Rho GTPases и their role in organizing the actin cytoskeleton  J Cell Sci 124, 679-683. 2011 | |
|
Клетки получают внеклеточные стимулы разными способами: в форме растворимых молекул (ростовых факторов, цитокинов и гормонов) которые взаимодействуют с рецепторами клеточной поверхности; от адгезивных взаимодействий с внеклеточным матриксом; и от межклеточных адгезий. Эти стимулы заставляют генерировать изменения в актиновом цитоскелете в специфических сайтах (see Poster), прежде всего посредством Rho белков. Локальные guanine-nucleotide-exchange factors (GEFs) или GTPase-activating proteins (GAPs) служат для активации или подавления уровней активных связанных с мембраной Rho белков. У человека существует ~20 Rho GTPases, из которых Rho, Rac и Cdc42 наиболее изучены (for a review, see Heasman и Ridley, 2008). Будучи активированными, Rho GTPases соединяются с различными эффекторами, включая протеин киназы (Zhao и Manser, 2005) и некоторые актин-связывающие белки. Они непосредственно или косвенно влияют на локальную сборку или разборку филаментозного (F)-актина. Пути, стоящие ниже Rho, которые сталкиваются с актином и являются предметом данной работы. Для каждой клеточной структуры в 'типичной' слипчивой клетке, мы включили информацию о специфической роли Rho эффекторов. Некоторые свойства этих эффекторов, их регуляция и их связанные с актином роли представлены в тексте. В статье не рассматривается роль Rho белков в обеспечении изменений в динамике актина во время клеточного цикла [см Villalonga и Ridley (Villalonga и Ridley, 2006)] или в специализированных структурах подосом и инвадоподий (см. Buccione et al., 2004; Linder, 2007; Albiges-Rizo et al., 2009).
Сопровождающий постер показывает схематически мигрирующую клетку с выпускаемой ламеллиподией, тонким слоем цитоплазмы, которая состоит в основном из очень динамичного F-актина. Используя speckle анализ одиночных молекул для изучения оборота актиновых филамент в ламеллиподиях, Watanabe и Mitchison (Watanabe и Mitchison, 2002) наблюдали, что эти F-актиновые филаменты генерируются преимущественно путем полимеризации на кончиках ламеллиподий. Существуют споры относительно расположения актиновых филамент в этой области, но превалирующим мнением вплоть до недавнего было, что образование веточек F-актином обеспечивается actin-related protein 2/3 (Arp2/3) белками, продуцирующими сеть из F-актиновых дендритов (see Pollard, 2007). Недавно это было поставлено под сомнение в исследовании 4-х типов клеток, которое пришло к заключению, что F-actin ламеллиподий почти исключительно не образует веточек (Urban et al., 2010). Недавнее исследование подтвердило, что большинство 'соединений филамент', видимое при ЭМ это фактически перекрывающиеся филаменты скорее, чем соединения ответвляющегося конца с боком др. филаменты. Это согласуется с тем, что силы, необходимые для вытягивания мембран, продуцируются такой сборкой F-actin.
Только многократные исследования живых клеток в отношении активации RhoA, Cdc42 и Rac1 (Machacek et al., 2009) подтвердили, что RhoA действует, чтобы инициировать событие выпячивания в области ламеллиподии, тогда как активация Cdc42 и Rac1 стабилизирует вновь расширившуюся мембрану. Область непосредственно позади ламеллиподии, названная lamella, относительно плоская и тонкая (Heath и Holifield, 1991), и актиновые филаменты в этой области (некоторые в комбинации с myosin) подвергаются ретроградному току в направлении тела клетки. Ламелла отличается от ламеллиподии низкой скоростью тока F-actin (Ponti et al., 2004) и присутствием актомиозиновых филамент. Адгезия с матриксом, которая обеспечивается посредством интегринов, происходит как на границе ламелла-ламеллиподия (Kaverina et al., 2002) так и на кончике ламеллиподии (Alexandrova et al., 2008; Choi et al., 2008). Эти зарождающиеся адгезивные комплексы стремятся к созреванию, чтобы стать 'фокальными адгезиями' под влиянием устойчивых сокращений myosin II (Vicente-Manzanares et al., 2009). Актомиозиновые стрессовые волокна связывают эти адгезии и являются существенными для их стабильности. В области lamella стрессовые волокна могут быть расположены ортогонально по отношению к краю клетки (кольцевые стрессовые волокна), или они могут простираться перпендикулярно к краю клетки в направлении ядра или поперек центра клетки. Actin polymerization I: promoting F-actin nucleation through formins Formins были распознаны первыми в качестве Rho мишеней при двугибридном скрининге с дрожжевой Rho1p, который идентифицировал Bni1p (Kohno, 1996). Клетки обладают несколькими стратегиями для инициации полимеризации новых актинов, из которых formins, по-видимому, используются чаще всего (Nicholson-Dykstra et al., 2005; Rafelski и Theriot, 2004). Белки diaphanous млекопитающих (Dia1, 2 и 3; также известные как Diap или Diaph белки) являются лучше всего охарактеризованными форминами позвоночных, они представлены одним из семи подсемейств форминов (Chesarone et al., 2010). Определяющим признаком форминов является FH2 домен и соседний вариабельно длины profilin-связывающий FH1 домен, который кооперативно обеспечивает сборку филамент актина. Большинство форминов содержат C-терминальный ингибирующий домен ауторегуляции (DAD) и N-терминальный Rho-binding domain (RBD), вставленный в более крупный ингбирующий домен (DID), последний из них делает возможным авто-подавление и может быть приглушен с помощью связывания Rho (Rose et al., 2005; Otomo et al., 2005).
Первая установленная структура дрожжевого Bni1p показала, что FH2 домен образует димерный "пончик" ('donut') (Xu et al., 2004), который, по-видимому, соответствует колючему концу актиновой филаменты; ряд последующих FH2 структур обнаружил то же самое свойство. FH2 домен может оставаться постоянно ассоциированным (processive) с колючим концом и удлиняет F-actin в присутствие белков, покрывающих колючий конец, которые обильны в области ламеллиподий. Эта массивная и поляризованная сеть собранного F-actin составляет движущую силу для расширения мембраны (Le Clainche и Carlier, 2008; Faix et al., 2009). Хотя Dia1 млекопитающих активируется только с помощью семейства Rho (т.e. RhoA, B и C), родственные Dia2 и Dia3 белки также могут быть активированы с помощью Rac1 и Cdc42 (Lammers et al., 2008). Доказательства роли форминов в продукции филоподий получены из ряда источников. Dictyostelium Dia2 концентрируется на кончиках филоподий и необходим для формирования и поддержания филоподий (Schirenbeck et al., 2005); белок Dia2 сходным образом обогащен как в ламеллиподиях, так и филоподиях клеток млекопитающих (Yang et al., 2007). Ena- и/или vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)-нулевые нейроны дефектны по инициации нейритов, но могут нормализованы путем восстановления образования филоподий посредством эктопической экспрессии Dia2 млекопитающих (Drees и Gertler, 2008). Альтернативным путем генерации новых колючих концов является сборка актиновых веточек на существующей филаменте - это происходит посредством активности Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) и WASP-family verprolin-homologous (WAVE) белков. Actin polymerization II: WASP и WAVE complexes initiate branching Белки семейств WASP и WAVE являются фундаментальными организаторами актинового цитоскелета у эукариот. Cdc42-Rac-interactive binding (CRIB) домен в WASP был идентифицирован по его гомологии с p21-activated kinase (PAK) (Symons et al., 1996); однако, WASP соединяется с Cdc42, но не с Rac1. И WAVE и WASP управляют Arp2/3-обеспечиваемым ветвлением F-actin и и тем самым быстрой полимеризацией актина, путем увеличения числа свободных колючих концов (Kurisu и Takenawa, 2009). Они обладают общей C-терминальной архитектурой: богатые пролином участки сопровождаются 'VCA' регионом, который запускает полимеризацию актина посредством Arp2/3, двух актин-подобных белков, которые служат в качестве актинового псевдо-димера. C-терминальный домен из ~20 аминокислот образует амфипатическую α-спираль, которая активирует комплекс Arp2/3 complex (Panchal et al., 2003).
Белок WAVE2 играет селективную роль в динамике ламеллиподий по сравнению с WAVE1, который играет роль в дорсальных складках (ruffles) (Kurisu и Takenawa, 2009). Оба эти белка WAVE постоянно инкорпорированы в гетеропентамерный комплекс с Rac1-связывающим белком PIR121 (также известным как Sra1 и CYFIP2), Nck-associated protein 1 (Nap1), Abl-interacting protein (Abi) 1, 2 и 3, и HSPC300 (Gautreau et al., 2004; Innocenti et al., 2004). Тщательная реконструкция WAVE регуляторного комплекса показала, что PIR121ингибирует WAVE регион VCA, так что активация с помощью Rac1 WAVE комплекса посредством PIR121 может быть внутримолекулярной, подобной Cdc42-опосредованной активации WASP (Ismail et al., 2009). Максимальная активность WAVE2 комплекса нуждается в одновременных взаимодействиях с prenylated связанного с мембраной Rac1 и кислыми фосфолипидами (Lebensohn и Kirschner, 2009). Фосфорилирование WAVE комплекса также является обязательным - напр., WAVE2 нуждается во множественных событиях фосфорилирования casein kinase 2 (CK2) внутри её VCA домена (Pocha и Cory, 2009).
WASP белки подобным же образом формируют стабильные один к одному комплексы с WASP-interacting protein (WIP) белками, и нуждаются в Toca-1 (для transactivator of cytoskeleton assembly 1) (Ho et al., 2004), или в его паралогах Cdc42-interacting protein 4 (CIP4 )или в formin-binding protein 17 (FBP17), для активации. CIP4, подобно повсеместному N-WASP, соединяется с Cdc42-подобными белками, но не с Rac1 (Aspenstrom, 1997); считается, что эти белки прежде всего способствуют эндоцитозу. Эта идея возникла, поскольку дрожжевой WASP гомолог Las17p был идентифицирован при скрининге мутаций, нарушающих эндоцитоз (Naqvi et al., 1998). N-WASP, по-видимому, ускоряет полимеризацию актина вблизи инвагинирующих покрытых клатрином ямок, предоставляя энергию отделения их от плазматической мембраны. N-WASP-WIP комплекс вместе с Toca-1 или FBP17, активирует полимеризацию актина на мембранах, содержащих phosphatidylserine (Takano et al., 2008). Эти роли были подтверждены в наблюдениях, что мышиные Cip4-нулевые клетки имеют задержанный или пониженный эндоцитоз (Feng et al., 2010). Actin depolymerization и severing by cofilin Как только F-actin формируется в клетке, то покрытие колючих концов регулирует степень элонгации филамент актина. Множество таких связывающих белков влияет на этот процесс и ряд их является мишенями для Rho эффекторных киназ (see Pak et al., 2008). ADF/cofilin белки увеличивают диссоциацию субъединиц с заостренных концов (Carlier et al., 1999); однако др. исследования противоречат этому мнению и указывают на то, что cofilin действует преимущественно, чтобы разъединять F-actin и блокировать элонгацию колючих концов (Andrianantoandro и Pollard, 2006). Активный cofilin может также диссоциировать или 'обнажать' Arp2/3-производные веточки F-актина (Chan et al., 2009). Высокие уровни phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] инактивируют cofilin in vitro (Yonezawa et al., 1990), но ключевая регуляция происходит с помощью фосфорилирования Ser3 на cofilin с помощью LIM-domain-containing kinases (LIMKs) и testis-specific kinases (TESKs), события, стоящие ниже RhoA и Rac1 (Nishita et al., 2005; Huang et al., 2006). Такая инактивация cofilin локально способствует стабильности и элонгации F-актина. Rho-associated protein kinases (ROCKs или ROKs) и PAKs активируют LIMK посредством фосфорилирования её активационной петли (Thr508 в LIMK1) (for a review, see Bernard, 2007). Регуляция TESKs не изучена вовсе. В ламеллиподиях инактивация cofilin зависит прежде всего от активностей Rac1 и его мишеней PAK1 и PAK2 (Delorme et al., 2007). MLCK, ROCK, MRCK и PAK regulate the actomyosin network Зависимая от Ca2+/calmodulin myosin light chain kinase (MLCK) фосфорилирует myosin regulatory light chain 2 (MLC2) преимущественно по Ser19 и в меньшей степени по Thr18 (Sellers et al., 1981). Это влияет как на активность, так и сборку филамент myosin II. В не мышечных клетках MLCK действует на определенные пулы myosin II от ROCK (Totsukawa et al., 2004). Длинная форма MLCK (220 kDa) доминирует в не мышечных контекстах, таких как клетки HeLa и PTK (Poperechnaya et al., 2000); она содержит множественные копии мотива DxRxxL (не найденные в мышечной форме в 130 kDa), это направляет MLCK на стрессовые волокна. Члены семейства ROCK являются непосредственными мишенями RhoA (Leung et al., 1995; Fujisawa et al., 1996): это семейство киназ включает киназу миотонической дистрофии ROCK, myotonic-dystrophy-kinase-related Cdc42-binding kinase (MRCK) и citron kinase. Помимо связывания Cdc42, MRCK связывает protein kinase C (PKC)-like C1 zinc finger и активируется с помощью diacylglycerol, тем самым она помещается ниже phospholipase C (Tan et al., 2001), подобно MLCK. Эквивалентные ROCK цинковые пальчики могут позволять регуляцию с помощью липидов, таких как arachidonic acid (Feng et al., 1999), но это не было изучено тщательно. Общими мишенями этих цинковых пальчиков является миозин-связывающая субъединица (MBS или MYPT1) миозиновой фосфатазы (for a review, see Matsumura и Hartshorne, 2008) и регуляторный MLC2 белок, который контролирует активность myosin IIA и myosin IIB (Vicente-Manzanares et al., 2009). Комплекс MBS соединяется с RhoA, вообще-то посредством M-RIP адаптора (Kimura et al., 1996; Surks et al., 2003). ROCK также фосфорилирует Na+/H+ antiporter NHE-1, который способствует экспорту протонов, важному для действия миозина II (Vexler et al., 1996; Tominaga et al., 1998).
Фосфорилирование и инактивирование ассоциированного с миозином фосфатазного комплекса PP1δ-MYPT1 с помощью как ROCK так и MRCK хорошо известны (Conti и Adelstein, 2008) и мнение о локальных сигнальных сетях подтверждается прямым взаимодействием RhoA с MYPT1 (for a review, see Ito et al., 2004). Важно прямое фосфорилирование регуляторного Ser19 в MLC2 с помощью ROCK и MRCK также сегодня принимается (Vicente-Manzanares et al., 2009). Кстати, не описано специфических к фосфорилированию антител для активных форм ROCK или MRCK, ограничивающих информацию по пространственной активации этих киназ в клетках. Однако эффекты ROCK могут быть определены благодаря использованию отчасти селективного киназного ингибитора Y-27632 (Uehata et al., 1997).
В клетках HeLa и U2OS ламеллярные окружные актомиозиновые филаменты обогащены миозином IIA и миозином 18A, и их ансамбли и перемещения контролируются с помощью MRCK, но не ROCK (Tan et al., 2008). Myosin 18A является необычным миозином с сайтом связывания актина от N-концевого до головного домена (Isogawa et al., 2005) и с PDZ доменом. которые связывает адапторный комплекс LRAP35a-MRCK. Нокдаун миозина 18A фактически предупреждает сборку миозина IIA в области lamella (Tan et al., 2008). MRCKα и β являются повсеместными Cdc42 эффекторами; однако широко распространенная альтернативно сплайсированная изоформа MRCKα с двумя тандемными CRIB доменами преимущественно связывает Rac1 (Tan et al., 2003). Cell asymmetry и centrosomal polarity in cell migration Myosin II является важным для полярности мигрирующих клеток; контрактильность вызывает нарушение клеточной симметрии путем образования проспективного тыла или хвоста в клетке (for a review, see Vicente-Manzanares et al., 2009) и выпячивания противоположного 'ведущего края' (Vicente-Manzanares et al., 2007). В мигрирующих клетках активность RhoA и ROCK необходима для собственно регуляции подтягивания хвоста (Pertz et al., 2006). Полярность центросомы, напротив, нуждается в активности Cdc42-Par6-aPKC-Par3 комплекса (Suzuki и Ohno, 2006). Клеточная полярность чаще всего оценивается в клеточных тестах с царапиной в монослое сливающихся клеток. Пораненный край клеток ориентирует свои центросомы в направлении раны, процесс, который легко отслеживается. Существующая модель этого процесса утверждает, что адгезия нового внеклеточного матрикса рекрутирует белки полярности PAR на ведущий край (Schlessinger et al., 2007). Однако при использовании клеточного роста в микропипетке было показано, что межклеточные контакты скорее, чем привлечение нового интегрина делает возможной поляризацию (Desai et al., 2009). Ранение первоначально вызывает смещение ядра в направлении оставшихся межклеточных контактов и прочь от свободного края. Т.к. центросома прикреплена с помощью микротрубочек к плазматической мембране, это смещение ядра и последующее перемещение нуждается в контрактильном миозине II, управляемом с помощью Cdc42 эффекторной MRCK (Gomes et al., 2005), которая, по-видимому, оперирует посредством MRCK-обогащенных субъядерных стрессовых волокон.
Известно, что миграция фибробластов через трехмерный внеклеточный матрикс нуждается в ROCK, тогда как клетки карциномы полагаются прежде всего на MRCK (Gaggioli et al., 2007); в др. контекстах, PAKs участвуют в миграции раковых клеток (Molli et al., 2009). Наилучшим доказательством перекрывающихся ролей этих трех киназ получены в экспериментах на Caenorhabditis elegans (которые имеют по одной копии ROCK, MRCK и PAK), у них комбинированная потеря ROCK и PAK или ROCK и MRCK, полностью предупреждает элонгацию эмбрионов, обусловленную миозином II. Это убедительное генетическое доказательство взаимодействия между тремя этими киназами в этом консервативном пути (Gally et al., 2009). В дополнение к контролирующей контрактильности актомиозина, ROCK и MRCK способствуют прикреплению актина к клеточным мембранам. Tethering F-actin to different membranes through ERM, CIP4 и IRSp53 Большая часть плазматической мембраны закреплена на подлежащих ячейках сети кортикального F-actin. ROCK и MRCK фосфорилируют белки семейства ezrin-radixin-moesin (ERM), чтобы активировать их функцию в качестве связей между F-actin и множественными трансмембранными белками, которые стабилизируют кортикальную актиновую сеть (Niggli и Rossy, 2008). В своей неактивной конформации N-терминальный FERM домен соединяется с C-терминальным актин-связывающим доменом. Как соединение PtdIns(4,5)P2 с FERM доменом, так и фосфорилирование критического треонинового остатка ROCK стабилизируют неупакованную конформацию, делая возможным соединение FERM домена с трансмембранными рецепторами. Описано фосфорилирование ERM белков в филоподиях, вызванное Cdc42-MRCK комплексом (Nakamura et al., 2000). PtdIns(4,5)P2 является высоко заряженным липидом, который активирует или инактивирует многие актин-связывающие белки (Janmey и Lindberg, 2004). Как Rac1, так и RhoA соединяются с phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (PIP5K); это существенно стимулирует синтез PtdIns(4,5)P2 с помощью всех трех изоформ PIP5K (Weernink et al., 2004). К сожалению, лежащая в основе регуляция Rho-PIP5K пути остается неизвестной.
Связанные с мембраной BAR домены могут служить как сенсоры или способствовать изогнутости мембраны (Peter et al., 2004). Белки семейства CIP4 являются компонентами комплекса N-WASP (Tian et al., 2000; Tsujita et al., 2006) и содержат F-BAR домен, который, по-видимому, стабилизирует инвагинации плазматической мембраны, такие, которые генерируются во время эндоцитоза. Cdc42-родственный TC10 белок рекрутирует CIP4 во время стимулированной инсулином транслокации Glut4 в адипоциты (Chang et al., 2002). Удивительно in vitro данные показывают, что F-BAR белки и N-WASP-WIP комплекс обладают способностью 'чувствовать' кривизну мембраны и связывают эту информацию с локальной полимеризацией актина (Takano et al., 2008). F-BAR домены FBP17 и CIP4 также формируют филаменты посредством взаимодействий конец-в-конец, это может служить направлению мембранной tubulation (Shimada et al., 2007).
Филоподии богаты палочковидными клеточными выпячиваниями, которые формируются за счет сборки актиновых филамент, собранных в пучки с помощью fascin и собираемые с 'tip complex'. Филоподии могут быть индуцированы с помощью Cdc42 или Rif, и нуждаются в эффекторном белке, наз. insulin receptor substrate protein of 53 kDa (IRSp53) (Faix и Rottner, 2006). IRSp53 обладает обратным inverse (I)-BAR доменом, который соединяется с и стабилизирует 'изогнутые' клеточные мембраны (в противоположном направлении относительно CIP4) на выпячиваниях, таких как ламеллиподии и филоподии (Scita et al., 2008). Благодаря своему SH3 домену, IRSp53 может формировать комплекс с WAVE2 in vivo (Suetsugu et al., 2006), или с F-actin покрывающим белком Eps8 (Disanza et al., 2006). Локализация IRSp53 или в ламеллиподиях или филоподиях нуждается в SH3 взаимодействии, позволяя ему способствовать изгибу мембраны: это негативно регулируется с помощью фосфорилирования и связывания 14-3-3 белков (Robens et al., 2010), которые регулируют продолжительность жизни филоподий.
Conclusions It is probable that the bulk of Rho effectors have now been uncovered, but much remains to be discovered about how these proteins organize actin. The main challenges are to understand the actions of these proteins in their proper cellular context и to determine the in vivo substrates for the kinase effectors of Rho proteins [including PKN (protein kinase N) и MLK (mixed-lineage kinase), which we have not discussed here]. The hope is that the actin cytoskeleton is regulated by a modular set of macromolecular machines that operate in a similar manner in multiple cell types. Thus, the results obtained so far from a variety of cells grown in two-dimensional cultures would be pertinent to whole tissues и organisms.
| |
