Белки являются важными строительными блоками живых систем. Они участвуют во всех биологических функциях, играя структурную и/или регуляторную роль. В большинстве случаев белки должны адаптивными, т.е. изменять свою структуру и функцию в определенных клеточных условиях. Примером такой адптации может служить усиление и снижение их активности, которые происходят во многих случаях благадоря взаимдействиям с др. белками и/или регуляторными молекулами. Конформационая эластичность белков важна для их адаптивных свойств. Во многих случаях детали взаимоотношений между различными конформационными состояниями и функциями белков хорошо установлены. В некоторых случаях характеристика связи между структурными переходами и мдификациями биологической функции неполная.
Интерес к актину чрезвычайно возрос с его открытия Straub [ 1942]. В своей пионерской работе Straub et al. экстагировали актин из мышечной ткани, где актин составляет главную составную часть тонких филамент и участвует в мышечных сокращениях в качестве рабочего партнера толстых филамент, образуемых миозином [Bagshaw, 1992; Geeves and Holmes, 2005]. Помимо своей функции в мышцах актин также составляет существенную составную часть цитоскелета различных типов клеток [Sheterline et al., 1995] наряду с микротрубочками и промежуточными филаментами [Wilson, 1982; Howard and Hyman, 2003; Oshima, 2007]. актиновый цитоскелет или система микрофиламент выполняет удивительно разнообразные роли в поддержани разнообразных процессов, таких как становление и поддержание клеточной полярности, изменения формы подвижных клеток, клеточная подвижность, адгезия, цитокинез, эндоцитоз и внутриклеточный перенос [Pollard and Cooper, 2009].
После некоторых дебатов об актине как внутриядерной единице [Lane, 1969] актин был также признан, как важный функциональный и структурный компонент ядра клеток [Rando et al., 2000; Pederson and Aebi, 2002; Pederson and Aebi, 2005; McDonald et al., 2006; Schleicher and Jockusch, 2008]. В ядре актин участвуетв транскрипции [Pederson and Aebi, 2005; Miralles and Visa, 2006; Percipalle and Visa, 2006], в ремоделировании хроматина [Rando et al., 2000] ,а также в сигнальной трансдукции [Vartiainen et al., 2007].
Актин не ограничивается метазоа, обнаруживается также у растений. С момента открытия актомиозинового комплекса у растений [Vorobeva and Poglazov, 1963] функция растительного актина была продемонстрирована во внутриклеточных перемещениях органелл и пузырьков [Takagi, 2003], экзл- и эндоцитозе и в клеточном цикле растений [Wick, 1991; Kost et al., 2002]. Недавне открытие гомологов бактериального актина, ParM и MreB [Jones et al., 2001; van den Ent et al., 2001], подтвердило присутствие прокариотического актинового цитоскелета, которые обеспечивает процессы, такие как сегрегация плазмид [Jensen and Gerdes, 1999; van den Ent et al., 2002] и регуляция клеточной формы [Doi et al., 1988; Jones et al., 2001; Lee and Stewart, 2003].
Актин обладает обширным репертуаром взаимодействующих партнеров, включая ионы металлов, нуклеотиды и актин-связывающие белки, которым придают разнообразные функции актину [Sheterline et al., 1995; Lappalainen, 2007]. Некоторые исследования предоставили убедительные доказательства, что мономерные и филаментозные актины обладают разными конформациями в зависимости от связанных молекул и тех конформационных изменений, которые сопричастны к функции актина.
Важно понять как актин может адаптироваться и модифицировать свою конформацию для различных биологических процессов, какие клеточные компоненты эффективны в регуляции этих конформационных переходов и как эти разные структурные состояния связаны со сложными и тонко регулируемыми механизмами, посредством которых актин осуществляет свою многообразную биологическую активность.
Structure of Actin
С момента его открытия в 1942 [Straub, 1942] актин усиленно изучался. Простая и быстрая очистка актина [Spudich and Watt, 1971] после превращения ацетоном в порошок мышечной ткани была известна задолго до этого [Feuer et al., 1948]. Эти методы, которые сделали возможным получение актина в больших количествах и ускорило исследование биологических функций мышечного актина. Протоколы приготовления актина из немышечных источников также ищвестны [Schafer et al., 1998; Joel et al., 2004]. Большинство результатов касается хорошо охарактеризованного мышечного актина, однако сущестуют данные и по немышечным изоформам актина.
Актин существует как в мономерной (глобулярной или G-actin) или полимерной (филаментозной или F-actin) форме (Fig. 1.). Первая с атомным разрешением 3D структура G-actin в комплексе с DNase I описана в 1990 [Kabsch et al., 1990] (PDB:1ATN). Структура показала, что актиновый мономер имеет форму, подобную кубу с размером примерно 6.7 х 4.0 х 3.4 nm. Мономер может быть подразделен на два основных домена, обозначаемых как внутренний и наружный домены на базе их позиции относительно оси филаменты. Каждый из основных доменов состоит из двух субдоменов (S1–4) (Fig. 1A). Основные домены разделены щелью, содержащей прочно привязанный происходящий из adenosine нуклеотид в комплексе с двухвалентным катионом, который, как полагают, является магнием при физиологическом состоянии актина [Estes et al., 1992](Fig. 1A inset a).
Figure 1. Overview of the structure and conformational dynamics of actin monomer and filament. (A) Crystal structure of the G-actin molecule. Actin subdomains are indicated by different colors and numbers according to Holmes et al (S1) amino acids 1–32, 70–144, 338–375; (S2) amino acids 33–69; (S3) amino acids 145–180, 270–337; (S4) amino acids 181–269 [Holmes et al., 1990]. The amino-, and carboxyl termini of the molecule are indicated by N and C, respectively. Orange-dotted boxes depict enlarged views of the nucleotide binding cleft with bound ATP (a), the structure of the hydrophobic loop (b, amino acids 262–274, rotated by 90° to the right with respect to the main axis of the monomer, shown by gray dashed-dotted line) and the DNase binding loop (c, amino acids 40–48). The schematic representation of the conformational dynamics on the basis of the normal mode analysis of G-actin is shown by blue arrows [Tirion and ben-Avraham, 1993]. The image was made on the basis of the crystal structure of rabbit skeletal muscle actin in complex with DNase I (PDB code 1ATN, [Kabsch et al., 1990]). (B) Helical organization of actin protomers in the filament. A structural model of a 13-mer F-actin was derived from Oda's F-actin protomer model (PDB code 2ZWH, [Oda et al., 2009]). The two linear strands of actin protomers composing the two-start right-handed long pitch helix are colored by dim and dark violet, respectively. The single-start left-handed short pith helix is assembled by alternating dim and dark actin protomers. The schematic representation of the conformational dynamics of F-actin is shown by blue arrows. The ribbon diagrams were obtained with Deep View/Swiss PDB Viewer.
При физиологических ионных условиях актиновые мономеры собираются в филаменты. Полимеризации актина предшествуют кинетически отличающиеся этапы. Это инициируется за счет медленного образования актиновых ядер (димеров/тримеров), которые служат в качестве затравки для последующей элонгации филамент. Во время элонгации бльшинство актиновых мономеров ассоциируют, чтобы затем диссоциировать с любого из двух концов, то приводит к чистому приросту обоих концов филамент. Фаза устойчивого состояния характеризуется динамическим равновесием, когда длина актиновых филамент остается постоянной, т.к. актиновые мономеры постоянно ассоциируют с одним и диссоцируют с др. конца. При таком динамическом равновесии устанавливается стационарная популяция мономеров свободного актина, наз. критической концентрацией, чьи значения лежат между критической концентрацией на колючем и заостренном конце. Помимо структурной полярности, определяемой с помощью расположения актиновых протомеров внутри филаменты, актиновые филаменты также обладают кинетической полярностью, которая определяется с помощью скорости ассоциации и диссоциации разных мономеров на двух концах. Колючий или плюс конец связывает актиновые мономеры быстрее, чем заостренный или минус конец. Хотя активность их ATPase не является критической для полимеризации актина, самосборка актина ассоциирована с ATPase циклом, который подкрепляет процесс конвейерной сборки [Wegner, 1976].
Первая высокого разрешения структурная модель актиновой филаменты с разрешением 8 A предложена [Holmes et al., 1990]. Эта структура была получена путем подгонки атомной структуры G-actin путем простой ротации жесткого тела с экспериментально полученным паттерном дифракции X-ray волокна из ориентированного F-актинового геля. Недавно получена улучшенная модель высокого разрешения F-actin [Oda et al., 2009] с разрешением 3.3 A в радиальном и 5.6 A в экваториальном направлениях. Повторяющиеся, поляризованные расположения актиновых протомеров внутри филамент дают двунитчатую, право-закрученную спираль с half-pitch в 37 nm и one-start левозакрученную генетическую спираль с удлинением 2.75 nm на мономер (Fig. 1B). Толщина филаменты в пределах 7–10 nm. Этот результат предоставляет великобепную основу для последующих исследований путем описания наиболее важных структурных деталей и геометрических свойств актиновых филамент. Однако следует иметь в виду, что эти модели базируются на среднеей массе распределений, наблюдаемых при структурных исследованиях. Физически подлинные конформации существующих актиновых филамент, происходящих из идеальных структурных моделей, обусловлены присутствием врожденных структурных нарушений, встроенных в филаменты [Egelman et al., 1983; Egelman and DeRosier, 1991, 1992].
Methods to Investigate the Conformational Dynamics of Actin
Скорее, чем обладание ригиднымы структурами, и мономерны и филаментозный актин обладают удивительной конформацитонной гибкостью и принимают множество различных структурных состояний в ответ на взаимодействия с их молекулами партнерами [Orlova and Egelman, 1995; Orlova et al., 1995; Schuler, 2001]. Различные конформационные изменения, происходящие в актине, характеризуются различной корреляцией времен, распрделенной на широкой временной шкале (Fig. 2). Соотв. экспериментальные методы, чувствительные к этим различным способам движений в актине, хорошо известны (Fig. 2). Время корреляций на fs шкале отражает перестройки атомов/молекул, и эти структцрные изменения могут быть выявлены с помощью X-ray кристаллографии, ЭМ, cryo-ЭМ и femtobiological подходами [Egelman, 2000; Resch et al., 2002; Sundstrom, 2008]. Времена корреляций ns связаны с изменениями в ограниченных сегментных движениях мономер/протомер или немногих соседних протомеров и могут быть детерминированы с помощью время-зависимой флюоресцентной анизотропии [Ikkai et al., 1979; Miki et al., 1982a, b] или обычного electron paramagnetic resonance (EPR) [Thomas et al., 1979; Mossakowska et al., 1988]. Тозионные скручивания и движения сгибания всей актиновой филаменты, характеризующиеся временами корреляций (correlation times) в диапазонах µs и µs–ms могут быть описаны с помощью анизотропии фосфоресценции [Prochniewicz et al., 1996a; Yoshimura et al., 1984], saturation transfer (ST) EPR [Thomas et al., 1979; Hegyi et al., 1988] и измерений временной абсорбционной анизотропии [Mihashi et al., 1983]. Специфический метод—зависимый от температуры Forster-type resonance energy transfer (FRET)—был описан, чтобы охарактеризовать гибкость белков [Somogyi et al., 1984; Somogyi et al., 2000]. Обусловленные природой метода он чувствителен ко всем типам внутримолекулярных движений, которые изменяют относительное расстояние или относительные флюктуации донорской и акцепторной молекул. Наиболее широко используемые спектроскопические подходы, пригодные для изучения конформационной динамики актина, суммированы на Рис. 3. Ароматические аминокислоты в актине в качестве внутренних зондов или внешние флюоресцентные химические соединения, которые могут быть ковалентно прикреплены к специфическим остаткам актина, могут также сообщать о существовании локальных конформационных изменений внутрибелкового матрикса из мономеров/протомеров. Спектральные свойства флюоресцентных зондов (emission spectra, quantum yield, lifetime, anisotropy) чувствительны к изменениям в их локальном окружении, и предоставляют дальнейшие экспериментальные инструмены для анализа структурных изменений в актине [Lakowicz, 2006].
Figure 2. Summary of the conformational changes in actin. The table shows the corresponding correlation times and the suitable approaches for their investigation.
Figure 3. Summary of the most commonly used spectroscopic approaches to study the conformational dynamics of actin. The formulation and parameters of transient phosphorescence emission anisotropy (TPA), time-dependent fluorescence emission anisotropy and conventional/saturation transfer (ST) EPR. Typical phosphorescence (1. inset)/fluorescence (2. inset) anisotropy decay (r(t)) of actin, and typical EPR (3. inset)/ST-EPR (4. inset) spectra of actin are shown. H is releated to the direction and the strength of the applied magnetic field. In phosphorescence/fluorescence emission anisotropy the kinetics of anisotropy decay, while in EPR/ST-EPR the shape of the spectrum characteristic for the conformational dynamics of the molecule. [Color figure can be viewed in the online issue which is available at wileyonlinelibrary.com.]
Self-Assembly of Actin and its Interactions with Nucleotides and Cations
Основные лиганды, которые соединяются с центральной щелью актиновых мономеров, это аденозиновый нуклеотид и двухвалентные катионы (Fig. 1A inset a) [Sheterline et al., 1995]. Сайт связывания одиночного нуклеотида связывает АТФ с со значительно более сильным сродством (KD = 10-10 M), чем АДФ (KD = 10-8 M) [Neidl and Engel, 1979; Brenner and Korn, 1981]. Сродство одиночного сайта связывания катиона (KD ~10-9 M) , как полагают, занимается магнием в клетках [Estes et al., 1992]. G-actin обладает низкой активностью ATPase (0.6 h-1) [Schuler, 2001], которая усиливается существенно, когда АТФ-связавшие актиновые мономеры включаются в филаменты [Pollard and Weeds 1984; Pantaloni et al., 1985]. В режиме быстрой полимеризации мышечного актина, кинетика сборки актина и гидролиза АТФ становятся быстрее, чем последующее высвобождение γ-phosphate (Pj). Это приводит к появлению АТФ/АДФ-Pj шапочки на колючем конце, тогда как остальная часть филаменты содержит АДФ-связанные актиновые протомеры [Brenner and Korn, 1981; Carlier and Pantaloni, 1986; Carlier et al., 1987; Korn et al., 1987]. Напротив. в сходных условиях дрожжевой актин полимеризуется и высвобождает гидролизованные Pj почти одновременно, это приводит к гомогенным АДФ-связанным актиновым протомерам вдоль всей филаменты [Yao et al., 1999; Yao and Rubenstein, 2001].
Модель Holmes постулирует важность межнитевого гидрофобного затычка-карман (plug-pocket) взаимодействия для целосности филамент [Holmes et al., 1990]. В актиновых мономерах гидрофобная петля из остатков 262–274 (для мышечного актина, Fig. 1A inset b) между S3 и S4 расположена наглухо в parked позиции вблизи основного тела S4. Holmes et al. полагают, что после G-to-F перехода эта петля подвергается конформационному изменению, образуя гидрофибную затычку (266–269). Эта затычка распространяется перпендикулярно к оси филаменты и оказывается заблокированной в гидрофобном кармане, образуемом двумя соседними протомерами актина противоположной нити. Тем самым взаимодействие затычка-карман д. стабилизировать структуру актиновых филамент.
Важность гидрофобных поперечных взимодействий нитей и подвижности петли для интеграции актиновых филамент подтверждается исследованиями дисульфидных поперечных связей. Эти эксперименты показали, что мутантный G-actin—в котором петля заблокирована на остове белка—не может поляризоваться [Shvetsov et al., 2002], и поперечно связывать петлю после образования дестабилизированного F-actin [Orlova et al., 2004]. Флюоресцентные зонды петли подтвердили эту гипотезу [Feng et al., 1997; Musib et al., 2002]. Мутагенные исследования выявили, что снижение гидрофобности петли ведет к чувствительной к холоду полимеризации некомпетентных мутантных актинов, это демонстрирует, что гидрофобность петли важны для формирования филамент [Chen et al., 1993; Kuang and Rubenstein, 1997]. Однако противоречит гипотезе plug-pocket то, что нарушение гидрофобности затычки (plug) путем замещения аминокислот с негативно заряженными остатками оказывает более выраженные эффекты на его C-конце, чем на N-конце [Kuang and Rubenstein, 1997]. N-конец, как полагают, ассоциирует более сильно с карманом посредством гидрофобных взаимодействий в модели Holmes's F-actin. На основании этих результатов акт. предположили, что гидрофоная затычка может испытывать динамические флюктуации и принимать различные конформационные состояния скорее, чем быть плотно заблокированной в кармане [Tirion et al., 1995]. Дальнейший анализ динамики петли с перекрестным связыванием и EPR спектроскопией показал, что петля, в самом деле, высоко мобильна и в G- и в F-actin [Shvetsov et al., 2006]. Межспиновое расстояние было сходным в G- и F-actin, но распределение было более широким в F-actin по сравнению с G-actin, это указывает на то, что петля оккупирует преимущественно parked, менее обширную позицию, чем было предположено моделью Holmes (даже в F-actin) и её динамика коррелирует с переходом от G- к F-актину [Scoville et al., 2006; Shvetsov et al., 2006]. Менее распространенная позиция петли в F-actin согласуется с улучшенной моделью F-actin, которая предсказывает меньший диаметр филамент (с радиусом gyration of 23.7 A) по сравнению с радиусом круговращетельного движения в модели Holmes в 25 A [Oda et al., 2009]. Такой более узкий пробел между нитями не нуждается, чтобы гидрофобная затычка сильно изменяла свою конформацию после G-to-F перехода.
Влияние разных нуклеотидов на конформационную дирнамику актиновых филамент впервые было продемонстрировано путем аналиха ЭМ изображений негативно окрашенных актиновых филамент и с помощью измерений динамики эластичности и вязкости растворов F-actin. Эти измерения подтвердили, что филаменты, формируемые из АТФ-актин мономеров, более ригидны, чем актиновые филаменты, собираемые из АДФ-актиновых мономеров [Janmey et al., 1990]. Базируясь на этих результатах, было предположено, что энегрия, высвобождаемая после гидролиза АТФ, связана с конформационной динамикой изменений и стабилизаций структуры F-actin [Janmey et al., 1990]. Хотя эта находка позднее оспаривалась [Pollard et al., 1992; Newman et al., 1993], некоторые последующие анализы подтвердили зависимые от нуклеотида конформационные изменения актина. Измерения устойчивости состояний фосфоресценции показали, что актиновые филаменты, полимеризуемые из Mg2+-АДФ актиновых мономеров, обладают более низким устойчивым состоянием анизоттропии флюоресцентной эмиссии, и, следовательно, большей торсионной гибкостью. чем филаменты, полимеризующиеся из Mg2+-ATP актиновых мономеров [Rebello and Ludescher, 1998]. Температуро зависимые FRET измерения выявили индуцированные нуклеотидом локальные конформационные изменения вокруг Cys374 в S1 имеют существенно более значительную межмономерную гибкость филамент, собранных из АДФ-актиновых мономеров, чем собранных из АТФ-актиновых мономеров. Эти данные предполагают, что более тонкие соединения между протомерами формируются, когда филаменты полимеризуются из АДФ-связанных мономеров [Nyitrai et al., 2000]. Соответственно, differential scanning calorimetry (DSC) измерения также подтвердили более стабильную структуру актиновых филамент, собранных из АТФ-связанных актиновых мономеров благодаря их более высокой термальной стабильности [Orban et al., 2006].
Детальный анализ с помощью световой микроскопии термальных флюктуаций флюоресцентно меченного F-actin показал, что отсутствуют разичия в персистенции длины актиновых филамент, собранных или из АТФ-actin или АДФ-actin мономеров (Lp = 9 µm), это указывает на сходную гибкость при изгибаниях [Isambert et al., 1995]. Добавление BeF3—который мимикрирует γ-phosphate [Combeau and Carlier, 1988]—к F-АДФ-actin, чтобы восстановить состояние F-АДФ-Pj приводит к более высокой жесткости на изгиб F-АДФ-Pj-actin (Lp = 13.5µm) по сравнению с F-АТФ, или -АДФ-actin [Isambert et al., 1995]. Хотя эти наблюдения установили существование конформационных изменений, связанных со сборкой и ATPase активностью актина, точная природа и последовательность этих структурных перестроек пока не установлены.
ATPase активность, как полагают, связана движениями доменов в актине [Belmont et al., 1999]. Сравнение кристаллической струкутры β-actin мономеров с и без связанного profilin [Schutt et al., 1993; Chik et al., 1996] показало. что щель, связывающая нуклеотид в G-actin может принимать ‘открытую’ или ‘закрытую’ конформацию. Во время перехода от закрытой к открытой конформации междоменовая щель открывается до 10°. После того как закрытые и открытые структуры мономерного актина были использованы для ЭМ реконструкций актиновых филамент [Belmont et al., 1999], сходства с др. NTPases (for review see [Geeves and Holmes, 1999; Sablin and Fletterick, 2001] и со свободной от нуклеотида структурой Arp3 (Actin-related protein) субъединицы Arp2/3 комплекса [Robinson et al., 2001] подтвердили, что структурные перходы от закрытого к открытому состоянию связаны с гидролизом нукелеотида.
Соответственно, FRET измерения показали, что замещение АТФ на АДФ в щели, связывающей нуклеотид, приводили к конформационным изменениям, которые сводили Gln41 и Cys374 ближе др. к др. [Gaszner et al., 1999]. Эксперименты по гашению флюоресценции выявили изменения внутри протомеров, происходящие в S1 в ответ на переход G-to-F-актину, которые изменяли распределение зарядов вокруг, по крайней мере, одного из 4-х триптофанов (Trp79, Trp86, Trp340, Trp356 в S1) [Hild et al., 1996]. Напротив, более недавние кристаллические структуры нескомплесованного G-actin (мутантных и химически модифицированных актиновых мономеров) непосредственно показали, что щель, связывающая нуклеотид закрыта как в АДФ- [Otterbein et al., 2001], так и АТФ состоянии (воспроизводится с использованием AMPPNP) [Graceffa and Dominguez, 2003; Rould et al., 2006]. В подтверждение этому, недавно уточненная модель F-actin показала закрытой щель, связывания нуклеотида в филаменте и выявила уплощение молекулы актина после включения в филаменты, обусловленное 20° ротацией двух основных доменов [Oda et al., 2009]. Эти структурные перестройки приближают Gln137 близко к γ-phosphate связанного АТФ. Т.к. Gln137 участвует в ATPase механизме, то эти структурные перестройки могут быть связаны с регуляцией ATPase активности актина [Oda et al., 2009]. Для получения высокого разрешения структуры F-actin Oda et al. использоали gelsolin на шапочке актиновых филамент [Oda et al., 2009], это выявило индукцию большого диапазона аллостерических конформационных изменений в F-actin [Orlova and Egelman, 1995; Prochniewicz et al., 1996b; Khaitlina and Hinssen, 1997)].
Самосборка актина и ATPase активность, как было установлено, изменяют конформацию DNase I связывающей петли (или D-петли) (Fig. 1A inset c) в S2 путем индукции перехода от флексибельной петли к α-helical структуре [Otterbein et al., 2001; Graceffa and Dominguez, 2003]. Это наблюдение привело к предположению, что спиральная конформация представляет АДФ-состояние актиновых протомеров, доказанность этого поставлена под сомнение [Rould et al., 2006; Oda et al., 2009]. Сравнительные структурные исследования между BeF3-F-actin и ADP-F-actin показали, что структура S2 более беспорядочна в АДФ-состоянии, это приводит к разрыву одной из продольных связей и дестабилизации филамент [Orlova and Egelman, 1993].
Прочно привязанные катионы могут модифицировать конформационное состяние актина также. Как торсионная, так изгибающая гибкость Mg2+-F-actin, как было установлено, очень сильно похожа на Ca2+-actin филменты при использовании спектроскопии и ЭМ подходов [Orlova and Egelman, 1993; Rebello and Ludescher, 1998]. Так, измерения гибкости одиночных актиновых филамент с использованием оптических пинцетов не выявило достоверной зависимости от катионов жесткости на изгиб актиновых филамент[Tsuda et al., 1996; Yasuda et al., 1996]. При измерениях с помощью
флюоресцентной спектроскопии гибкости актиновых филамент [Hild et al., 1998] , гибкость внутри- и межпротомерная оказалась выше в случае Ca2+-F-actin , чем Mg2+-F-actin [Nyitrai et al., 1999]. Кажущийся конфликт между этими результатами может быть объяснен, учитывая, что разные подходы были использоаны для исследованиядинамических свойств актиновых филамент и эти метобды были чувствительны к разным конформационным переходам и способам движения акиновых филамент.
Измерения температуро-зависимого FRET не выявили различий между гибкостью наружного домена (S1 и S2) у Ca2+-G-actin и Mg2+-G-actin в пределах 6–26 °C, тогда как выше 26 °C конформационный переход обнаруживался в Ca2+-актиновых мономерах [Nyitrai et al., 1998]. Это было также подтверждено с помощью флюоресцентной микроскопии и EPR измерений, что C-терминальная часть мономера становится более ригидной, когда связанный кальций замещается магнием [Nyitrai et al., 1997]. Эффекты катионов испытывают сильное влияние со стороны средового pH [Hild et al., 2002], это может вызывать внутриклеточные изменения при физиологических (e.g., fatigue) и патологических (e.g., ischemia) состояниях [Mohabir et al., 1991; Thompson et al., 1992]. Гибкость между протомерами Mg2+-F-актина была обнаружена более низкой, чем таковая у Ca2+-F-actin в диапазоне между pH 6.5 и pH 7.4 [Hild et al., 2002], тогда как таковые pH не вызывали различий в случае Ca2+-F-actin. Содединения между протомерами были более ригидными как при pH 6.5 , так и 7.4 у Mg2+-F-actin, чем у Ca2+-F-actin [Hild et al., 2002].
Сохранность длины Mg2+-актиновых филамент оставалась незатронутой (Lp ~8 µm), когда филаменты были полимеризованы при разных pH значениях (между pH 5 и 9) [Arii and Hatori, 2008]. Напротив, сохранность длины Ca2+-F-actin возрастала ~4.5 µm до ~ 9 µm ? когда pH увеличивался с 5 до 9, указывая тем самым на более высокую подвижность актиновых протомеров внутри Ca2+-F-actin при более низких значениях pH [Arii and Hatori, 2008]. Скорость скольжения актиновых филамент по тяжелому meromyosin была более медленной как у Ca2+-actin, так и Mg2+-actin филамент, когда снижался pH [Kron and Spudich, 1986; Arii and Hatori, 2008]. В экспериментах с миофибриллами было показано, что при изометрических условиях ATPase активность миофибрилл не зависимт от pH в диапазоне 6.5–8.0, тогда как изометрическое натяжение сдвигается слегка к более высоким значениям по мере увеличения pH [Potma et al., 1994]. Это наблюдение и корреляция между скоростью скольжения и сохранностью длины актиновых филамент указывают на то, что собственно функционирование аппарата скольжения тесно связано с гибкостью его компонентов во время мышечного сокращения [Arii and Hatori, 2008].
Полимеризация актиновых филамент ускоряется и спиральные pitch между протомерами увеличиваются при снижении pH [Zimmerle and Frieden, 1988; Wang et al., 1989; Oda et al., 2001]. pH может также изменять свойства атиновых мономеров. Было установлено, что связывание кальция с сайтом связывания высокого сродства становится более напряженным, когда pH снижается с 8 до 6 [Zimmerle and Frieden, 1988].
Наблюдения описанные выше, демонстрируют, что малые лиганды—такие как нуклеотиды и катионы—а также внешние условия—такие как pH—модифицируют конформацию актина. Несмотря на огромное количество накопленных данных биологическя функция этих структурных модификаций остается до некоторой степени неоднозначной. Некоторые наблюдения указывают, что гидролиз АТФ изменяет термодинамику и механические свойства актиновых филамент и их взаимодействия с актин-связывающими белками. Эти результаты привели к гипотезе, что гидролиз АТФ может служить в качестве биологических часов в живых клетках. Созревание филамент ощущается и отражается изменениями в нуклеотидном состоянии и тем самым в конформации актиновых филамент [Allen et al., 1996]. Т.к. конвейерная сборка рассматривается в качестве движущей силы в полимеризации актина управляемого биологического процесса, то кажетчя логичным предпоолжение, что гидролиз АТФ является критическим для этих сил, генерирующих механизмы благодаря его роли в контроле конвейерной сборки [Bugyi and Carlier, 2010]. Принимая во внимание, что зависимые от нуклеотида конформационные различия проявляются в основном на уровне более мелких структурных изменений в F-actin, очень возможно, что они играют важные роли в становлении, базирующейся на связанных нуклеотидах, избирательности молекулярных взаимодействий с партнерами по связыванию актина.
Cooperativity and Allosteric Interactions in Actin Filaments
Во многих случаях, когда конформация актиновых филамент изменяется в ответ на связывание лиганда, эффекты распространяются вдоль филамент посредством взаимодействия соседних актиновых протомеро, т.e., посредством дальнодействующих аллостерических взаимодействий. Такие аллостерические взаимодействия были описаны в основном для многих актин-связывающих соединений [Oosawa, 1972; Miki et al., 1982a; Drewes and Faulstich, 1993; Prochniewicz et al., 1993; Muhlrad et al., 1994; Orlova et al., 1995; Selden et al., 1998; Steinmetz et al., 1998; Moraczewska, 2002] и часто называются кооперативностью в специальном случае актина. Необходимо отметить, что в этом контексте смысл кооперативности отклоняется от классического, он означает молекулярный механизм, с помощью которого индуцированные лигандом конформационные изменения распространяются вдоль филамент и проявляются в актиновых протомерах, удаленных от места связывания лигнада. За исключением немногих примеров—подбных мышеяной регуляции [Butters et al., 1993]—биологическая функция, приписываемая кооперативности в актине, остается неопределенной. Возможная функция этих взаимодействий д. быть связана с регуляторной ролью конформационной динамики актиновых филамент, которая контролируется и тонко настраивается актин-связывающими белками. В больинстве случаев собственно регуляция нуждается в конформационных изменениях, чтобы распространяться вдоль всей длины актиновых филамент. Благодаря кооперативным аллостерическим взаимодействиям, такие крупномасштабные конформационные изменения не нуждаются в насыщении мест связывания актин-связывающими белками, это служит экономичности функционирования клеток благодаря более низким концентрациям внутриклеточных актин-связывающих белков, оказывающихся эффективными по этой причине.
Несколько актин-связывающих природных продуктов обладают цитотоксической активностью кооперативно [Wieland and Faulstich, 1978; Schiavo and van der Goot, 2001; Allingham et al., 2006]. Хотя они имеют явно минимальное физиологическое значени, обусловленное их ядовитым эффектом, механизмы, с помощью которых они взаимодействуют с актином могут служить в качестве двольно простой модельной системы для описания связывания др. физиологически важных соединений. Phalloidin, циклический гексапептид из ядовитого гриба Amanita phalloides, наиболее охарактеризован. Phalloidin прочно соединяется с актиновыми филаментами, снижая скорость высвобождения Pj [Dancker and Hess, 1990] и блокируя диссоциацию мономеров с концов филамент [Dancker et al., 1975; Estes et al., 1981], это дает более стабильную структуру F-actin [Faulstich et al., 1977; Miyamoto et al., 1986; Isambert et al., 1995]. Поскольку сайт связывания phalloidin участвует в интерфейсе трех соседних протомеров между двумя long-pitch спиралями F-актина [Lorenz et al., 1993; Oda et al., 2005], он может усиливать силу контактов протомеров между нитями путем сшивания протомеров. Кооперативная природа связывания phalloidin с актином была предположена, когда эксперименты показали, что субстоихометрические количества phalloidin восстанавливают повышенную устойчивую ATPase активность, индуцируемую с помощью укорочений C-конца с помощью ограниченного trypsinolysis [Drewes and Faulstich, 1993]. Далее было подтверждено с помощью структурных [Orlova et al., 1995] и спектроскопичестких исследований [Nyitrai et al., 2000; Visegrady et al., 2004; Visegrady et al., 2005]. Сайт-направленные spin-labelled EPR измерения показали, что связывание phalloidin вызывает увеличение количества взаимодействующих зондов вдоль интерфейса между нитями между остатками гидрофобной петли и C-концами протомеров, это указывает на более сильные контакты между двумя продольными шагами (long-pitch) спирали в декорированных с помощью phalloidin актиновых филамент [Scoville et al., 2009]. Зато, phalloidin не вызывает локальных изменений конформационной динамики белкового матрикса вокруг гидрофобной петли, D-петли и C-терминальных остатков [Scoville et al., 2009]. Колличественное описание phalloidin индуцированных коперативных изменений показывает, что связывание одной молекуля лекарства изменяет конформацию 7 протомеров актина [Visegrady et al., 2005]. Интересно, что DSC анализ показал, что эффект стабилизации phalloidin не является кооперативным в случае F-ADP-Pj-actin (воспроизводимого BeF3-ADP или AlF4-ADP аналогами нуклеотидов), это указывает на различия взаимодействий между протомерами в F-actin в ADP-Pj состоянии по сравнению с АТФ- или АДФ состоянием [Orban et al., 2008a]. Эффект стабилизации филамент с помощью phalloidin активно используется в in vitro исследованиях, где концентрации актина д.быть низкими, близкими или ниже критической концентрации для сборки актина [Kurzawa and Geeves, 1996]. Флюоресцентные производные phalloidin также используются для визуализацииархитектуры актиновго цитоскелета при флюоресцентногй микроскопии при внутриклеточных исследованиях [Small et al., 1999].
Др. циклический пептид, jasplakinolide—который может быть обнаружен у морской губки (Jaspis johnstoni)—также соединяется с актиновыми филаментами конкурентно с phalloidin [Bubb et al., 1994]. Jasplakinolide ускоряет полимеризацию актина [Bubb et al., 1994], способствует полимеризации актина в условиях, не вызывающих полимеризацию, и снижает критическую концентрацию актина для сборки in vitro [Bubb et al., 2000]. Хотя phalloidin может стабилизировать актиновые олигомеры, сходный эффект не наблюдается для jasplakinolide [Spector et al., 1999]. Др. важным отличием между двумя лекарствами является то, что в противоположность phalloidin, jasplakinolide легко проникает в клетки млекопитающих [Spector et al., 1999].
Помимо этих примеров многие др. ядовитые химикалии (такие. как, напр., jararhagin) [Costa and Santos, 2004; Fenteany and Zhu, 2003] и бактериальные токсины (такие как clostridial бинарные токсины (Iota и C2 семейства) из Clostridium difficile, Clostridium sordellii и Clostridium novyi, цитотоксический некротический фактор из Escherichia coli, enterotoxin из Bacteroides fragilis, Staphylococcus aureus alpha-toxin, Shiga токсин, cytotoxic necrotizing factor type 1, Escherichia coli стабильный к нагреванию токсин, botulinum и tetanus нейротоксины и S. aureus toxic-shock syndrome токсин) могут изменять регуляцию цитоскелета и/или связывать непосредственно актин [Richard et al., 1999; Schmitt et al., 1999]. Хотя они значатительно менее охарактеризованы. чем phalloidin, имеется перспектива, что в результате дальнейших исследованиий использование этих соединений приведет к новым медицинским подходам, использующими актин в качестве терапевтической мишени [Giganti and Friederich, 2003].
Actin Isoforms
Настройка конформации и тем самым клеточной функции актина может быть достигнуто с помощью различных изоформ актина, которые сосуществуют в живых клетках. Actin экспрессируется в виде разнообразных изофром, генерируемых генными дупликациями. Дрожжи имеют 1 ген актина [Gallwitz and Seidel, 1980], тогда как D. discoideum имеет 17 [Romans and Firtel, 1985], D. melanogaster и млекопитающих имют 6 генов [Fyrberg et al., 1981; Vandekerckhove and Weber, 1978]. Геном человека содержит 4 мышечных (скелетный: ACTA1, гдадкий: ACTA2, энтеричный: ACTG2, кардиальный: ACTC) и два цитоплазматических (ACTB и ACTG1) генов актина [Sparrow and Laing, 2008], которые кодируют 6 изоформ. Изоформы актина могут быть обнаружены в разных количествах в разных типах клеток [Sheterline et al., 1995]. ; актиновые изоформы специфичные для мышц α: skeletal, cardiac, smooth, γ2: smooth) и участвуют в аппарате сокращений. Др. две актиновые изоформы (β и γ1) структурно и функционально связаны с цитоскелетом не мышечных клеток [Chaponnier and Gabbiani, 2004]. Актиновые изоформы отличаются лишь немногими аминокислотами и обладают базовыми прирожденными структурными и биохимическими характеристиками, включая стпособность собирать спиральные филаменты из мономеров, ATPase активность и зависимую от нуклеотида динамику. Однако некоторые свойства отличаются лишь количественно [Rubenstein, 1990; Herman, 1993].
Доступный структурный анализ кроличьих мышечных, S. cerevisiae и D. discoideum актиновых филамент, базирующийся на реконструкции 3D спирали из ЭМ изображений, показал, что эти актиновые филаменты сходные в терминах общей трехмерной морфологии, это подтверждает, что эти параметры законсервированы ходе эволюции [Orlova et al., 1997; Steinmetz et al., 2000]. Однако тщательный просмотр выявляет важные различия. Детальный анлиз показал, что менее пространные меж- и внутринитевые контакты формируются в актиновых филаментах S. cerevisiae, чем в мышечном актине [Orlova and Egelman, 1995; Orlova et al., 1997]. Щель, связывающая нуклеотид, более открыта в S. cerevisiae актиновых протомерах, чем в мышечном актине [Orlova et al., 1997], это согласуется с более быстрым обменом нуклеотидов в дрожжевом актине [Miller et al., 1995]. Эти структурные различия сопровождаются измененными механическими свойствами. Детальный сравнительный анализ динамики на микросекундной временной шкале мышечных и S. cerevisiae актиновых филамент с помощью время-зависимых измерений распада фосфоресцентной анизотропии показал более высокую торзионную гибкость для дрожжевого F-actin по сравнению с мышечным F-actin [Prochniewicz and Thomas, 1999]. Эти результаты, как полагают, объясняют, почему актиновыефиламенты дрожжей более чувствительны к фрагментации [De La Cruz and Pollard, 1996]. Эксперименты с обменом вдорода-дейтерий для дрожжевого G-actin по сравнению с мышечным актином на колючем конце в области S1 и S2 и в областях контакта между протомерами внутри актиновых филамент [Stokasimov and Rubenstein, 2009]. Высокая степень кооперативности и существование дальнодействующих аллостерических взаимодействий, наблюдаемых в мышечных актиновых филаментах, существуют и в S. cerevisiae F-актине [Orlova et al., 1997]. D. discoideum F-actin в Ca2+-связанной форме обладает менее выраженными контактами между нитями двух длинных шагов спирали, чем мышечный актин, в то же время эти контакты более массивны в D. discoideum F-актине в его физиологической Mg2+-связанной форме [Steinmetz et al., 2000]. Персистенция длины D. discoideum Mg2+-F-актина более длительна (Lp = 4.2 µm)? чем у D. discoideum Ca2+-F-актина (Lp = 1.6 µm) или мышечного Mg2+-F-актина (Lp = 2.3 µm). Следовательно, усиленная связь между нитями, по-видимому, составляет структурную основу для изменения гибкости к изгибам актиновых филамент.
Мышце-специфические α-скелетная и α?-кардиальная изоформы актина отличаются тольк 4 аминокислотами [Vandekerckhove and Weber, 1979; Vandekerckhove et al., 1986]. Несмотря на эти относительно небольшие различия стабильность филамент отличается существенно. Калорометрические (DSC) измерения выявили, что мышце-специфические α-кардиальные Mg 2+-актиновые филаменты были термодинамически более стабильными, чем α-скелетные Mg 2+ актиновые филаменты. Зато, α-кардиальные Mg 2+-актиновые филаменты более стабильны, чем α-кардиальные Ca 2+-актиновые филаменты [Orban et al., 2005]. Стабильность этих изоформ также зависит от состояния нуклеотида актина. α-кардиальные актиновые филаменты полимеризуются из ADP-G-актина, которые термодинамически менее стабильны, чем филаменты из α-скелетного F-актина, в то время как такие различия не обнаружены в филаментах, полимеризованных из АТФ-актиновых мономеров [Orban et al., 2005, 2008b]. Конформационная динамика мышце-специфических актинов также чувствительна к pH. Снижение pH приводит к более стабильному белковому матриксу, независимо от прочности связи катиона. Было также предположено, что α-кардиальный актин более чувствителен к pH, чем α-скелетный актин [Papp et al., 2005].
Actin-Binding Proteins
Помимо малыхъ лигандов и пептидов, описанных выше, актин взаимодействует с большим количеством белков партнеров.Эти белки могут изменять конформацию актина, регулируя тем самым биологичесике функции. Хотя связь между этими структурно-функциональными изменениями до конца не понята, имеются указания, что актин-связывающие белки вызывают структурные модифкации, которым соответствуют определенные биологические функции.
Myosins
Миозины взаимодействуют с актином. В качестве классического примера, миозины играют специальную и центральную роль в осуществении мышечных сокращений [Geeves et al., 2005; Geeves and Holmes, 2005]. Мышце-специфические миозины являются членами миозинов класса II сверхсемейства миозинов. Др. члены этого класса и все др. семейства миозинов огромного сверхсемейства миозинов (18 , как известно, [Thompson and Langford, 2002]) проявляют свои биологические эффекты в немышечных клетках. Показано, что как мышечные, так и немышечные миозины меняют конформацию актиновых филамент после своего присоединения, а вызыванные миозинами эффекты зависят от приложенных экспериментальных условий, а также от изоформы миозинов. Зависимая от времени анизотропия показывает, что в отсутствие нуклеотидов (under rigor conditions) присоединение миозинового subfragment-1 кооперативно изменяет структуру актиновых филамент [Prochniewicz and Thomas, 1997]. Анализ электронных микрофотографий акти-миозиновых комплексов выявил, что кооперативность от присоединения миозина зависит от природы связанного катиона, а также от того, одноголовый или двуголовый миозиновый фрагмент соединяется с F-актином [Orlova and Egelman, 1997]. Связанный с кальцием актин, взаимодействуя с двумя головками мышечного heavy meromyosin (HMM) обнаруживает кооперативное поведение в отсутствие нуклеотидов, но с одной головкой миозинового subframent-1 не обнаруживает. Ни один из двух фрагментов не связывается кооперативно с Mg2+-F-актином [Orlova and Egelman, 1997]. Спектроскопические методы показали, что степень вызываемых миозином конформационных изменений в актине зависит от нуклеотидного состояния миозина. В состоянии слабого связывания (когда АТФ или АДФ-Pj связан с миозином) присоединение миозинового subframent-1 не является кооперативным и сопровождается очень небольшими изменениями в microsecond ротационной динамике F-актина скорее, чем в rigor состоянии [Prochniewicz et al., 2004]. Эти находки указывают на то, что переходы от слабых к сильным—важная ступень мышечного сокращения—сопровождаются конформационными переходами и в актиновых филаментах.
Недавнее исследование выявило доказательства, что эффект миозина на конформацию актина зависит от изоформы миозина также [Prochniewicz et al., 2009a]. Эксперименты по временному распаду фосфоресцентной анизотропии показали, что как с одной головкой мышечный миозиновый subfragment-1, так и немышечный миозин V меняют конформацию F-актина посредством дальнодействующих аллостерических взаимодействий. Однако мышечный миозиновый subfragment-1 снижает скорость внутрифиламентных торсионных движений, немышечная изоформа оказывает противоположный эффект. Детальный анализ выявил, что длина коопаративной единицы характеризуют расстояние, на котрое распространяется аллостерический эффект связывания миозина, оно было длиннее для немышечного миозина (6 актиновых протомеров), чем для мышечного миозиновго subfragment-1 (2 протомера) [Prochniewicz et al., 2009a].
Хорошо установлено, что специализированные формы миозинов играют важные роли во многих биологических функциях путем синергичных взаимодействий с актином. Однако информация относительно конформационных эффектов миозинов на структурные и динамические свойства актиновых филамент ограничена, необходимы дальнейшие исследования.
Thymosin-?4
Thymosin-?4 (T?4) небольшой (5kDa) WH2-домен (Wiskott-Aldrich syndrome protein-homology 2) содержащий белок. Он секвестрирует актиновые мономеры путем образования 1:1 неспособных к полимеризации комплексов, которые не участвуют в сборке актина на любом из концов филамент [Cassimeris et al., 1992]. T?4 преимущественно соединяется с Mg2+-АТФ актиновыми мономерами зависимым от нуклеотида способом (KD(Mg-ATP) = 2 µM, KD(Mg-ADP) = 80 µM) [(Safer et al., 1991; Carlier et al., 1993)]. При высоких концентрациях (200–300 µM) он может химически перекрестно соединяться с F-актином [Carlier et al., 1996; Ballweber et al., 2002]. T?4 сильно ингибирует диссоциацию нуклеотида, если связан с АТФ-G-актином [Goldschmidt-Clermont et al., 1992].
Обширный спектроскопический и биохимический анализ показал, что Tβ4-связывание сопровождается существенными изменениями в конформации актиновых мономеров [De La Cruz et al., 2000; Dedova et al., 2006]. Измерения замен на тритий показали, что Tβ4 снижает количество amide водрод, которые может быть замещен на тритий в Mg 2+-АТФ-G-актине с промежуточными скоростями (100–400 s), это указывает на то, что конформационная динамика G-актина ограничивается после присоединения T?4 [De La Cruz et al., 2000]. Tβ4-связывание существенно влияет как на Trp, так и Tyr полосу вблизи UV CD спектра Mg 2+-АТФ-G-актина [De La Cruz et al., 2000]. Расположение некоторых Tyr остатков вокруг нуклеотид связывающей щели ведет к предпложению, что щель связывания нуклеотида уже в T?4-G-актин комплексе. В подтверждение этого измерения FRET показали. что Tβ4-связывание снижает расстояние между зондами, прикрепившимся к Lys61 (S2) и Cys374 (S1) и к Lys61 (S2) и ε-АТФ, в то же время увеличивается расстояние между Gln41 (S2) и Cys374 (S1). Это указывает на то, что Tβ4 ротирует D-петлю в направлении связанного нуклеотида прочь от S1 окаймляющего щель связывания нуклеотида [Dedova et al., 2006]. Эти структурные перестройки, индуцированные с помощью Tβ4 могут отражать избирательное связывание АТФ-связанной формы мономерного актина и его ингибирующий эффект на обмен нуклеотида в G-актине.
Profilin
Profilin является важным блком. связфвающим актин, который играет важную роль в контроле динамики актина и в базирующихся на актине процессах движения. Структура различных изоформ profilin в комплексе с изоформами актина, была получена с помощью X-ray кристаллографии [Schutt et al., 1993; Chik et al., 1996; Baek et al., 2008]. Profilin преимущественно соединяется с АТФ-связанной формой G-актина (KD = 0.1 - 1 µM [Pantaloni and Carlier, 1993; Perelroizen et al., 1995; Eads et al., 1998; Lu and Pollard, 2001] , формируя контакты с колючей стороной актиновых мономеров в основании S1 и S3. Такая структурная перестройка предупреждает ассоциацию комплекса profilin-actin с заостренным концом филаменты, но делает возможной исключительную сборку на колючем конце [Pollard and Cooper, 1984; Kaiser et al., 1986; Pring et al., 1992]. Profilin также каталитически ускоряет обмен связанного нуклеотида в G-актине приблизительно в 1000 раз [Mockrin and Korn, 1980; Nishida, 1985; Goldschmidt-Clermont et al., 1992; Vinson et al., 1998].
Высокого разрешения кристаллическая структура комплекса profilin-actin показывает связывание profilin с G-актином, вызывающее ротацию двух основных доменов на 4.7° относительно др. дрд ‘clamp’-подбным способом, охватывая profilin и открывая щель связывания нуклеотида [Schutt et al., 1993; Ferron et al., 2007; Baek et al., 2008]. Разные конформационные состояния щели, связывающей нуклеотид, в комплексе profilin-actin подтверждаются также экспериментами по флюоресцентному гашению, которые обнаружили повышенную доступность флюоресцентного ε-ATP в присутствии profilin [Kardos et al., 2009]. Более открытый белковй матрикс вокруг АТФ-связывающего кармана в комплексе profilin-actin может объяснить активность profilin по замещению нуклеотида.
ADF/Cofilin
ADF/cofilin (actin-depolymerising-factor) (AC) семейство белков может быть сгруппировано в пять функционально различных класса актин-связывающих белков (ADF/cofilin, twinfilin, Abp1/drebrin, coactosin и glia maturation factor) , которые характеризуются присутствием ADF homology (ADF-H) актин-связывающего модуля [Lappalainen et al., 1998]. AC белки широко экспрессируются у эукариотических организмов и связаны с регуляцией динамики актина [de Hostos et al., 1993; Goode et al., 1998; Lappalainen et al., 1998; Wahlstrom et al., 2001; Quintero-Monzon et al., 2005; Helfer et al., 2006; Ikeda et al., 2006; Gandhi et al., 2010].
Активно исседуемый член семейства AC белков ADF/cofilin, который содержит одиночный ADF-H домен. ADF/cofilin соединяется с G- и F-актином, преимущественно с его АДФ-связанной формой в 1:1 и 2:1 стоихометрии, соотв. [Hayden et al., 1993; Maciver and Weeds, 1994; Carlier et al., 1997; Ressad et al., 1998; Blondin et al., 2001; Galkin et al., 2001]. Активность ADF/cofilin регулируется с помощью pH [Yonezawa et al., 1985; Yonezawa et al., 1987], фосфорилирования [Morgan et al., 1993], phosphatidylinositols [Yonezawa et al., 1985; Yonezawa et al., 1987] и др. актин-связывающих белков, таких как tropomyosin, myosin, cortactin, coronin, CAP1/Srv2p и formin mDia1 млекопитающих [Nishida et al., 1984; Ono and Ono, 2002; Balcer et al., 2003; Bugyi et al., 2006; Gandhi et al., 2009; Oser et al., 2009]. ADF/cofilins от разных видов качественно сходны в отношении активности к актину, однако имеются различия в величине их эффектов [Carlier et al., 1997].
Недавно полученная структура twinfilin's ADF-H домена в комплексе с молекулой G-actin показала, что интерфейсы связывания расположены в борозде между S1 и S3 актина [Paavilainen et al., 2008]. ADF-H домен связывания, по-видимому, запирает щель связывания нуклеотида между S2 и S4 в закрытой конформации, это может составлять структурную основу ингибирования обмена нуклеотида в G-actin с помощью ADF/cofilin, а также twinfilin [Nishida, 1985; Carlier et al., 1997; Andrianantoandro and Pollard, 2006; Paavilainen et al., 2008]. В согласии со структурными данными гашенияе флюоресцентного ε-ATP обнаруживает пониженную доступность fluorophore в присутствие ADF/cofilin, это указывает на то, чтощель связывания нуклеотида находится в более закрытом состоянии в комплексе ADF/cofilin-G-actin [Kardos et al., 2009]. FRET измерения показали, что связывание ADF/cofilin уменьшает расстояние между Gln41 (S2) и Cys374 (S1) [Dedova et al., 2002] и слегка увеличивает расстояние между Lys61 (S2) и Cys374 (S1) [Blondin et al., 2001]. Эти результаты указывают на то, что путем соединения с регионами, расположенными в S1, ADF/cofilin индуцирует аллостерические конформационные изменения, которые вызывают перестройку S2 и экспозируют D-loop [Bobkov et al., 2002; Muhlrad et al., 2004].
Соединение ADF/cofilin с актиновыми филаментами обнаруживает высокую степень кинетической кооперативности [Hawkins et al., 1993; Hayden et al., 1993; Ressad et al., 1998; De La Cruz, 2005] и сопровождается выраженными и уникальными структурными пересторойками в актиновых филаментах. Эти конформационные изменения приводят к изменению термодинамических и функционалных свойств актиновых филамент, включая повышенную скорость деполимеризации заостреных концов [Carlier et al., 1997; Ressad et al., 1998], ускоренное высвобождение Pj из ADP-Pj-F-актина [Blanchoin and Pollard, 1999] и ингибирование связывания myosin, tropomyosin и phalloidin с ADF-декорированными актиновыми филаментами [Nishida et al., 1984; Carlier et al., 1997; Ono and Ono, 2002].
Атомная модель ADF/cofilin-декорированного F-актина выявляет лобширные контакты связанной молекулы ADF/cofilin с наружным доменом актинового протомера [McGough et al., 1997; Galkin et al., 2001]. 3D спиральная реконструкция l ЭМ изображений показывает, что ADF/cofilin индуцированные изменения в скручивании филамент путем снижения ротации на субъединицу до ~5° вдоль short-pitch left-handed генетической спирали, тогда как сохраняется постоянное повышение на субъединицу [McGough et al., 1997]. ADF/cofilin связывание приводит как к разрушению продольных контактов, сопровождаемому сильным наклоном актиновых субъедниц [Galkin et al., 2001; Bobkov et al., 2002], так и к ослаблению латеральных взаимодействий в филаментах [McGough and Chiu, 1999; Bobkov et al., 2004]. Сдвиг в скручивании филамент, как полагают, объясняет способность ADF/cofilin осуществлять разборку филамент [McGough et al., 1997]. Однако мутантный ADF/cofilin, который может изменять скручивание F-актина, неспособен усиливать деполимеризацию [Pope et al., 2000]. Улучшенный анализ ЭМ изображений с использованием отслеживания одиночных частиц, базирующийся на подходе многократных реконструкций спирального реального пространства [Egelman, 2000] , подтвердил, что скорее чем наложение нового витка (twist), ADF/cofilin замораживает F-actin в присущем ему нестабильном состоянии, при котором разрушаются контакты между D-петлёй одного протомера и C-концом соседнего протомера [Galkin et al., 2003]. В соответствии со структурными исследованиями, сайт-направленный spin-labelled EPR выявляет снижение в количестве взаимодействующих spin зондов, прикрепленных к Gln41 (S2) и Cys374 (S1) в соседних протомераз и увеличение их подвижности, это указывает на более гибкий белковый матрикс вокруг зондов и рыхлые контакты между мономерами внутри продольного шага (long-pitch) нити F-актина [Scoville et al., 2009].
Анализ термально продуцируемых флюктуаций флюоресцентно меченных актиновых филамент показал, что ADF/cofilin увеличивает гибкость к изгибам и снижает сохранение длины актиновых филамент в 5 раз [McCullough et al., 2008]. Измерения временной фосфоресцентной анизотропии показали, что ADF/cofilin измененная динамика на микросекундной временной шкале F-актина, обеспечивается дальнодействующим кооперативным способом за счет увеличения скорости микросекундных ротационных движений и торсионной гибкости актиновых филамент [Prochniewicz et al., 2005].
Gelsolin
Семейство gelsolin состоит из 7 различных белков, характеризующихся повторами gelsolin-like (G) доменов, включая gelsolin, adseverin, villin, capG, advillin, supervillin и flightless I, которые участвуют в регуляции динамики актина [Silacci et al., 2004]. Gelsolin содержит 6 тандемных gelsolin-like доменов и взаимодействует с G- и F-актином. Взаимодействие gelsolin с G-actin ведет к образованию 1 : 2 gelsolin : actin комплекса (GA2), служащего в качестве затравки (seed) для дальнейшего роста филаменты во время которого gelsolin покрывает шапочкой колючий конец филаменты [Way et al., 1989]. Gelsolin также быстро соединяется с F-actin, это приводит к укрочению филамент из-за их медленной Ca2+-зависимой разделывающей активности, при этом gelsolin остается связанным с колючим концом разъединяемой филаменты [Hesterkamp et al., 1993]. Phosphoinositides (PIP2) ингибируют разделывающую активность gelsolin и отделяет gelsolin от актина [Janmey et al., 1987].
Спиральная реконструкция cryo-ЭM изображений показала. что путем соединения со стороной F-актина gelsolin связывает мостиком два соседних актиновых протомера с укороченным шагом (short pitch) спирали и вызывает искажения внутри актиновых филамент, которые могут быть достаточно слабыми нековалентными взаимодействиями, чтобы разрывать и разъединять филаменты [Bearer, 1991; McGough et al., 1998]. ЭМ реконструкция показала, что gelsolin также вызывает существенные конформационные изменения внутри актиновых филамент, когда он соединен с колючим концом [Orlova and Egelman, 1995]. Измерения зависимой от времени фосфоресцентной анизотропии показало, что присоединение единичной молекулы gelsolin к колючему концу изменяет конформационную динамику всей филаменты за счет дальнодщействующих аллостерических взаимодействий, вызывающих повышение торсионной гибкости [Prochniewicz et al., 1996b]. Присоединение Gelsolin модифицирует также конформацию С-конца вблизи Cys374. Дальнейшие измерения поперечного связывания и флюоресценции показали , что нуклеации с помощью gelsolin способствуют конформационные изменения между D-петлей и C-концом протомера, которые распространяются вдоль филамент от gelsolin, покрывающего шапочкой колючие концы [Khaitlina and Hinssen, 1997].
Actin Nucleation Factors
Как in vitro, так и in vivo, скорость спонтанной полимеризации актина ограничивается нестабильностью инициальных актиновых димеров/тримеров. В клетках, чтобы преодолеть этот кинетический барьер и регулировать точно пространственно-временныую инициацию актиновой структуры, ассоциированные с мембраной зависимые от стимулов факторы нуклеации катализируют de novo образование актиновых филамент с помощью уникальных механизмов. Первый идентифицированный аппарат нуклеации включает WASP/WAVE/Scar белки (Wiskott-Aldrich syndrome protein/WASP family verprolin homologous/suppressor of c-AMP response) , которые активируют Arp2/3 комплекс, чтобы генерировать разветвленную дочернюю филаменту из предсуществующей материнской филаменты [Pollard, 2007]. Недавно репертуар факторов нуклеации актина пополнился белками, содержащими множественные WH2-домены, подобные Spire [Quinlan et al., 2005], Cordon-bleu [Ahuja et al., 2007], Leiomodin [Chereau et al., 2008] и VopF/VopL [Liverman et al., 2007]. Эти белки, как полагают, связывают актиновые мономеры посредством WH2-повторов и стабилизируют их в комплексы.Третий класс факторов нуклеации это formin белки, которые используют formin homology домены (FH1 и FH2), чтобы инициировать сборку актина и управлять прогрессивным ростом колючего конца profilin-actin путем постоянной ассоциации с удлиняющимся колючим концом и одновременно добавления субъединиц [Goode and Eck, 2007].
Механизмы, с помощью которых факторы нуклеации катализируют сборку филамент и регулируют динамику колючего конца, активно исследуются в последние годы [Kerkhoff, 2006; Goode and Eck, 2007; Pollard, 2007; Renault et al., 2008; Bugyi and Carlier, 2010]. Напротив, мало известно о конформационной динамике зарождающихся филамент с помощью этих факторов. Formins, как недавно было установлено, изменяют конформационную динамику актиновых филамент. Измерения с помощью температуро-звисимого FRET и время зависимой флюоресцентной анизотропии показали, что formin Dia1 (mDia1) млекопитающих благодаря связыванию с колючим концом увеличивает общую гибкость актиновых филамент, это происходит в результате множества незначительных взаимодействий между соседними протомерами в formin-nucleated актиновых филаментах [Bugyi et al., 2006; Papp et al., 2006]. FH2 домен достаточен для этого конформационного изменения [Ujfalusi et al., 2009]. Детальный анализ показал, что formin-индуцированные конформационрные изменения распространяются на несколько сотен nanometres от колючего конца посредством дальнодействующих аллостерических взаимодействий [Bugyi et al., 2006; Papp et al., 2006]. Расширенное описание с помощью ST-EPR измерений показало снижение торсионной гибкости formin-nucleated актиновых филамент [Kupi et al., 2009], указывая тем самым, что формином индуцированные изменения конформационной динамики актиновых филамент сложные. Важно, что formin-nucleated, актиновые филаменты более гибкие меняют функциональные свойства. Они снижают термальную стабильрность, повышают скорость высвобождения фосфата и изменяют взаимодействия с ADF/cofilin [Bugyi et al., 2006]. Измерения зависимой от времени анизотропии показали, что tropomyosin или myosin восстанавливают формином индуцированные конформационные изменения и стабилизируют formin-nucleated актиновые филаменты [Ujfalusi et al., 2009] and unpublished observations). Bni1, но не Bnr1 из S. cerevisiae, как полагают, также индуцирует конформационные изменения внутри актиновых филамент дрожжей, это демонстрируется увеличением pyrene excimer флюоресценции в formin-nucleated актиновых филаментах [Wen and Rubenstein, 2009].
Mutations in Actin and Pathologies
Минорные изменения в высоко консервативном аминокислотном составе актина могут оказывать глубокое воздействие на структуру актина, его функцию и взаимодействия с молекулами партнерами (напр., myosin, tropomyosin) [Bookwalter and Trybus, 2006]. Мутации в генах, кодирующих актин, которые являются доминантными миссенс мутациями в большинстве случаев ведут к тяжелой дисфункции родственных актиновых структур и болезни. Высоко контролируемый сайт-направленный мутагенез актина в системе рекомбинантного baculovirus/Sf9 предоставил критический инструмент для получения детальной информации о структурных/функциональных изменениях, вызываемых мутациями [Joel et al., 2004; Rould et al., 2006; Debold et al., 2009] и для понимания молекулярного механизма в основе связанных с актином патологических ситуаций.
Мутации в актине часто проявляются в форме скелетныныъ [Sparrow et al., 2003; Feng et al., 2009] и кардиальных миопатий [Olson et al., 1998, 2000; Mogensen et al., 2004]. Мутантные скелетные α-actins могут иногда накапливаться в виде компактных внутриядерных структур [Ilkovski et al., 2005]. В случае актиновых мутаций, вызывающих миопатии, и большинства внутриядерных rod миопатий, мутантные аминокислоты образуют кластер вокруг центральной щели актина. Аминокислотные мутации, связанные с nemaline миопатией, были разбросаны по молекуле актина, затрагивая большое количество разных сайтов связывания (напр., actin-actin, acto-myosin, actin-tropomyosin, actin-nebulin, actin-α-actinin) [Sparrow et al., 2003]. Одиночные аминокислотные мутации могут вызывать как структурные, так и функциональные дефекты. Мутации L94P, E259V приводят к неправильной укладке, тогда как I357L мутант обладает менее компактной конформацией белка [Ilkovski et al., 2004]. Мутанты I64N, Q263L, G268C, G268R и N280K обладают более низкой способностью кополимеризоваться с актином дикого типа [Sparrow and Laing, 2008; Sparrow et al., 2003]. R183G nemaline мутантный актин обладает пониженной способностю к полимеризации [Ilkovski et al., 2004].
В условиях in vitro M132V nemaline мутантный актин, полученный из биоптатов от человека, как было установлено, обладет более низкой способностью к полимеризации и повышенной скоростью в методе подвижности актомиозина [Marston et al., 2004]. Мутации в гене ACTG1, кодирующем компоненты цитоскелетного актина, были связаны с болезнью человека (dominant progressive deafness) [Zhu et al., 2003]. Замена аминокислот (T89I, K118M, P332A, P264L) нарушает первичные (mutation P332A) и вторичные сайты связывания миозина (mutation T89I), сайты связывания для ?-actinin (mutation K118M) и область, которая играет роль в стабильности или эластичности актиновых филамент (mutation P332A) [Zhu et al., 2003]. Авт. предпложили, что эти мутации могут модифицировать функции, родствнные γ-actin в затронутых клетках, вызывая прогрессиную потерю слуха у пациентов.
Мутация T278I в гене ACTG1, кодирующем цитоскелетный γ-actin может также вызывать аутосомно доминантную потерю слуха [van Wijk et al., 2003]. В этом случае авт. предполагают. что мутация компонентов цитоскелетного актина вызывает структурные изменения и нарушает свойство полимеризации, а также нормальную функцию волосковых клеток во внутреннем ухе [van Wijk et al., 2003]. Эффект мутаций γ-actin, которые были идентифицированы при аутосомной доминантной потере слуха, на функцию актина был исследован биохимически и был получен вывод , нарушение регуляции актиновых филамент с помощью актин-связывающих белков может быть ключевым фактором в возникновении глухоты [Bryan et al., 2006]. Было предположено, что cofilin в качестве важного регулятора оборота актиновых филамент д. участвовать в балансе нестабильности актиновых филамент, вызываемой точковыми мутациями [Bryan and Rubenstein, 2009]. Было также сделано заключение, что прогрессирующая дезинтеграция цитоскелета внутри волосковых клеток д. приводить к потере слуха у пациентов, страдающих от этой болезни [Bryan et al., 2006; Bryan and Rubenstein, 2009; Morin et al., 2009].
В случае семейной гипертрофической кардиомиопатии некоторые мутантные актины (Q99K, P164K, M305L) замедляют укладку in vitro. Включение мономеров в структуру филамент также сказывается неблагоприятно [Vang et al., 2005]. Скмейная дилятационная кардиомиопатия этиологически сцеплена с R312H и Q361G мутациями, которые нарушают взаимодействия между кардиальным α-actin и интеркалированным диском, Z-disk, α-actinin и dystrophin [Kuhlman et al., 1992; Levine et al., 1992; Olson et al., 1998]. Наиболее распространенные сайты мутаций показаны на Figure 4.
Figure 4. The most common mutation sites in muscle actin. The most common mutation sites are labeled with one letter and ID number of the amino acids [Olson et al., 1998; van Wijk et al., 2003; Zhu et al., 2003; Ilkovski et al., 2004; Marston et al., 2004]. The ribbon structure of rabbit skeletal muscle actin (PDB code: 1ATN [Kabsch et al., 1990] is colored black at the mutated points.
Помимо мутаций в собственно актине мутации в генах, кодирующих ассоциированные с актином белки также ведут к генетическим заболеваниям. Dystrophin и его гомолог utrophin являются членами сверхсемейства spectrin. Эти белки ассоциированы с costameric цитоскелетом в поперено исчерченных мышцах, которые по окружности располагаются вокруг миофибрилл в одном регистре с Z-disk и физически связывают генерирующие силу миофибриллы с сарколеммой [Ervasti, 2007]. Мутации гена dystrophin вызывают Becker and Duchenne мышечную дистрофию и дилятационную кардиомиопатию, характеризующиеся быстрой прогрессие мышечной дегенерации и ассоциированными дефектами эластичности и целостности [Petrof et al., 1993; Puttini et al., 2009]. И dystrophin и utrophin содержат на N-конце тандем calponin homology (CH) доменов и spectrin-подобные повторы, которые обеспечивают расширенный контакт с актиновыми филаментами [Blake et al., 2002; Ervasti, 2007]. Несмотря на эти сходства структурная реконструкция и биохимические исследования показывают, что dystrophin и utrophin имеют разные способы ассоциации с F-actin [Sutherland-Smith et al., 2003; Rybakova et al., 2006].
Эффекты dystrophin и utrophin на структурную динамику актиновых филамент были изучены с помощью преходящей фосфоресцентной анизотропии. Результаты показали. что оба белка изменяют ротационную динамику актиновых филамент [Prochniewicz et al., 2009b]. Однако эффекты utrophin более выражены, чем dystrophin, хотя dystrophin осуществляет более обширные контакты с F-actin [Sutherland-Smith et al., 2003]. Соединение utrophin с F-actin ведет к снижению амплитуды как intraprotomer, торсионных, так и изгибающих движений в актиновых филаментах, в то же время повышает скорость этих движений, это указывает на повышенную торсионную гибкость актиновых филамент. Эта необычная комбинация эффектов на ротационную динамику указывает, что связывание utrophin и dystrophin придает специальные механические свойства F-актину; делая его более сильным и более гибким. Изменения гибковсти актиновых филамент, вызыванные этими актин-связывающими белками, могут быть важными для оптимизации механических свойств costamers, делая возможной латеральную передачу сил от саркомеры к внеклеточному матриксу во время мышечного сокращения или растягивания, поскольку гашение стрессов наложено на сарколемму.
Biological Relevance: An Example
Трудно исследовать простую модель биологической функции, связанной с конформационными изменениями в актиновых мономерах или филаментах. Трудно исходить из двух источников. Актин выполняет различные и сложные биологические функции и, по-видимому, может эффективно и доволно быстро адаптироваться ко многим внутриклеточным ситуациям и к пратнером по связыванию. Зато существует огромное число молекул от малых катионов до блеков. которые вносят вклад в широкий конформационный ландшафт актина. Хотя эти конформационные изменения активно исследуются in vitro, очень мало и зветсно о конформационной динамике акти на в клеточной среде. Выше были представлены примеры этих специфических взаимодействий и окружающихсред и рассмотрена роль конформационных состояний актина.
Хотя описанные взаимодействия были специфическими некоторые из них могут составлять основу для блее гнеральной модели в отношении регуляторной функции конформаций актина. Недавние наблюдения показали, что formins, группа факторов нуклеации актина, могут существенно изменять конформацию актиновых филамент, делая их более гибкими [Bugyi et al., 2006; Papp et al., 2006]. Эти изменения обращались при соединении с др. актин-связывающими белками, такими как tropomyosin [Ujfalusi et al., 2009] или myosin (our unpublished observations). Хорошо известно, что определенные группы актин-связывающих белков преимущественно локализуются на актиновых структурах, генерируемых Arp2/3 комплексом, тогда как др. актин-связывающие белки связывают formin, нуклеирующий актиновые филаменты [Moseley and Goode, 2006; Sirotkin et al., 2005]. Однако механизм, с помощью которого актин-связывающие белки различаются и отбираются филаментами, неизвестен. То, что кажется очевидным это то, что факторы нуклеации актина модифицируют сродство актин-связывающих белков к филаментам актина путем молекулярной селекции. Одним из наиболее правдоподобных способов настройки сродства д.быть изменения конформации актиновых филамент. Существование этого молекулярного механизма, по-видимому, наиболее разумно, если учитывать время межбелковых взаимодействий. В соответствии со своей природой факторы нуклеации актина являются первыми белками, устанавливающими контакты с формирующимися актиновыми филаментами. Наблюдения, что formins могут менять структурное состояние актиновых филаментr, подтверждают эту идею. Хотя дальнейшие проясняющие и поддерживающие эксперименты необходимы для понимания, что факторы нуклеации актина вызывают модификации актиновых филамент и тем самым могут играть центральную роль в регуляции формирования актина, ассоциированного с внутриклеточными белковыми комплексами.
Future Perspectives
So far, the conformational dynamics of actin, and the effects of different factors were investigated in depth under in vitro conditions. Considering the rich variety of actin functions and the large amount of data accumulated in these studies some of the couplings between the structural changes and biological functions were revealed. In many other cases the complete understanding of the roles of intramolecular mechanisms in actin demands further studies. Cellular actin networks interact simultaneously with more proteins that can induce different changes in the conformational dynamics of individual actin monomers or filaments. How are these changes superimposed—enhanced or dampened—and determine the overall conformational dynamics of actin networks? How does the conformational dynamics of actin filaments play a role in the establishment of the functional properties of relevant actin networks? Recent advances in the development of novel technologies (such as fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) or fluorescence anisotropy decay imaging microscopy (FADIM) [Suhling et al., 2005] open the possibility to study the conformational dynamics of actin in specific cellular structures associated to diverse regulatory proteins. These in vivo measurements will be essential to understand how actin conformational dynamics is regulated and contributes to the functional and dynamic segregation of actin networks.
|
Сайт создан в системе
uCoz