Важная роль CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBPs) была установлена для регуляции экспрессии легочных генов (Cassel et al.,2000a,b,2002; Cassel and Nord,2003; Didon et al.,2011). Роль C/EBPs в регуляции дифференцировки, пролиферации, а также воспаления и иммунологической защиты в др. органах и тканях хорошо известна (Poli,1998; Diamond et al.,2000; Musikacharoen et al.,2001; Ramji and Foka,2002; Cassel and Nord,2003) и накапливаются доказательства участия C/EBPs в легочных болезнях (Halmos et al.,2002; Roth et al.,2004; Didon et al.,2005,2010,2011; Binia et al.,2011). Ранее мы наблюдали пониженную активность C/EBPβ у курильщиков с chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (Didon et al.,2005), также как и снижение экспрессии C/EBPβ у курильщиков сигарет (Didon et al.,2011), продемонстрировав роль C/EBPs в патогенезе COPD. Кроме того, дефектная передача сигналов C/EBPα ассоциирована с созреванием нефункциональных легких (Basseres et al.,2006; Berg et al.,2006; Martis et al.,2006; Didon et al.,2010), напоминая незрелость легких у преждевременно рожденных детей с бронхопульмональной дисплазией, которая может вносить позднее вклад в обструктивные симптомы в дальнейшей жизни (Vrijlandt et al.,2006; Lum et al.,2011). Соответственно, мы также установили, что жизнеспособные Cebpa&^Delta;LE мыши, которые доживают до взрослой стадии, спонтанно формируют множественные гистопатологические признаки COPD (Didon et al.,2010). Несмотря на убедительные доказательства участия C/EBP в созревании и патологии легких, всё ещё неизвестно, как разные C/EBP факторы взаимодействуют и вносят вклад в физиологию легких.

В данном исследовании мы установили, что нокдаун CEBPB в первичных эпителиальных клетках человека усиливает экспрессию CEBPA, подтверждая. что потеря C/EBPβ может быть функционально скомпенсирована за счёт увеличения уровней C/EBPα и что это может объяснить повышенные уровни гена, регулируемого с помощью C/EBP, SCGB1A1 в этих клетках. Чтобы исследовать далее возможные перекрывающиеся роли C/EBPα и C/EBPβ , были получены мыши Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE и оценена роль этих транскрипционных факторов в легочном эпителии во время saccular стадии развития легких. Мы предположили, что C/EBPs обладают способностью функционально замещать др. др. и что C/EBPβ регулирует экспрессию легочных генов, ассоциированных с развитием легких в отсуствие C/EBPα .

C/EBPα и C/EBPβ впервые обнаруживаются на поздней псевдожелезистой (pseudoglandular) стадии на E15.5 и широко распространенная экспрессия C/EBPα не обнаруживается вплоть до канальцевой (canalicular) стадии (E17.5). В соответствии подтверждена эта роль C/EBPα в поддержании терминальной дифференцировки эпителиальных клеток (Berg et al.,2006). Т.о., в данном исследовании, мыши, забитые на ст. E18.5, временная точка, на которой любые эффекты делеции C/EBPα и C/EBPβ на развитие легких легко определяются. Промотор SFTPC, использованный в данном исследовании, активен с E10 и это является временно точкой экспрессии во всем легочном эпителии (Okubo and Hogan,2004), делая промотор идеальным для изучения эффектов делеции C/EBP на легочное развитие, по сравнению, напр., с промотором Scgb1a1, активность которого впервые обнаруживается в тесной временной близи с экспрессией C/EBPα , и также обладает экспрессией, ограниченной будущим эпителием воздушных путей (Perl et al.,2005; Berg et al.,2006). Мы установили, что Cebpa^ΔLE; Cebpb&^Delta;LE мыши фенокопируют Cebpa^ΔLE мышей и обнаруживают более существенное сходство с гистопатологией, ранее наблюдаемой, как доказательство незрелости легких и увеличенных воздушных пространств (Didon et al.,2010). Полный анализ результатов делеции C/EBPα и C/EBPβ на морфогенез ветвления нуждается однако в оценке легочного фенотипа во время pseudoglandular и canalicular периода развития легких. Наши результаты подтвердили, что C/EBPβ вносит незначительный или не вносит вклад в морфогенез ветвления легких, если сохраняется экспрессия C/EBPα . Более того, при некоторых условиях C/EBPα может функционально замещать C/EBPβ , но не наоборот, это кажется довольно удивительным, поскольку предпочтения в связывании C/EBPs были описаны практически идентичными (Osada et al.,1996). Действительный механизм, лежащий в основе отсутствия реципрокного замещения, неизвестен, однако, это может быть связано со способностью разных C/EBPs димеризоваться с разными транскрипционными факторами при определенных условиях (LeClair et al.,1992; Wang et al.,2001). В противовес некоторым предыдущим исследованиям, которые выявили увеличение клеточной пролиферации у C/EBPα -дефицитных мышей (Basseres et al.,2006; Martis et al.,2006), мы не обнаружили увеличение количества пролиферирующих клеток ни у Cebpa^ΔLE ни у Cebpa^ΔLE; Cebpb?LE мышей. Это, однако, согласуется с нашими более ранними находками (Didon et al.,2010), когда наблюдалась повышенная пролиферация только у взрослых Cebpa^ΔLE мышей. Хотя распределение клеток, экспрессирующих типа II пневмоцитов маркер pro-SP-C, было нерегулярным у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, количество SP-C-экспрессирующих клеток, по-видимому, не было увеличено у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, в противовес Cebpa^ΔLE мышам (Basseres et al.,2006; Didon et al.,2010).

Трансмембранный гликопротеин E-cadherin является критическим дл формирования слипчивых соединений и для интеграции эпителия воздушных путей. E-cadherin обычно экспрессируется на латеральной стороне эпителиальных клеток воздушных путей, при 'jv отсутствует цитоплазматическая экспрессия, а интактная локализация E-cadherin является не только ключом эпителиальной целостности, но и также для процесса морфогенеза ветвления (Hirai et al.,1989; Carayol et al.,2002; Nawijn et al.,2011). E-cadherin в противоположность локализации на клеточной мембране, детектируемой у SFTPC-Cre^- детенышей того же помёта, экспрессируется слабо в цитоплазме Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей. E-cadherin, как полагают, играет роль в дисфункции эпителиального барьера, наблюдаемой у астматиков (Heijink et al.,2007). Нарушение передачи сигналов C/EBP выявляется при воспалительных болезнях легких, затрагивая возможно тем самым функцию эпителиального барьера. Следовательно, данные, представленные в данном исследовании содействуют дальнейшему исследованию взаимоотношений между C/EBPs и E-cadherin в воспаленных воздушных путях.

Механизмы, контролирующие дифференцировку эпителиальных клеток, выстилающих проводящие воздушные пути, чрезвычайно сложны и изучены недостаточно. Дифференцировка разных типов клеток эпителия воздушных путей в целом регулируется аутокринно-паракринно, а также за счет клеточных взаимодействий с последующей активацией различных транскрипционных факторов (You et al.,2004; Li et al.,2009; Tsao et al.,2009). Clara клетки, реснитчатые клетки и слизистые клетки, как полагают, возникают из общего предшественника (Evans et al.,1978; Reynolds et al.,2000; Rawlins et al.,2009; Tompkins et al.,2009), а дифференцировка в зрелые Clara клетки использует ряд транскрипционных факторов (Wang et al.,2010; Oliver et al.,2011), а также передачу сигналов Notch и Wnt (Tsao et al.,2009; Morimoto et al.,2010).Однако мы не нашли доказательств отклонений в передаче сигналов Notch или Wnt у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, которые можно было бы связать с ролью передачи этих сигналов в инициальном предопределении, но не с терминальной дифференцировкой клона клеток Clara, которая начинается непосредственно перед рождением. Передача сигналов Notch необходима на ранней стадии развития легких для детерминации в направлении клона клеток Clara (Morimoto et al.,2010). Т.о., поскольку передача сигналов Notch, по-видимому, не нарушена у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, то наши результаты подтверждают, что клон клеток Clara присутствует в легких Cebpa^ΔLE; Cebpb&^Delta;LE мышей, хотя терминальная дифференцировка видоизменена.

Зрелые клетки Clara характеризуются экспрессией SCGB1A1, секретируемого белка в 10-kDa. SCGB1A1 обладает свойствами иммунного модулятора (Stripp et al.,2000; Zhang et al.,2000), а уменьшение SCGB1A1 наблюдается при легочных болезнях, таких как COPD и бронхопульмональная дисплазия. Т.о., потеря SCGB1A1 может вносить вклад в патогенез этих болезней (Ramsay et al.,2001; Thomas et al.,2010; Tsoumakidou et al.,2010). В противоположность мышам Cebpa^ΔLE мыши Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE обнаруживают тяжело нарушенную экспрессию белка и мРНК SCGB1A1, подтверждая, что имеет место гипоплазия клеток Clara или выстилка недифференцированными клетками Clara проводящих воздушных путей у этих мышей.

C/EBPα и C/EBPβ , как было установлено ранее, регулируют экспрессию SCGB1A1 в легких (Nord et al.,1998; Cassel et al.,2000b). Здесь мы продемонстрировали роль и C/EBPα и C/EBPβ в активации промотора Scgb1a1 in vitro. Синергичная активация SCGB1A1 осуществляется с помощью C/EBP? и с помощью NKX2-1, как было описано другими (Cassel et al.,2002). Экспрессия NKX2-1 и C/EBP? однако сохранялась в проводящих воздушных путях Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, подтверждая, что экспрессия NKX2-1 или C/EBPδ недостаточна для эффективной активации промотора Scgb1a1. Мы полагаем, что активация промотора Scgb1a1 нуждается в NKX2-1 вместе с C/EBPα или C/EBPβ . Поскольку не было выявлено предпочтительных способностей к связыванию разных C/EBPs, то наши результаты указывают на то, что сохранение экспрессии или C/EBPα или C/EBPβ достаточно для экспрессии SCGB1A1 и, следовательно, сохранения дифференцировки клеток Clara, и что C/EBPα и C/EBPβ контролируют судьбы эпителиальных клеток воздушных путей сложным компенсаторным способом. Т.о., эти данные подтверждают предыдущие наблюдения о функциональном перекрывании C/EBPs (Chen et al.,2000; House et al.,2010) и подтверждают, что C/EBPα и C/EBPβ выполняют особенно перекрывающиеся функции , связанные с дифференцировкой эпителиальных клеток воздушных путей, они могут компенсировать один др. и что C/EBPα или C/EBPβ необходимы для детерминации клеток Clara.

Уменьшение экспрессии SCGB1A1 у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей подтверждает, что происходит увеличение недифференцированных клеток Clara со свойствами потенциала предшественников. Мы оценивали экспрессию Sox2, которые ассоциирует с детерминацией клеток предшественников (Gontan et al.,2008) и наблюдали тенденции в направлении увеличения экспрессии у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей по сравнению с SFTPC-Cre? мышами. Предыдущие наблюдения подтвердили пластичность между популяциями эпителиальных клеток что клетки Clara обладают способностями трансдифференцироваться как в реснитчатые, так и слизистые клетки взрослых легких (Evans et al.,1986,2004; Chen et al.,2009; Rawlins et al.,2009).Потеря экспрессии C/EBPα и C/EBPβ , однако не затрагивает популяции реснитчатых клеток. Напротив, немногие слизистые клетки обнаруживаются в проводящих воздушных путях Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, но не у контрольных SFTPC-Cre? мышей, подтверждая, что неспособность к дифференцировке клеток Clara может приводить к нарушению детерминации в клон слизистых клеток, хотя такие события происходят относительно редко.

У Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей слизистые клетки обнаруживаются также в соединениях бронхоальвеолярных протоков, где располагаются pollutant-резистентные клетки Clara. Эти клетки Clara, как полагают, служат в качестве пула предшественников и рассматриваются как пролиферативные клетки внутри терминальных бронхиол (Giangreco et al.,2002). Т.о., регенерационная способность дистальных частей воздушных путей может быть частично нарушена у Cebpa^ΔLE; Cebpb^ΔLE мышей, давая незрелые клетки Clara и эктопическую экспрессию слизь-продуцирующих клеток. Это подчеркивает необходимость дополнительных исследований, изучающих роль C/EBPs в регенерации эпителия воздушных путей. Гиперплазия слизи является патологическим повреждением, ассоциированным в некоторыми хроническими болезнями легких, таких как COPD, астма и муковисцидоз (Bedrossian et al.,1976; Aikawa et al.,1992; Jeffery,2000). Знание источника слизистых клеток представляет поэтому клинический интерес. Исходя из наших результатов, потеря C/EBPs при хронических легочных заболеваниях может вносить вклад в дифференцировку слизистых клеток. Т.о., нарушение передачи сигналов C/EBPβ у курящих с или без COPD (Didon et al.,2005,2011) побуждает к дополнительным исследованиям передачи сигналов C/EBP при эпителиальной дифференцировке. Принимая во внимание высокую смертность Cebpa^ΔLE мышей (Didon et al.,2010), оценка двойной делеции C/EBP во взрослой модели адресует нас к воспалительным заболеваниям легких, преимущественно использующей трансген со специфичным для легких, индуцибельным Cre. Более того, т.к. существуют разные компенсаторные механизмы, если делетированы C/EBPs во время органогенеза по сравнению с гомеостазом в зрелых легких, поэтому результаты делеции C/EBP могут быть отличными от фенотипов, описанных здесь.

In conclusion, disruption of the C/EBPα and C/EBPβ gene together results in a more severe pulmonary phenotype than deletion of C/EBP? alone, and the morphology is characterized by Clara cell immaturity or hypoplasia along with mucus cell hyperplasia. Thus, C/EBPs play partially overlapping roles in lung development and airway epithelial cell differentiation through the regulation of key pulmonary genes.