Развивающийся эмбрион курицы легко наблюдать, создав небольшое отверстие в яйцевой оболочке; расширенное наблюдение также возможно, если полость заклеивается скотчем. Исследователи получили преимущества с помощью этой вмонтированной культуральной системы для биологии развития. Сеть кровеносных сосудов, которая м. наблюдаться у эмбрионов кур со 2-го дня инкубации, является одним из ориентиров энергичного эмбриогенеза. Более того, сердцебиения и последующие эритроциты являются первыми видимыми жизненными функциями циркулярной системы; поэтому многие биологи были привлечены к исследованиям кровеносных сосудов у эмбрионов кур (Noden 1990). Дорсальные аорты являются первыми внутриэмбриональными кровеносными сосудами, возникающими в туловище. Первичная дорсальная аорта представлена парой продольных сосудов, у которых передние концы соединены с формирующимся сердца посредством трактов оттока, а задние части соединены с вителлиновыми артериями на уровне пупка. Помимо их критической функции как самых крупных сосудов для циркуляции крови по телу эмбриона, дорсальная аорта, как известно, является местом вторичного эмбрионального гематопоэза ( Dieterlen-Lievre & Le Douarin 2004; Jaffredo et al. 2005; Adamo & Garcia-Cardena 2012). Дорсальная аорта также действует как сигнальный центр, предоставляющий инструктивные сигналы для индукции дифференцировки поджелудочной железы, миграции клеток нервного гребня и последующей спецификации типов клеток (Reissmann et al. 1996; Schneider et al. 1999; Lammert et al. 2001; Yoshitomi & Zaret 2004; Saito et al. 2012). Более того, дорсальная аорта не напоминает периферические кровеносные сосуды, которые обычно видны в небольших органах и раковых опухолях, по их диаметру, количеству эндотелиальных клеток, включенных в сосуд, и объему кровотока. Исследования образования аорты во время эмбриогенеза предоставляют намеки для понимания механизмов, с помощью которых происходит образование крупных сосудов in vivo .

Overview of the avian model in vascular biology

В 1969, Le Douarin открыл, что клетки перепела и курицы обладают отличающейся морфологией ядра, которая позволяет их отличать с помощью окраски по Фёльгену (Le Douarin 1969, 1973; for a review, see Le Douarin et al. 2008). Эта находка существенно поспособствовала картированию судеб разных тканей при анализе химер перепел-курица, получаемых с помощью микротрансплантаций тканей между этими эмбрионами. Анализ химер перепел-курица позволил овладеть многими фундаментальными идеями и концепциями в иммунологии, гематологии, нейробиологии и биологии развития (Le Douarin 2005; Le Douarin et al. 2008). Разработка специфичных для перепела моноклональных антител, QCPN, осуществленная Bruce и Jean Carlson (доступных в Developmental Studies of Hybridoma Bank (DSHB), University of Iowa, USA), облегчила идентификацию химер с помощью специфичного сигнала с ядер перепела (Selleck & Bronner-Fraser 1995). Видо- и ткане-специфичные антитела были получены несколькими группами (Peault et al. 1983; Tanaka et al. 1990; Aoyama et al. 1992; for reviews, see Noden 1990; Le Douarin et al. 2008). QH1 является специфическим для типа клеток антителом, которое распознает гликозилированный эпитоп в эндотелиальных и гемангиогенных клетках перепела (Pardanaud et al. 1987). Специфическая для сосудистых клеток реактивность QH1 антител облегчает идентификацию эндотелиальных клеток, происходящих перепела донора, в эмбрионах кур; благодаря этому QH1 антитела помогают в установлении происхождения кровеносных сосудов у высших позвоночных (Dieterlen-Lievre & Le Douarin 2004; Jaffredo et al. 2010). Тотальный препарат ex ovo культуральной системы был приспособлен для наблюдений и манипуляций с эмбрионами птиц на ранних стадиях (New 1955; Chapman et al. 2001). Эта культуральная система делает возможными манипуляции с энтодермой, которая расположена в неприступном положении in ovo (Vokes & Krieg 2002; Kimura et al. 2006). Более того, тотальный препарат ex ovo культуральной техники делает возможным прямое наблюдение за поведением флюоресцентно-меченных клеток с помощью замедленной микроскопии изображений (Kulesa & Fraser 1998).

После 1990s, техника, позволяющая доставку генов в развивающиеся эмбрионы птиц, напр., инфекция ретровирусными векторами, электропортацией и sonoporation плазмидных векторов, стала доступна (Yamagata et al. 1994; Itasaki & Nakamura 1996; Funahashi et al. 1999; Momose et al. 1999; Ohta et al. 2003). Эти методы сделали возможным анализ функции генов в развивающихся эмбрионах птиц. Кроме того, картирование судеб, определяемое с помощью химер перепел-курица и флюоресцентного мечения внесли существенный вклад в доставку ДНК конструкций в предшественники тканей мишеней на соотв. стадиях. Tet-on/off индуцибельная векторная система делает возможными манипуляции с обусловленными генами на эмбрионах птиц, позволяя исследователю анализировать широко распространенные гены в клонально перекрывающихся тканях (Hilgers et al. 2005; Watanabe et al. 2007). Сегодня геномная интеграция экзогенных генов с помощью системы транспозонов и манипуляций с тканеспецифическими условными генами осуществима на эмбрионах птиц (Sato et al. 2007; Hou et al. 2011; Yokota et al. 2011). Имеются очень важные инструменты для изучения непосредственных эффектов генетических манипуляций в специфических морфологических событиях с помощью обхода множественных аномалий, вызываемых манипуляциями с ранними генами в широко распространенных предшественниках. Инактивация генов с помощью shRNA и morpholino-oligos может быть также достигнута на эмбрионах птиц, как и на др. модельных животных (Katahira & Nakamura 2003; Sheng et al. 2003). Более того, редактирование генов с помощью zinc-finger nuclease (ZFN) или TAL effector nucleases (TALENs) становится доступным (Miller et al. 2007; Christian et al. 2010; Song et al. 2012). Итак, эмбрионы птиц исторически важны и являются технически пригодной моделью для изучения механизмов, лежащих в основе формирования кровеносных сосудов у высших позвоночных. Эти преимущества побудили ученых генерировать трансгенные линии перепела, которые несут эндотелиальный клеточно-специфичный флюоресцентный репортерный ген (Sato et al. 2010). С помощью этой модельной трансгенной линии, замедленной съемки была подтверждена динамичная природа поведения эндотелиальных клеток во время развития.

Dorsal aorta formation in the avian embryo

Нисходящая часть дуги аорты является крупнейшим кровеносным сосудом в туловище. Зрелая нисходящая часть дуги аорты состоит из эндотелиальных клеток (ECs), окруженных толстым слоем сосудистых гладкомышечных клеток (vSMCs) и фибробластов, внедренных в внеклеточный матрикс (ECM) наружного слоя (Jain 2003; Jaffredo et al. 2010). Эта структура, в отличием от небольших капилляров, обеспечивает эластичность и устойчивость нисходящей части дуги аорты и делает возможным осуществление специализированных функций, таких как функционирование в качестве центрального сосуда, воспринимающего кровяное давление из сердца. Дорсальная аорта является эмбриональным предшественником нисходящей аорты. Появляющаяся дорсальная аорта возникает из двух отдельных тяжей на ст. по Hamburger-Hamilton (HH) 8 (Hamburger & Hamilton 1992) у эмбрионов птиц (Fig. 1) (Pardanaud et al. 1987; Coffin & Poole 1988). В смысле паттерна распределения QH1-позитивные клетки показывают, что первичная дорсальная аорта не является сплошной структурой в самом начале. Эти QH1-позитивные клетки являются в основном ECs, в соответствии с анализом экспрессии VE-cadherin, дефинитивного EC маркера, на той же самой ст. (GEISHA ID: Cadherin-5) (Bell et al. 2004). Предварительно дорсальная аорта развивается, имея сосудистый вид в течение нескольких часов, на ст. HH 10 (E1.5). Передние концы дорсальной аорты соединены с трактами оттока, а задние концы постепенно удлиняются в направлении хвоста путем соединения с сосудистыми сплетениями в спланхнической мезодерме. Вскоре после этого сердцебиения становятся заметными около HH ст. 10-11, может наблюдаться циркуляция кровяных клеток в дорсальной аорте на HH ст. 12 (early E2). Сосудистое сплетение, которое связано с дорсальной аортой, ремоделируется в вителлиновую артерию после того, как происходит динамическое слияние и/или уменьшение сосудов на проспективном уровне пупка (le Noble et al. 2004). Т.о., устанавливается сосудистая сеть в туловище.

Figure 1. Dynamic changes in dorsal aorta patterns in quail embryos. (A) Frontal views of developing dorsal aortae in HH stage 8 (a), 9 (b), 10 (c), and 13 (d) quail embryos detected by QH1-antibody staining (green signals). Scale bar, 100 µm. (B) Cross-sectional views of QH1-antibody stained quail embryos. Nascent dorsal aortae arise in the lateral regions as two cords of endothelial cell masses (a), and subsequently remodels into a lumen structure within a few hours (b). These bilateral positions of the dorsal aortae shift medially underneath the somite after a few hours (c). Then, the medial edges of the dorsal aorta reach the midline (d), and two tubes of the dorsal aortae eventually fuse into a single vessel at the midline (e). Scale bar, 50 µm.

Первичная дорсальная аорта располагается под латеральной пластинкой мезодермы и постепенно меняет свое положение с латерального на медиальное и в конечном итоге сливается с др. дорсальной аортой с противоположной стороны; это приводит к формированию одиночного крупного кровеносного сосуда по срединной линии (Fig. 1) (Wiegreffe et al. 2007; Garriock et al. 2010). Эти с латерального на медиальное и из двух в одиночный сосуд переходы законсервированы у эмбрионов амниот. У эмбрионов мышей пара возникающих дорсальных аорт наблюдается на ст. E8.0, а слияние по срединной линии начинается около E9.5 спереди (Strilic et al. 2009). У эмбрионов черепах (Pelodiscus sinensis) дорсальная аорта очень позожа на таковую эмбрионов кур на соотв. ст. (Nagashima et al. 2005). У эмбрионов амниот кардинальные вены также возникают как два отдельных сосуда вдоль боковой стороны сомитов позднее, чем дорсальная аорта и поддерживаются как симметричные сосуды в течение нескольких дней (Bellairs & Osmond 2005). У эмбрионов рыбок данио дорсальная аорта и задние части кардинальных вен формируются как одиночный сосуд с самого начала (Jin et al. 2005; for a review, see Swift & Weinstein 2009). Следовательно, процесс формирования крупных кровеносных сосудов туловище отличается между эмбрионами амниот и не амниот.

The two different origins of dorsal aorta endothelial cells

Спланхническая мезодерма причастна в качестве первичного источника ECs дорсальной аорты (Poole & Coffin 1989). Ангиогенный потенциал спланхнической мезодермы подтверждается экспрессией клеточного маркера эндотелиальных/гематопоэтических предшественников, Scl/Tal1 (Drake et al. 1997; Minko et al. 2003). Анализ замедленной съемки после пульсового мечения Cy3-QH1 эмбрионов перепела продемонстрировал, что ECs, которые мигрируют из области латеральной пластинки, участвуют в формировании первичной дорсальной аорты (Fig. 2A) (Rupp et al. 2004). Анализ химер перепел-курица, проведенный Pardanaud et al. продемонстрировал, что ECs дорсальной аорты происходят из двух отдельных клонов (Pardanaud et al. 1996). Происходящие из сомитов ECs в основном распространяются в верхнюю пластинку (roof), тогда как происходящие из спланхнической мезодермы ECs распространяются в дно дорсальной аорты (Fig. 2B,C). Анализ картирования карт показал, что эндотелий дорсальной аорты имеет два разных источника и чётко компартментализован на происходящий из сомитов roof и происходящий из спланхнической мезодермы floor регионы. Участие происходящих из сомитов клеток в эндотелии дорсальной аорты постоянно обнаруживается в др. исследованиях по картированию судеб сомитной и presomitic mesoderm (PSM) с помощью мечения флюоресцентной окраской (Stern et al. 1988) и на химерах перепел-курица (Wilting et al. 1995; Klessinger & Christ 1996). Подобно птичьим эмбрионам сомиты мышей обладают потенциалом продуцировать ECs для дорсальной аорты (Ambler et al. 2001; Esner et al. 2006). развивающаяся дорсальная аорта существенно увеличивается в диаметре во время латерально-медиальной миграции, тогда как экспансивная пролиферация клеток предсуществующих ECs в дорсальной аорте не наблюдается (Benedito et al. 2008). Принимая во внимание такой не пролиферативный рост ранней дорсальной аорты, рекрутирование новых ECs из соседней ангиогенной мезодермы является вероятным. В самом деле, детальное картирование судеб каждой дорсолатеральной, медиолатеральной и вентральной части сомита продемонстрировало, что индивидуальные компартменты предоставляют ECs ближайшим кровеносным сосудам, в соответствии со своим положением в сомите (Wilting et al. 1995). Это указывает на то, что вентральная часть сомита скорее, чем дорсальная часть, является преимущественным источником эндотелия дорсальной аорты.

Figure 2. The two different origins of dorsal aorta endothelial and vascular smooth muscle cells. Schematic illustration depicting cross-sectional views of the trunk region in avian embryos. (A) The lateral plate (pink) is the first source of endothelial cells (ECs) for the primary dorsal aortae (red). Tal1/Scl-expressing hemangioblasts and/or ECs in the ventral part of the lateral plate (prospective splanchnic mesoderm) are implicated as the origins of the dorsal aorta endothelium (Drake et al. 1997). (B) Throughout the lateral-to-medial translocation of the dorsal aorta, the roof region is proximal to the somite (sky blue). The somite provides ECs to the dorsal aorta (blue) (Wilting et al. 1995; Pardanaud et al. 1996). (C) The apparent lineage difference between roof and floor ECs in the dorsal aorta. The distribution pattern of somite- and splanchnic mesoderm-derived cells in roof and floor ECs, respectively, is transient (Jaffredo et al. 1998). (D) Floor ECs undergo transdifferentiation into hematopoietic cells (red dots) after dorsal aorta fusion at the midline (Jaffredo et al. 1998). These cells colonize definitive hematopoietic organs after transdifferentiation. (E) Floor ECs of the dorsal aorta are eventually replaced by somite-derived cells (Pouget et al. 2006). Participation of vascular smooth muscle cells (vSMCs) occurs behind the endothelium formation. Splanchnic mesoderm and sclerotome provide vSMCs underneath the floor and over the roof of the dorsal aorta, respectively. Floor vSMCs derived from the splanchnic mesoderm are eventually replaced by sclerotome-derived cells (Wiegreffe et al. 2007; Pouget et al. 2008).

Pardanad et al. отметили, что происходящие из спланхнической мезодермы ECs формируют гематопоэтические кластеры в донной части аорты (Fig. 2D) (Pardanaud et al. 1996). Когда Ac-LDL-DiI был инъецирован в циркуляцию крови эмбрионов кур, то ECs специфически метились с помощью Ac-LDL-DiI посредством эндоцитоза. Используя эту технику, может быть проанализирована судьба ECs, выстилающих дорсальную аорту у эмбрионов птиц (Jaffredo et al. 1998). На дне аорты меченные ECs формируют кластеры, которые позитивны в отношении гематопоэтического клеточного маркера, CD45, и негативны в отношении EC маркера, vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR2) (Jaffredo et al. 1998). Это служит прямым доказательством, подтверждающим переход ECs дорсальной аорты в гематопоэтические клетки. Более того, расширенное отслеживание клонов выявило, что ECs, происходят из спланхнической мезодермы (Fig. 2E) (Pouget et al. 2006). Т.о., вполне возможно, что ECs, происходящие из спланхнической, подвергаются эндотелиально-гематопоэтическому переходу (Pardanaud et al. 1996; Jaffredo et al. 1998; Pouget et al. 2006; for a review, see Jaffredo et al. 2010). Следовательно, сомиты определенно являются источником ECs дорсальной аорты. Более того, помимо дорсальной аорты сомитные ECs широко внедряются в кардинальные вены, межсегментные сосуды (ISVs), спинальную васкулатуру, стенку тела, и сосуды зачатков конечностей (Wilting et al. 1995; Pardanaud et al. 1996; Ambler et al. 2001; Pouget et al. 2006).

Somitic cell contribution to the dorsal aorta is regulated by Notch

Сомиты, как известно, дают ткани скелетных мышц во взрослом теле посредством дерматома, миотома и склеротома (Aoyama et al. 2005). Регуляторные механизмы, лежащие в основе дифференцировки сомитов в эти ткани хорошо изучены на молекулярном уровне ( Buckingham & Vincent 2009); однако наше понимание вклада сомитных клеток в дорсальную аорту ещё не дошло до механизмов молекулярного уровня. Передача сигналов Notch обеспечивает сигнальную трансдукцию между соседними клетками путем взаимодействий между трансмембранным рецептором, Notch (Notch1-Notch4) и трансмембранными Notch лигандами Delta-like (Dll1-Dll4) и Jagged (Jag1 и Jag2, также известны как Serrate1 м Serrate2 у кур). Потеря компонентов передачи сигналов Notch вызывает два основных тяжелых дефекта в формировании кровеносных сосудов и сегментации сомитов у эмбрионов позвоночных на ранних стадиях (for reviews, see Gridley 2007; Lewis et al. 2009). Мутантные эмбрионы мышей, несущие только один из нескольких недостатков передачи сигналов Notch, погибают на ранних стадиях развития из-за сосудистых дефектов; поэтому, чтобы понять функции передачи сигналов Notch на более поздних стадиях, необходимы исследования обусловленной активации и инактивации генов. Активация Notch в клетках вызывает экспрессию нижестоящего семейства генов Hes/hairy. Анализ гибридизации In situ генов Hes/hairy иногда позволяет идентификацию Notch-активированных тканей; , однако, в случае ПНС Hes/hairy транскрипты быстро дестабилизируются в результате осциллирующих механизмов передачи сигналов Notch (for a review, see Pourquie 2011). Чтобы картировать Notch-активируемые клетки, стабильная Notch-чувствительная флюоресцентная репортерная плазмида вносилась в развивающиеся эмбрионы кур с помощью электропортации (Sato et al. 2008). Флюоресцентные репортерные сигналы были обнаружены в задней половине каждого сомита и в конечном счете оказывались локализованными в эндотелии дорсальной аорты. Эти Notch-активируемые клетки в дорсальной аорте были также подтверждены, как происходящие из сомитов, с помощью гомотопических трансплантаций Notch репортер экспрессирующих сомитов в эмбрион хозяин, не подвергнутый электропортации (Sato et al. 2008). Более того, избыточная экспрессия постоянно активной формы Notch1 в сомит вызывала избирательную миграцию Notch-активированных клеток в дорсальную аорту. В этом исследовании, чтобы избежать гиперактивации Notch в клоне, перекрывающемся с ПНС, экспрессия постоянно активной формы Notch индуцировалась после формирования сомитов с помощью техники манипуляции с Tet-on conditional геном (Sato et al. 2007; Watanabe et al. 2007). В соответствии с хорошо известным процессом замещение EC с помощью клеток, происходящих из сомитов (Pouget et al. 2006), Notch-активированные клетки первоначально локализовались в верхней части дорсальной аорты и затем обнаруживались как в верхней, так и нижней части на более поздних стадиях (Sato et al. 2008). Такой избирательный вклад Notch-активированных соматических клеток в дорсальную аорту показывает, что передача сигналов Notch вызывает дифференцировку соматических клеток в клетки эндотелиальных предшественников (Fig. 3C). Dll4- и/или Serrate1-экспрессирующая дорсальная аорта располагается проксимальнее к вентральной поверхности сомитов, тогда как Dll1 экспрессируется в задней половине каждого сомита (Myat et al. 1996; Palmeirim et al. 1998; Nimmagadda et al. 2007a). Однако, какой из этих лигандов ответственен за активацию Notch в сомитах, остается неизвестно. Дефектное образование дорсальной аорты обусловлено аберрантной избыточной пролиферацией и избыточной миграцией ECs, было описано у Dll4-нулевых мутантных эмбрионов мышей (Benedito et al. 2008). Напротив, EC-специфическая делеция Serrate1 гена гомолога, Jagged1, у эмбрионов мышей не приводило к дефектам образования дорсальной аорты, но служило причиной неспособности вносить вклад в сосудистые гладкомышечные клетки (Fig. 3D) (High et al. 2008). Т.о., Jagged1/Serrate1 в дорсальной аорте вряд ли являются лигандами, ответственными за индукцию дифференцировки EC из сомитов.

Figure 3. Vascular cell fate specification by Notch signaling. (A) Specification of capillary tip cells by Notch activation. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) secreted from hypoxic tissue guides sprouting angiogenesis of capillary blood vessels. VEGFR2/Flk1 activation by VEGF-A binding induces Dll4 expression in prospective tip cells followed by Notch activation in adjacent cells (prospective stalk cells). Notch activation leads to upregulation of VEGFR1/Flt1 and downregulation of VEGFR2/Flk1. Since VEGFR1/Flk1 functions as a decoy receptor for the VEGF-A ligand, activation of the VEGF signal is prevented in stalk cells, thereby restricting VEGF-A-induced sprouting behavior to tip cells. This model is based on the patterning mechanisms of mouse retinal vasculature and zebrafish intersegmental blood vessels (ISVs) (Roca & Adams 2007; Herbert & Stainier 2011). (B) Arterial EC specification in zebrafish embryos. Schematic cross-sectional views of the trunk region at 18 and 30 h postfertilization (hpf). A common progenitor of endothelial and hematopoietic cells, termed intermediate cell mass (ICM), is located underneath the notochord at 18 hpf (left). VEGF-A, secreted by adjacent somites, induces Notch5 gene expression in the dorsal part of the ICM, promoting ephrinB2 expression. ephrinB2-expressing cells become arterial ECs, while ventral ICM cells take on a venous EC fate (Lawson et al. 2002). (C) Dorsal aorta EC differentiation from somites in avian embryos. Notch activation induces differentiation of somitic cells into dorsal aorta ECs. Migration of endothelial progenitor cells from the somite toward the dorsal aorta requires downstream EphrinB2 function (Sato et al. 2008). (D) Induction of vSMC differentiation by interaction with dorsal aorta ECs. The presence of Jag1 on ECs induces vSMCs through Notch2 and Notch3 activation (High et al. 2008; Liu et al. 2009; Wang et al. 2012). ICM, intermediate cell mass; DA, dorsal aorta; PCV, posterior cardinal vein; EC, endothelial cell; vSMC, vascular smooth muscle cell.

Домен экспрессии EphirnB2 в задней половине сомита, как было установлено, перекрывается с доменом активного Notch (Sato et al. 2008). Фенотипы потери функции компонентов передачи сигналов Notch у эмбрионов мышей и рыбок данио ассоциированы с подавлением EphrinB2 в аортальных сосудах; т.о., EphrinB2, как полагают, является нижестоящим генетическим компонентом передачи сигналов Notch (Fig. 3B) (Lawson et al. 2001; Krebs et al. 2004; Grego-Bessa et al. 2007). Важно, что вклад сомитных клеток в эндотелий дорсальной аорты за счет активации Notch ингибируется, когда совместно электропортируется EphrinB2 shRNA. Следовательно, EphrinB2, как полагают, является нижестоящим игроком на пути передачи сигналов Notch, который регулирует миграцию сомитных клеток (Fig. 3C) (Sato et al. 2008). Эмбрионы мыши, несущие EC-специфическую избыточную функцию Notch аллелей, обнаруживают более крупную дорсальную аорту и маленькие кардиальные вены, тогда как эмбрионы, несущие мутации потери функции Notch, обладают маленькой дорсальной аортой и крупными кардинальными венами (Kim et al. 2008). Т.о., передача сигналов Notch в эндотелии контролирует баланс в размерах сосудов между дорсальной аортой и кардинальными венами. Активация передачи сигналов Notch происходит последовательно в сомитах и ECs и тем самым действует, чтобы способствовать формированию дорсальной аорты.

Функции передачи сигналов Notch в развитии сосудов было подтверждено на клеточном уровне, в частности, в модели капиллярных верхушечных (tip) клеток (Fig. 3A) (for reviews, see Roca & Adams 2007; Siekmann et al. 2008; Herbert & Stainier 2011). Верхушечные клетки обычно наблюдаются вокруг ведущих краев врастающих кровеносных сосудов в инициальной фазе сосудистого ремоделирования и приводит к врастанию сосудов в направлении наивысших концентраций VEGF. Повышенные количества верхушечных клеток возникают в результате нарушения Dll4, вызывающего формирование аберрантных кровеносных сосудов in vitro и in vivo, подтверждая, что Dll4 регулирует точное количество верхушечных клеток. Экспрессия Dll4 индуцируется с помощью VEGF в верхушечных клетках и это затем активирует Notch рецептор в соседних стебельковых (stalk) клетках. Активация Notch в стебельковых клетках ведет к подавлению VEGFR2 (известного также как Flk1), супрессируя реакцию стебельковых клеток вблизи VEGF. Т.о., передача сигналов Notch играет роль в тонком контроле способной к диффузии передачи сигналов VEGF, чтобы регулировать распространение верхушечных клеток в микрокапиллярном окружении (Roca & Adams 2007; Siekmann et al. 2008; Herbert & Stainier 2011). Наше предыдущее исследование продемонстрировало, что дорсальная аорта испускает привлекающие сигналы клеткам эндотелиальных предшественников в сомитах (Sato et al. 2008). Это дает объяснение, почему гетеротопически трансплантированные ангиогенные ткани вносят вклад обычно в предсуществующий эндотелий дорсальной аорты, не вызывая образования вторичной дорсальной аорты в месте трансплантации (Pardanaud et al. 1996) или почему Notch-активируемые клетки формируют эктопическую дорсальную аорту внутри сомита (Sato et al. 2008). Сходным образом, механизм спецификации верхушечных клеток вызывается с помощью взаимодействия VEGF-Notch, передача сигналов Notch может взаимодействовать с некоторыми диффундируемыми привлекающими молекулами, секретируемыми из дорсальной аорты, регулируя тем самым соотв. популяцию чувствительных сомитных клеток, которым предназначено стать ECs. Фактически, молекулярная природа привлекающего сигнала от дорсальной аорты это др. важный вопрос, которые остается без ответа.

A notochord-derived BMP antagonist regulates the laterality of the primitive dorsal aorta

Срединная линия первоначально лишена сосудов вплоть до того, как дорсальная аорта мигрирует из латеральных регионов. Если хорда устранена из эмбрионов перепела на ранних ст., то кровеносные сосуды формируются несоответствующим образом вокруг срединной линии (Reese et al. 2004). Напротив, эктопическая трансплантация хорды в параксиальную мезодерму приводит к предотвращению образования сосудистого сплетения вокруг вторично трансплантированной хорды. Следовательно, хорда, как полагают, действуют против образования кровеносных сосудов (Fig. 4A) (Reese et al. 2004). Хорда экспрессирует bone morphogenetic protein (BMP) антагонисты Noggin и Chordin во время формирования дорсальной аорты (Reese et al. 2004; Garriock et al. 2010). Интересно, что имплантации Noggin- или Chordin-секретирующих клеток воспроизводит эффекты эктопической трансплантации хорды в отсутствие ECs (Bressan et al. 2009). Напротив, имплантация BMP4-секретируемых клеток в срединную линию индуцирует образование эктопического сосудистого сплетения into вокруг клеток подобно эффекту, наблюдаемому у эмбрионов с удаленной хордой (Reese et al. 2004). Экспрессия BMP1, -2 и -4 мРНК может быть обнаружена в латеральной пластинке мезодермы, энтодерме и дорсальном крае нервной пластинки у ранних эмбрионов (Reese et al. 2004). BMPs , секретируемые из этих тканей, способствуют формированию латеральных кровеносных сосудов, тогда как секреция Chordin из срединной линии негативно влияет на формирование кровеносных сосудов, ингибируя дифференцировку ангиобластов, сборку EC и слияние дорсальных аорт (Bressan et al. 2009).

Figure 4. Dorsal aorta patterning by diffusible molecules. (A) Diagram showing blood vessel promoting- (blue arrows) and inhibiting- (green bars) interactions between tissues in amniote embryos. Shh, widely secreted from the endoderm, is dispensable for EC differentiation and assembly events that lead primary dorsal aorta formation (Vokes et al. 2004). Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), which has a broad tissue distribution, is another diffusible factor that is essential for primary dorsal aorta formation (Argraves et al. 2002). Secretion of SDF1/Cxcl12 from the endoderm acts as a chemo-attractant, directing angioblast migration into sites of primitive dorsal aorta formation (Katsumoto & Kume 2011). Despite the broad distribution of these vasculature-promoting molecules, axial and paraxial regions (notochord and somite levels, respectively) are prevented from acquiring ECs by notochord via BMP antagonists, Noggin and Chordin (green bars in upper panel) in early stages (Reese et al. 2004; Bressan et al. 2009). Lateral-to-medial dorsal aorta migration is also prevented as long as Chordin is expressed in the notochord (green bars in middle panel). After Chordin mRNA is downregulated, bilateral dorsal aortae migrate toward the midline (Garriock et al. 2010). VEGF-A secreted from the neural tube induces EC differentiation in the somite (Hogan et al. 2004). BMP4, FGFs, and Wnts in the neural tube and lateral regions of the somite induce VEGFR2/Quek1 expression in nearby somites (Nimmagadda et al. 2007b). (B) Diffusible molecules implicated in dorsal aorta patterning in avian embryos (Argraves et al. 2002; Reese et al. 2004; Vokes et al. 2004; Bressan et al. 2009; Garriock et al. 2010; Katsumoto & Kume 2011). EC, endothelial cells.

Garriock et al. (2010) установили, что экспрессия мРНК Chordin в хорде снижает направленность спереди кзади для слияния дорсальных аорт. В соотв. с этой передне-задней волной ослабления мРНК Chordin, негативное влияние хорды на дорсальную аорту исчезает и, напротив, хорда начинает облегчать слияние дорсальных аорт с передней стороны (Garriock et al. 2010). В целом, BMP антагонисты пространственно ограничивают активацию передачи сигналов BMP за счет физического соединения с BMP лигандами во внеклеточном пространстве, предупреждая тем самым связывание BMP лигандов с рецепторами. Генетические исследования показали, что VEGF и Sonic hedgehog (Shh) являются морфогенами, как известно, участвующими в формировании кровеносных сосудов; эти гены также экспрессируются в хорде. Ингибирование передачи сигналов VEGF и Shh у эмбрионов перепела ведет к неспособности дорсальных аорт мигрировать в направлении срединной линии сходным образом, как при избыточной экспрессии Chordin, демонстрируя, что VEGF и Shh важны для транслокации дорсальных аорт (Garriock et al. 2010). Более того, один из VEGF рецепторов, VEGFR2 (также известен как Quek1 у перепелов) , скорее всего, действует ниже передачи сигналов BMP4 (Nimmagadda et al. 2005; Ben-Yair & Kalcheim 2008; Suzuki et al. 2008). Роль передачи сигналов BMP в формировании дорсальной аорты, как полагают, являются разрешающей. Напр., после редукции Chordin, активация передачи сигналов BMP позволяет латерально расположенным ECs воспринимать инструктивные сигналы от срединной линии (Garriock et al. 2010).

Involvement of Hh signaling in dorsal aorta formation

Hedgehog (Hh) это способный к диффузии морфогенетический лиганд, передающий сигналы между тканям. позвоночных имеют 3 гомологичных гена, Sonic, Indian и Desert hedgehog (Shh, Ihh и Dhh, соотв.). Вовлечение передачи сигналов hedgehog в формирование кровеносных сосудов описано на разных моделях животных (Byrd & Grabel 2004; Nagase et al. 2008). Ihh, экспрессируется в висцеральной энтодерме желточного мешка, необходим для собственно ангиогенеза в сосудистой система желточного мешка эмбрионов мышей (Dyer et al. 2001; Byrd et al. 2002). Целенаправленное разрушение Hh рецептора, Smoothened (Smo), также приводит к тяжелым деформациям сосудов желточного мешка и дорсальной аорты (Byrd et al. 2002; Vokes et al. 2004). Поскольку передача сигналов Hh действует часто в различных тканях в ходе развития, то обусловленные (conditional) пертурбации передачи сигналов Hh необходимы для выяснения её роли в специфические временные моменты и в специфических тканях. Исследования обусловленных потерь функции передачи сигналов Hh были предприняты с использованием широкого спектра Hh ингибитора, cyclopamine, у эмбрионов птиц и мышей. Воздействие сyclopamine вызывает неспособность слияния дорсальных аорт (Vokes et al. 2004; Nagase et al. 2006b; Moran et al. 2011), а использование специфических антител простив Shh (5E1) у эмбрионов перепела после образования первичных дорсальных аорт, также приводит к неспособности слияния дорсальных аорт (Kolesova et al. 2008). В противоположность этому воздействию антагонистов усиление передачи сигналов Hh с помощью агониста Smo, SAG, ведет к увеличению дорсальной аорты у эмбрионов перепела (Moran et al. 2011).

Экспрессия Shh в хорде законсервирована между эмбрионами позвоночных. В предлагаемой модели формирование дорсальной аорты у эмбрионов рыбок данио Shh, секретируемый тканями срединн6ой линии, индуцирует экспрессию VEGF в сомитах (Lawson et al. 2002). Это способствует активации сигналов Notch в проспективных ECs дорсальной аорты, которые располагаются на дорсальной стороне intermediate cell mass (ICM). В конечном счете, активируется экспрессия ephrinB2 в дорсальной части ICM, чтобы наделить качественными особенностями артериальных EC. Этот каскад в точности устанавливает, что ICM клетки в тесной близи к хорде будут становиться артериальными ECs (Fig. 3B) (Lawson et al. 2002). У рыбок данио моделирующих спецификацию дорсальной аорты, Shh, секретируемый хордой. действует опосредованно через VEGF; Однако во время более ранних стадий, Shh действует непосредственно на латерально-медиальную миграцию ангиобластов (Gering & Patient 2005; for reviews, see Hogan & Bautch 2004; Swift & Weinstein 2009). У модельных эмбрионов птиц Shh экспрессируется не только в хорде, но и также в энтодерме, а его рецепторы, Patched1, Patched2 (Ptc1, Ptc2) и Smo, экспрессируются в ECs развивающейся дорсальной аорты, обеспечивая непосредственную сигнальную трансдукцию Shh между энтодермой и дорсальной аортой (Vokes et al. 2004). Энтодерма всегда приходит в контакт с ECs мигрирующей дорсальной аорты вплоть до достижения кооперации сосудистых гладкомышечных клеток и эта ткань играет важную роль в формировании тубулярного эндотелия у эмбрионов лягушек и перепела (Vokes & Krieg 2002). Неспособность к формированию сосудистых сплетений, вызываемая хирургическим удалением соседней энтодермы, может быть устранена имплантацией Shh-diffusible бусинок (Vokes et al. 2004). Более того, в той же серии экспериментов удаления энтодермы и имплантации бусинок паттерн сосудистых сплетений, наблюдаемый после воздействия по восстановлению с помощью VEGF, был полностью отличным от Shh-индуцированного паттерна (Vokes et al. 2004). Поскольку Shh индуцирует образование капиллярной сети in vitro независимо от VEGF, то Shh может действовать непосредственно на ECs, а энтодерму можно рассматривать как существенный источник Shh, который влияет на формирование дорсальной аорты у эмбрионов птиц. Хотя, как известно, Hh действует или как митоген или фактор жизнеспособности в др. тканях, количество ECs в дорсальной аорте не обнаруживает зависимости от ингибирования или активации Hh пути (Vokes et al. 2004; Moran et al. 2011). Более того, воздействие cyclopamine у эмбрионов кур и мышей вызывает подавление экспрессии BMP4, VEGF и VEGFR-2 (Nagase et al. 2006a; Moran et al. 2011), указывая тем самым, что передача сигналов Hh также действует ка вышестоящий регулятор этих генов, связанных с кровеносными сосудами, подобно хордовому Shh у эмбрионов рыбок данио. Зависимые от стадии разные сосудистые фенотипы у Hh-ингибированных эмбрионов подтверждают, что передача сигналов Hh является широко используемым механизмом, влияющим на разные аспекты формирования кровеносных сосудов, включая слияние дорсальных аорт.

When, where, and how does VEGF affect dorsal aorta formation?

Фактор роста сосудистого эндотелия давно известен как ключевой регулятор формирования кровеносных сосудов. Мыши, лишенные компонентов передачи сигналов VEGF, обнаруживают различные дефекты развития, включая снижение числа ECs и неспособность формировать функциональную сосудистую сеть (Herbert & Stainier 2011; Eichmann & Simons 2012). В результате ранней гибели дефицитные по передаче сигналов VEGF эмбрионы мышей, подтверждение функции передачи сигналов VEGF в формировании специфических кровеносных сосудов затруднительно. В регионах туловища эмбрионов перепела и мыши, VEGF-A широко экспрессируется в различных тканях, включая хорду, энтодерму, нервную трубку и сомиты, а VEGFR2/Flk1/Quek1 экспрессируется в кровеносных сосудах и сомитах (Eichmann et al. 1993; Jaffredo et al. 1998; Hogan et al. 2004; Nimmagadda et al. 2004; Vokes et al. 2004; Ema et al. 2006; Garriock et al. 2010; Moran et al. 2011).

Применение VEGF-A к эмбрионам перепела вызывает несоответствующую неоваскуляризацию обычно в областях, лишенных сосудов, а избыточное слияние сосудов приводит к возникновению более крупной аорты, демонстрируя, что передача сигналов VEGF строго ускоряет формирование кровеносных сосудов in vivo (Drake & Little 1995; Vokes et al. 2004). Напротив, VEGF антагонист, sFlt1 (растворимая форма VEGFR1/Flt1), ингибирует сборку ангиобластов в первичные дорсальные аорты (Argraves et al. 2002). Функции передачи сигналов VEGF signaling в формировании сосудистой сети сегодня хорошо известны и выяснены механизмы, с помощью которых Notch-, Eph- и Neuropilin-обеспечиваемые пути модулируют исход передачи сигналов VEGF на поведение EC (Herbert & Stainier 2011; Eichmann & Simons 2012).

У эмбрионов рыбок данио и Xenopus VEGF-A обнаруживается вблизи аксиальной или параксиальной ткани и участвует в миграции ангиобластов и последующем образовании дорсальной аорты (Fouquet et al. 1997; Cleaver & Krieg 1998; Lawson et al. 2002; for reviews, see Swift & Weinstein 2009). У эмбрионов рыбок данио VEGF-A экспрессируется вентромедиальной областью сомита (Liang et al. 1998). Это место соответствует склеротому сомитов птиц и млекопитающих. Более того, у эмбрионов мышей условная делеция одиночного аллеля VEGF-A с помощью Collagen2a1-Cre драйвера приводит к аномальному формированию дорсальной аорты, указывая на важность экспрессии сомитного VEGF-A для формирования дорсальной аорты (Haigh et al. 2000). Помимо своей хорошо охарактеризованной роли в нервной трубке VEGF-A, как было установлено, индуцирует дифференцировку EC путем активации VEGFR2 в пресомитной мезодерме (Hogan et al. 2004). Эти происходящие из пресомитной мезодермы ECs привлекаются VEGF-A-экспрессирующей нервной трубкой и в конечном итоге генерируют перинейральное сосудистое сплетение (Fig. 4A) (Hogan et al. 2004; James et al. 2009). У нормальных эмбрионов перепела на стадии образования дорсальной аорты, VEGFR2/Quek1 экспрессируется в дорсолатеральном регионе сомитов (Eichmann et al. 1993; Nimmagadda et al. 2005), соответствующем дорсо-латерально расположенным источникам EC, в отличие от той, что наблюдается в дорсальной аорте (Wilting et al. 1995). Экспериментальное нарушение экспрессии гена VEGFR2/Quek1 в сомитах приводит к редукции кардинальных вен и дорсо-латерально расположенных периферических сосудов, подтверждая, что сомитный VEGR2/Quek1 участвует в формировании латерально расположенных кровеносных сосудов (Nimmagadda et al. 2005; Ben-Yair & Kalcheim 2008). Кстати, вклад VEGR2-экспрессирующих сомитных клеток в формировании эндотелия дорсальной аорты не был подтвержден. Однако было продемонстрировано, что делеция одиночного аллеля VEGF-A у эмбрионов мышей ведет к неспособности формирования дорсальной аорты с просветом (Strilic et al. 2009), а VEGF, как было установлено, регулирует активность Rho-associated protein kinase (ROCK), обеспечивая рекрутирование цитоскелетных молекул, участвующих в образовании просвета сосудов (Strilic et al. 2009). Итак, эти исследования подтвердили. что передача сигналов VEGF может выполнять разные функции в формировании дорсальной аорты и периферических кровеносных сосудов.

Molecular mechanisms of dorsal aorta lumen formation

Недавно были исследованы молекулярные основы образования просвета дорсальной аорты у эмбрионов мышей. Наблюдение за ультраструктурой возникающих ECs дорсальной аорты с помощью ЭМ показало, что первичная дорсальная аорта имеет форму тяжа без просвета, а соседние ECs, находятся в тесном контакте др. с др. посредством VE-cadherin-обеспечиваемых множественных слипчивых соединений (Strilic et al. 2009). Эти слипчивые соединения ремоделируются посредством анти-адгезивных функций CD34-sialomucins, и затем с помощью механизмов protein kinase C (PKC)- и ROCK-обеспечиваемой цитоскелетной реорганизации, способствующих образованию просвета в сосудах (Strilic et al. 2009). Ras-interacting protein1 (Rasip1), специфический для EC регулятор GTPase, супрессирует RhoA и подавляет активность ROCK (Xu et al. 2011). У Rasip1-дефицитных эмбрионов мыши дорсальная аорта имеет тяже-подобную структуру из-за неспособности к реорганизации белков соединений, которые важны для собственно ассоциации EC с окружающим ECM (Xu et al. 2011). Т.о., эти исследования показали, что GTPase-обеспечиваемый механизм регулирует динамические изменения в морфологии EC во время формирования просвета сосудов.

Новая in vitro модель слияния сосудов с одиночным просветом сосудистых сфероидов была установлена в эмбриональной ткани аллантоиса мыши. Эта сосудистая модель содержит как ECs, так и сосудистые гладкомышечные клетки во внутреннем и наружном слоях, соотв. (Fleming et al. 2010). С одиночным просветом сосудистые сфероиды имеют более крупный просвет (приблизительно 400 µm в диаметре), чем обычные in vitro модели микрокапилляров. Когда пара однопросветных сфероидов соприкасается в культуре висящей капли, то эти два сосудистых сфероида сливаются в одиночный сфероид в течение 12 ч (Fleming et al. 2010). Эта упрощенная модель слияния крупных кровеносных сосудов облегчит наше понимание молекулярных и клеточных механизмов слияния дорсальных аорт.

The contribution of smooth muscle cells to the dorsal aorta

vSMCs в дорсальной аорте первоначально возникают из латеральной пластинки мезодермы и покрывают вентральный аспект сливающихся дорсальных аорт у эмбрионов амниот (Wiegreffe et al. 2007, 2009; Wasteson et al. 2008). Анализ химер перепел-курица показал, что клетки склеротома дают vSMCs в верхней части дорсальной аорты, тогда как происходящие из миотомов гладкомышечные клетки не вносят вклада в vSMC (Wiegreffe et al. 2007; Pouget et al. 2008). Интересно, что подобно ECs, происходящие из латеральной пластинки гладкомышечные клетки в конечном итоге замещают происходящие из склеротомов клетки (Pouget et al. 2006, 2008; Wiegreffe et al. 2007). Последовательный вклад происходящих из латеральной пластинки и из сомитов vSMCs в дорсальную аорту наблюдался и у эмбрионов мышей с помощью подходов генетического мечения (Wasteson et al. 2008).

Jag1 на поверхности EC способствует дифференцировке vSMC путем взаимодействия с Notch3 на проспективных vSMCs (High et al. 2008; Liu et al. 2009). Ген Notch3 экспрессируется на высоком уровне в vSMCs, а делеционные Notch3 мутанты обнаруживают дефекты в формировании vSMC во время постнатального созревания артериальных сосудов (Domenga et al. 2004; Liu et al. 2009). Неспособность формировать vSMC во время эмбриогенеза может быть вызвана двойной инактивацией Notch2/Notch3. У таких двойных мутантных эмбрионов мышей образование первичных кровеносных сосудов происходи, но имеет место тяжелый коллапс сосудов позднее благодаря потере vSMCs (Wang et al. 2012). Это указывает на то, что vSMCs важны для стабилизации сосудов и жизнеспособности EC (Fig. 3D). Итак. эти исследования на модельных эмбрионах мышей позволили нам описать механизмы сердечно-сосудистых аномалий при врожденных заболеваниях у человека, которые тесно ассоциированы с такими Jag1 и Notch3 мутациями (Shawber & Kitajewski 2004). Более того, электропортация в клетки сомитов постоянно активной формы Notch1 затрагивает слой гладких мышц вокруг дорсальной аорты, а также эндотелиальный слой (Sato et al. 2008), воспроизводя vSMC-индуцибельную активность Notch2 или Notch3 (Ben-Yair & Kalcheim 2008). Во внеэмбриональных кровяных островках Notch1-активируемые клетки преимущественно дают vSMCs в ответ на передачу сигналов Wnt, предупреждая общие клетки предшественники от выбора судьбы EC (Shin et al. 2009). Последствия активации передачи сигналов Notch варьируют в зависимости от обстоятельств, связанных с морфогеном, напр., путем взаимного общения с сигнальным путем Wnt (Corada et al. 2010; for a review, see Andersen et al. 2012). Человеческий Notch1 впервые был идентифицирован при T-клеточной лейкемии, а передача сигналов Notch также была связана с гематопоэзом (Ellisen et al. 1991; for a review, see Bigas et al. 2010). Во время образования дорсальной аорты и последующего гематопоэза функции передачи сигналов Notch в событиях детерминации реципрокных клеточных судеб осуществляются механизмом или в латерального ингибирования или латеральной индукции среди общих клеток предшественников.

Other molecules implicated in dorsal aorta formation

Foxc2/Mfh1, член семейства helix/forkhead транскрипционных факторов экспрессируется как в склеротоме, так и дорсальной аорте эмбрионов птиц и мышей (Furumoto et al. 1999; Pouget et al. 2008). Двойные нулевые мутации Foxc1 и Foxc2 у эмбрионов мышей вызывают неспособность к нормальному сомитогенезу и формированию кровеносных сосудов (Kume et al. 2001). Foxc2 действует как ключевой регулятор формирования кровеносных сосудов путем контроля транскрипции генов Dll4, CXCR4, Integrinβ3 и Angiopoetin2. Кроме того, Foxc2 действует выше передачи сигналов Notch в сомитах (Kume et al. 2001). Недавнее исследование с использованием мутантных эмбрионов мышей продемонстрировали, что сегрегация экспрессии Pax3 и Fox2 в миотоме и склеротоме, соотв., регулируется с помощью механизма реципрокного подавления между Pax3 и Foxc2 (Lagha et al. 2009). Foxc2 управляет мультипотентными предшественниками в сомитах, приобретающих сосудистые клеточные судьбы, супрессируя мышечные клеточные судьбы. Это подтверждает более высокие уровни Foxc2, позволяющие участвовать сомитным клеткам в ECs и vSMCs дорсальной аорты (Lagha et al. 2009).

SDF1, хемокиновый лиганд , экспрессируется в дорсальной аорте и соотв. сомитах, а его рецептор, CXCR4, экспрессируется на дорсальной стороне сомита (Ohata et al. 2009). хотя избыточная экспрессия CXCR4 способствует миграции сомитных клеток, экспрессирующих CXCR4, в направлении SDF1-экспрессирующих тканей, эти клетки не участвуют в формировании дорсальной аорты (Ohata et al. 2009). На более поздних стадиях SDF1, секретируемый из дорсальной аорты, направляет мигрирующие клетки нервного гребня, которые дают симпатические нейроны и мозговое вещество надпочечников около дорсальной аорты (Saito et al. 2012). У эмбрионов рыбок данио Cxcl12b, рыбий гомолог мышиного SDF1, экспрессируется в энтодерме. Cxcl12b необходим для собственно наведения Cxcr4a-экспрессирующих ангиобластов, которые дают латеральные дорсальные аорты (Siekmann et al. 2009). Как и у эмбрионов рыбок данио, SDF1 в энтодерме наводит ангиобласты у эмбрионов кур (Fig. 4) (Katsumoto & Kume 2011). Ингибирование активации CXCR4 с помощью AMD3100, специфического ингибитора CXCR4, на ранних стадиях (i.e., HH ст. 6, перед образованием дорсальной аорты) приводит к отсутствию дорсальной аорты, указывая тем самым, что SDF1-CXCR4 хемокиновый сигнал действует, чтобы наводить предшественники EC, которые дают дорсальную аорту. Неспособность рекрутировать клетки предшественников дорсальной аорты в окрестности энтодермы влияет на экспрессию Pdx1, маркера поджелудочной железы, в энтодерме. Следовательно, передача сигналов SDF1-CXCR4 обеспечивает реципрокные взаимодействия между клетками предшественниками первичной дорсальной аорты и энтодермой, чтобы инструктировать развитие поджелудочной железы (Katsumoto & Kume 2011).

Endothelial-to-hematopoietic transition of the dorsal aorta floor

Локализация кластера клеток подобных гематопоэтическим в дне дорсальной аорты наблюдается у эмбрионов птиц и различных эмбрионов млекопитающих уже более 100 лет (Fig. 2D) (Adamo & Garcia-Cardena 2012). Первоначально гематопоэические клетки происходят из внеэмбриональных кровяных островков и они замещаются внутриэмбриональными кровяными клетками, возникающими из дна дорсальной аорты (Dieterlen-Lievre & Le Douarin 2004; Dieterlen-Lievre et al. 2006). Активация специфичных для гематопоэтических клеток маркеров строго подтверждает происхождение гематопоэтических клеток из дна дорсально аорты (Jaffredo et al. 1998, 2005). Поскольку гематопоэтические стволовые клетки, которые колонизируют тимус, селезенку, bursa и костный мозг, имеют внутриэмбриональное происхождение, то дорсальная аорта считается предшественником гематопоэтических стволовых клеток у эмбрионов птиц (for reviews, see Dieterlen-Lievre & Le Douarin 2004; Dieterlen-Lievre et al. 2006; Jaffredo et al. 2010). Пульсовое мечение ECs в tamoxifen-индуцибельной системе у эмбрионов мышей подтвердило, что гематопоэтические стволовые клетки происходят из ECs , расположенных в дне дорсальной аорты, так, как это наблюдается у эмбрионов птиц (Zovein et al. 2008).

Возможный механизм, который может ограничивать гематопоэтический потенциал в спланхнической мезодерме, был исследован Pardanaud & Dieterlen-Lievre (1999). Они установили, что трансплантации сомитов перепела, временно подвергнутых воздействию энтодермы, в целом куриных эмбрионов хозяев давали гематопоэтические кластеры в дне дорсальной аорты. Этот результат подтверждает, что энтодерма инициирует гематопоэтический потенциал эндотелиальных клеток предшественников в тесно ассоциированной спланхнической мезодерме (Pardanaud & Dieterlen-Lievre 1999). Однако остается неясным, только ли происходящие из спланхнической мезодермы ECs подвергаются переходу в гематопоэтические клеитки, когда они замещаются происходящими из сомитов ECs. Количественная оценка судеб ЕС, происходящих из сомитов и спланхнической мезодермы, на поздних стадиях необходима для адекватного решения этого вопроса. Для лучшего понимания молекулярных механизмов, управляющих повторной дифференцировкой специфических для клонов спланхнической мезодермы ECs в гематопоэтические стволовые клетки необходимо установить потенциал терапевтического применения этого знания.

Dorsal aorta formation in nonamniotes

Эмбрионы не-амниоты не образуют дорсальную аорту в результате слияния билатеральных дорсальных аорт. У эмбрионов рыбок данио латерально расположенные ангиобласты мигрируют в направлении срединной линии и дают ICM (Fouquet et al. 1997; Gering et al. 1998). Эти происходящие из латеральной пластинки клетки заполняют эндотелий дорсальной аорты, а сомиты вряд ли вносят вклад в дорсальную аорту. Помимо образования дорсальной аорты процесс образования кардинальных вен у эмбрионов рыбок данио полностью отличен от такового у эмбрионов птиц. Анализ замедленной съемки kdrl-GFP эмбрионов рыбок данимо показал, что кардинальные вены возникают в результате ангиогенеза врастания из вентрального региона дорсальной аорты (Herbert et al. 2009); напротив, у эмбрионов птиц кардинальные вены образуются de novo в результате васкулогенеза из сомитов (Pardanaud et al. 1996; Pouget et al. 2006). Паттерны кровеносных сосудов варьируют в условиях низкого содержания кислорода, благодаря активации hypoxia inducible factor (HIF). HIF белки являются bHLH транскрипционными факторами, которые позволяют клеткам выживать в условиях низкого содержания кислорода путем контроля генов, участвующих в энергетическом метаболизме, ремоделировании сосудов, гематопоэзе, клеточной пролиферации и апоптозе (Dunwoodie 2009). HIF2a, член семейства HIF белков, участвует в транскрипционной активации генов VEGF-A, VEGFR2/Flk1 и Tie2. Условия с низким содержанием кислорода индуцируют экспрессию HIF2a у эмбрионов кур (Ota et al. 2007), указывая, что поведение сосудистых клеток гибко модифицируется в соответствии с состоянием гипоксии в теле. Соответственно, различия в процессах формирования кровеносных сосудов между эмбрионами амниот и не-амниот могут быть связаны с размерами тала эмбрионов и/или условиями роста или на суше или под водой.

Переход от эндотелиальных к гематопоэтическим клеткам в дне аорты законсервирован у рыб (Kissa & Herbomel 2010; Lam et al. 2010), амфибий (Mills et al. 1999), птиц (Pardanaud et al. 1996; Jaffredo et al. 1998) и млекопитающих (Zovein et al. 2008; Boisset et al. 2010), за исключением направления высвобождения гематопоэтических клеток. У эмбрионов птиц и млекопитающих гематопоэтические клетки отпочковываются дорсально в просвет; напротив, у рыбок данио гематопоэтические клетки отпочковываются вентрально и сохраняются в субаортальном пространстве между дорсальной аортой и кардинальными венами (Kissa & Herbomel 2010; Lam et al. 2010). Эти гематопоэтические клетки переселяются в просвет дорсальной аорты во время начала кровообращения (Iida et al. 2010). Эмбрионы амниот также имеют происходящие из EC субаортальные клетки под дорсальной аортой; однако эти клетки вряд ли участвуют в гематопоэзе (Zovein et al. 2008). Механические стрессы, генерируемые кровотоком, способствуют гематопоэзу из эндотелия дорсальной аорты у эмбрионов рыбок данио и мышиных ES клеток (Adamo et al. 2009; North et al. 2009). Усиление активности Runx1 в дне дорсальной аорты важно для эндотелиально-гематопоэтического перехода, но не после этого (Chen et al. 2009). Кроме того, кровоток необходим для индукции активности Runx1 (North et al. 2009); однако, обнаруживает ли стресс по сдирающему эффекту жидкости склонность в направлении эндотелия дна всё ещё остается неясным. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как Runx1-экспрессирующие гематопоэтические стволовые клетки пространственно ограничены только дном дорсальной аорты. У эмбрионов кур измерения гемодинамики in vivo осуществлены с помощью неинвазивной лазерной Doppler imaging техники. Это выявило, что пульсативные сдирающие усилия (pulsatile shear) являются важными экзогенным фактором, направляющим дифференцировку артериальных клеток и ремоделирование вителлиновых сосудов (Buschmann et al. 2010).

Dynamic endothelial cell behaviors during dorsal aorta migration

Поведение эндотелиальных клеток во время латерально-медиальной транслокации дорсальных аорт было исследовано с использованием трансгенных эмбрионов перепела, tie1:H2B::eYFP (Sato et al. 2010; see also the Lansford section in this issue). У tie1:H2B::eYFP трансгенных перепелов все ECs были специфически мечены гистоном 2B-tagged eYFP под контролем промотора tie1 с момента эмбриогенеза до взрослого состояния. Получение изображений tie1:H2B::eYFP эмбрионов с помощью конфокальной лазерной микроскопии облегчает наше понимание трехмерной структуры кровеносных сосудов и паттерн распределения ECs выстилки. Ядерная локализация eYFP сигналов может быть четко идентифицирована и позволяет отслеживать их поведение автоматически, используя программы обработки изображений. Т.о., используя замедленную съемку tie1:H2B::eYFP трансгенных эмбрионов перепела с помощью двухфотонной лазерной микроскопии, мы оказались способны описать поведение индивидуальных EC во время транслокации дорсальных аорт с высоким пространственным разрешением. ECs дорсальной аорты мигрируют в общем и целом в переднем направлении, при этом нижний и верхний регионы мигрируют разными способами (Sato et al. 2010). Донные ECs перемещаются коллективно из латеральной в медиальную область, тогда как верхние ECs перемещаются не коллективным способом. Такие разные способы клеточной миграции между нижней и верхней стенкой могут быть связаны с разным происхождением этих популяций (Pardanaud et al. 1996). В верхнем эндотелии, в частности, происходит рекрутирование ангиобластов из сомитов, что потенциально влияет на миграцию уже существующих ECs. Напротив, донные ECs ассоциируют с энтодермой во время миграции. Механические взаимодействия между энтодермой и кардиогенной мезодермой во время коллективной миграции этих тканей в ходе морфогенеза сердца недавно описаны у эмбрионов кур (Varner & Taber 2012). Сокращение энтодермы вокруг срединной линии натягивает ассоциированную кардиогенную мезодерму в том же самом направлении. Клетки дна дорсальной аорты могут использовать сходный механизм коллективного перемещения из латеральной в медиальную область. Однако нет исследований, адресованных участию специфических молекул в этих разных клеточных поведениях. Как описано выше, антагонисты Hh, VEGF и BMP участвуют в динамических изменениях паттерна дорсальной аорты (Fig. 4B).

Conclusion

Vascular endothelial, smooth muscle, and hematopoietic cells arise from closely associated progenitors in early development. In addition, many regulatory molecules are involved in various stages of blood vessel formation. Determination of the specific cell progenitors in avian embryos has provided an essential framework for investigating site- and stage-specific molecular mechanisms, enabling us to develop a detailed understanding of gene functions at each elementary step of blood vessel formation and facilitating the investigation of dorsal aorta-specific mechanisms. Studies of dorsal aorta formation have given us insights into the distinct molecular mechanisms of large blood vessel formation in vivo, differentiating this process from that of small capillaries. Further understanding of the mechanisms controlling dorsal aorta endothelial cell behaviors and the floor-specific endothelial-to-hematopoietic transition phenomenon will allow reconstruction of large blood vessels and induction of hematopoiesis in vitro for potential therapeutic applications in the future.

Dorsal aorta formation: Separate origins, lateral-to-medial migration, and remodeling Yuki Sato Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 113–129, January 2013

Dorsal aorta formation: Separate origins, lateral-to-medial migration, and remodeling
Yuki Sato
Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 113–129, January 2013