии. Как результат, факторы, модулирующие эти пути станут оптимальными мишенями для лекарств с целью восстановления нормальной доставки мембран и соответственно для прогрессии собственно аутофагии.
Conclusions and future directions
Since the discovery of autophagy, the membrane origin of the autophagosomes has been the subject of intense debate. Recent studies employing advanced technologies have confirmed and extended the pioneering ultrastructural observations and have provided some insights on the membrane origin of these unique vesicles. The diverse conclusions of the recent work, however, have not yet provided an unequivocal answer, but rather have raised new questions that now need to be addressed. The work on this topic has only just begun.
This article is adapted from a review in F1000 Biology Reports, DOI:10.3410/B3-25.
Сайт создан в системе
uCoz
Maria and Peter HOey 
Infographic: How Autophagy Works
View full size JPG | PDF
Maria and Peter Hoey
Важным для вопроса о происхождении аутофагосом является источник липидов, необходимых для построения пузырьков с двойной мембраной, и способа их доставки. Одним из основных затруднений в этом вопросе является то, что аутофагосомы не содержат маркерных белков, которые бы определенным образом связывали их с известными субклеточными органеллами, это затрудняет определение их источника. В самом деле, аутофагосомы отличаются от всех др. органелл в клетке как по структуре, так и составу белков. Недавние успехи в микроскопической технике и биохимических подходах стимулировали серию исследований по этому вопросу, но резуьтаты оказались противоречивыми, по крайней мере, на первый взгляд, при этом разные группы идентифицировали доказательства вкладов из плазматической мембраны клетки, эндоплазматического ретикулума, митохондрий и комплекса Гольджи. Из каких из этих органелл происходят аутофагосомы или участвуют они все? Ответ на этот вопрос является обязательным для понимания и манипулирования механизмом аутофагии. В свою очередь, это знание важно для разработки тераии и лекарств, которые были нацелены на этот путь, чтобы воздействовать или даже излечивать болезнь, при которой аутофагия нарушена или блокирована.