Why use the chick limb bud as a model system?

Люди имеют пять разных пальцев вдоль передне-задней (от большого к мизинцу) оси конечности (Fig. 1). Можно видеть, что большой палец рук и ног самый толстый и короткий из пяти пльцев, тогда как мизинец самый узкий и наименьший, а средние три пальца выглядят похоже, хотя их морфология и длна слегка отличны. Эти морфологические и анатомические отличия между пальцами наз. “особенностями пальцев”. Руки и ноги развиваются из небольшой популяции соматических клеток из латеральной пластинки мезодермы, наз. зачатком конечности, которые вырастают из стенки тела. Конечность характеризуется тремя осями: передне-задней (AP), проксимо-дистальной (PD) осью (от плеча/ бедра к пальцам), и дорсо-вентральная (DV) ось (от костяшек пальцев к ладони). Изучение качественных особенностей пальцев направлено на выяснение механизмов детерминации AP оси в зачатке конечности. Скелет конечности организован в виде трех анатомических регионов: (i) stylopod (плечевая/бедренная кость), (ii) zeugopod (локтевая и радиальная кость и берцовая кость и малоберцовая кость), и (iii) autopod, который состоит из карпальных и тарзальных костей, метакарпальных и метатарзальных костей и фаланг (Fig. 1). Фаланги классифицируются в три типа в соответствии с их позицией вдоль PD оси: проксимальные, средние и терминальные фаланги, которые имеют ногти или когти/копыта. Люди имеют две фаланги в большом пальце ног и рук, характерный морфологический критерий пальца 1 у всех амниот (Vargas & Fallon 2005a,b; Wagner & Vargas 2008; Woltering & Duboule 2010). Отсальные 4 пальца имеют по три фаланги, это др. критерий, необходимый для разпознавания каждого пальца. Мыши имеют пять пальцев, а также морфологические отличия в каждом, сходные с таковыми у людей, с тремя средними пальцами (digits 2, 3, and 4) выглядящими одинаково (Fig. 2). Для отличия пальцев 2, 3 и 4 у мышей в конечностях морфологически необходимо оценить метакарпальные/метатарзальные сочленения в запястье/ предплюсне, по крайней мере, после E16.5, когда оссифицированные кончики концевых фаланг становятся видимы (Verheyden et al. 2005). В передних конечностях палец 2 metacarpal сочленяется с трапецевидной косточкой и центральными костями запястья. Сходным образом, палец 3 metacarpal сочленяется с capitate косточкой, а пальцы 4 и 5 metacarpals с крючковидной костью. Палец 1 metacarpal сочленяется с trapezium костью. Напротив, в задних конечностях палец 2 metatarsal сочленяется с промежуточной и ладьевидной косточками и располагается проксимальнее промежуточной косточки, тогд как палец 3 metatarsal сочленаяется с латеральной клиновидной косточкой и палец 4 metatarsal с кубовидной косточкой.

Figure 1. Skeletal pattern of forelimb and hindlimb in human. Stylopod has humerus/femur in the forelimb/hindlimb. Zeugopod has ulna and radius/tibia and fibula, respectively. Autopod consists of carpal/tarsal bones, metacarpal/metatarsal bones, and phalanges in each digit. Phalanges are named along the proximal-distal (PD) axis, proximal phalanx, middle phalanx, and terminal phalanx, which has a nail.

Figure 2. Skeletal pattern of the digits in chick and mouse. Chick wing has three digits identifiable as digits 1, 2, and 3. It is a highly derived structure that is modified for flight. The chick leg has four digits that have unique size, shape, and number of phalanges in each digit. Mouse has five digits – the same as human. The middle three digits, digits 2, 3, and 4, appear very similar. For all panels anterior is left, posterior right. a, trapezium; b, trapezoid; c, central carpal; d, capitate; e, hamate; f, medial cuneiform; g, intermediate cuneiform; h, navicular; i, lateral cuneiform; j, cuboid. There are two phalanges in digit 1 in both chick and mouse.

Передние конечности птиц сильно измененная структура, которая приспособлена для полёта и не соостветствует развитию конечностей амниот в целом (Fig. 2). Крыло птиц имеет три пальца, которые соответствуют пальцам 2, 3 и 4. Причины этого активно обсуждаются ( Young & Wagner 2011; Young et al. 2011 и не будут здесь рассматриваться). Однако, Tamura et al. показали, используя клональный клеточный анализ, что куринное крыло содержит пальцы 1, 2 и 3; эта находка прекрасно согласуется с палентологическими находками (Tamura et al. 2011; see also Towers et al. 2011). Данные транскриптома для каждого пальца передних и задних конечностей кур подтвердили, что экспрессия генов в пальце 1 крала сходна с таковой пальца 1 ног (Wang et al. 2011). Напротив, нога курицы содержит 4 пальца, которые легко различимы как пальцы 1, 2, 3 и 4 (Fig. 2). По сравнению с крылом кур ноги кур сильнее похожи структуру но амниот и являются широко используемой моделью для изучения детерминации качественных особенностей пальцев благодаря их анатомии.

Важно, что легко идентифицировать каждый палец морфологически у эмбрионов кур по сравнению с человеком или мышью. Идентификация пальцев связана с тремя основными морфологическими критериями: количеством, размером и формой фаланг (Suzuki et al. 2008). Все три критерия необходимы для установления качественных особенностей каждого пальца. Первый легко идентифицируется по поличеству фаланг в нижних конечностях. Чтобы установить это, мы проверыяем образование терминальных фаланг, которое происходит после St. 36 (Hamburger & Hamilton 1951). Сходные морфологические критерии д. использоваться и для пальцев мышей. Gli3^-/- мыши имеют неидентифицируемые пальцы из-за аномальной морфологии их фаланг (Litingtung et al. 2002). Следовательно, характеристики пальцев у мышей Gli3-/- не могут быть опредлены по мофрологическим критериям, хотя попытки проделать это описаны (e.g., Lopez-Rios et al. 2012). Помимом подсчета количества фаланг задние конечности эмбрионов кур чрезвычайно удаолбная модельная система для изучения детерминации качественных особенностей палаьцев. В задних конечностях пальцы 1, 2, 3 и 4 имеют две, три, четыре и пять фаланг, соотв. , поскольку этот критерий недвухсмысленный и легко применим на первой ступени (Fig. 2).

Discovery of the ZPA and the Shh gene

Важной вехой в исследовании характеристик пальцев стало открытие zone of polarizing activity (ZPA), расположенной в мезодерме вдоль заднего края зачатка конечности. Это небольшая группа клеток устанавливает качественные особенности задней части конечности. В 1968, Saunders and Gasseling открыли поляризующие свойства этих клеток (Saunders & Gasseling 1968). Они трансплантировали область, которая подвергается клеточной гибели – называемой posterior necrotic zone (PNZ) – в передний край зачатка конечности хозяина. В этой работе они не назвали её ZPA. В 1969, Wolpert опубликовл теориетические основы гипотезы для ZPA (Wolpert 1969). Он предположил, что позиционная информация, которая устанавливает полярность конечностей зависит от расстояния от задней части PNZ зоны. Эта модель предоставила фундаментальную основу для понимания формирования паттерна в биологии развития. Впоследствии, Saunders использовал название “zone of polarizing activity” (ZPA) (Saunders 1972); и далее вместе с соавторами в 1973, картировали полризующую активность ZPA's путем индукции поляризованно передних добавочных пальцев, при этом наиболее задние добавочные пальцы находились ближе всего ZPA трансплантату (MacCabe et al. 1973). В 1975, Tickle et al. опубликовали работу по спецификации пальцев с помощью позиционной информации, они начали интерпретировать свои данные базируясь на модели , продвинувшей дальше теоретическую работу Wolpert's (Tickle et al. 1975). Они предположили, что качественные особенности пальцев специфицируются с помощью градиента морфогена, который непосредственно отражает позиционную информацию с помощью ZPA.

В 1993, Riddle et al. установили веху в исследовании качественных особенностей пальцев (Riddle et al. 1993), открыв, что ген Shh экспрессируется на заднем крае конечности и является ZPA фактором (Fig. 4A). SHH белок, высвобождемый из кусочка, как было установлено, индуцирует зеркальное удвоение пальцев в зачатке конечностей кур (Lуpez-Martнnez et al. 1995). В подтверждение гипотезы морфогена, белок SHH индуцировал более задние пальцы с помощью более высоких доз (Yang et al. 1997). Этот результат подтвердил, что SHH функионирует как морфоген для детерминации качественных особенностей пальцев зависимым от дозы способом вдоль передне-задней (AP) оси конечности. Т.о., гипотеза ZPA была элегантно подтверждена с открытием экспрессии гена Shh в конечности кур. У Shh^-/- мышей, формировался только палец 1 в задних конечностях, и не формировались пальцы в передних коне6чностях (Chiang et al. 2001). Сходным образом, у мутантных кур oligozegodactyly (ozd), у которых Shh экспрессируется неспецифически в зачатке конечности, формируется только палец 1, а также в задних конечностях; он имеет две фаланги с точной морфологией пальца 1 для каждой из фаланг (Ros et al. 2003). Эти результаты не могли быть предсказаны моделью морфогена, они указывали, что палец 1 в задних конечностях формируется независимым от Shh образом. Однако, подобно мышам Shh^-/- , не возникало пальцев в крыле ozd. Интерсно, что Amano и Tamura предположили, что палец 1 в передних конечностях кур формируется независимо от функции ZPA, поскольку имплантированная ZPA никогда не индуцирует независимый эктопический палец 1. Если бы дополнительный палец 1 сформировался, то он бы ассоциировал с оригинальным пальцем 1 (Amano & Tamura 2005).

Approaches to the mechanisms of SHH function

Harfe et al. сообщили, что концентрация и время экспозиции SHH предопределяют качественные особенности пальцев у эмбрионов мыше и кур (Harfe et al. 2004). Неожиданно, используя подход для отслеживания LacZ клеточных клонов, бвло установлено, что 5, 4 и длина задненей стороны пальца 3 у мышей происходит из производных Shh-экспрессирующих клеток. Было предположено, что наиболее задний палец, палец 5, получает наивысшую концентрацию и подвергается самому длительному воздействию SHH у мыши, а палец 4 подвергается более короткой экспозиции SHH, чем палец 5, и что палец 3 испытывает ещё более короткое воздействие и воспринимает низкую концентрацию SHH, и что палец 2 воспринимает самую низкую концетрацию SHH из всех задних четырех пальцев. Это генетическое заключение было подтверждено с помощью ингибирования передачи сигналов SHH с помощью воздействия cyclopamine на эмбрионов кур (Scherz et al. 2007). Когда cyclopamine применялся на ст.20 (E3.5) в задних конечностях, то палец 4 не формировался, а палец 3 был частично трансформирован в палец 2. Напротив, когда cyclopamine использовался на St.22/23(E4.0), то неправильно формрровался толко палец 4. Т.о., anteriorization пальцев или потеря заднего пальца индуцировалась воздействием SHH зависимым от времени способом. Эти наблюдения подтвердили, что формироание более задних пальцев и детерминация качественных особенностей задних пальцев нуждаются в более длительной экспозиции действия SHH.

Towers et al. интегрироали рост с функцией SHH и предложили “growth and morphogen model” (Towers et al. 2008). В этой работе, используя крыло кур, авт. пришли к заключению, что Shh способствует как передне-задней экспансии зачатка конечности, так и спецификации задних пальцев во время развития конечности. Так, в этой модели большее количество белка SHH в более продолжительное время прогрессивно специфицирует характеристики более задних пальцев по сравнению с качественной особенностью проспективного пальца 1. В то же самое время SHH также индуцирует экспансию поля, формирующего пальцы, до контрольного числа пальцев.

Two separate approaches in the mouse do not support the “growth and morphogen model” in the chick wing

Gli1 является непосредственной мишенью для передачи сигналов SHH и экспрессия Gli1 была использована как как показатель сигнальной активности SHH в клетках мишенях. Gli1 репортерная линия с knock-in CreERT2 у мышей показала интересный результат (Ahn & Joyner 2004). Когда эти исследователи скрестили с аллелем R26R, чтобы определить передачу сигналов SHH на ст. зачатка коненчости, то они установили, что экспрессия Gli1 была наивысшей в положении проспективного пальца 5 на ст. E10.5. Однако, его активность была наивысшей в положении проспективного пальца 4 на ст. E11.5. Интерсно, что только слабая экспрессия репортера Gli1 определялась в позиции проспективного пальца 5 iу Gli2^-/- мышей, у которых формировался нормальный палец 5. В этом исследовании авт. предположили, что наиболее задний палец, палец 5 у мышей, детерминируется наивысшей конецнтрацией SHH в течение короткого промежутка времени на стадии раннего зачатка конренчости.

Zhu et al. пришли к сходному заключению (Zhu et al. 2008). Они вызывали нокаут Shh с помощью Hoxb6/CreERT на разных стадиях развития конечностей мышей. Они установили порядок конденсации задних четырех пальцев как 4-2-5-3. Если продолжительность экспрессии Shh была короче, то пальцы не формировались в обратном порядке. Напр., когда экспрессия Shh была ингибирована со ст. E10.5, терялся только палец 3. Кроме того, когда экспрессия Shh ингибировалась со ст. E10, то терялись пальцы 3 и 5. Когда экспрессия Shh ингибировалась со ст. E9.5, то терялись пальцы 3, 5 и 2. Важным является то, что пальцы прогрессивно терялись без гомеотической трансформации качественных особенностей при уменьшении времени экспозиции SHH. В свете этих результатов авт. предположили, что качественные особенности пальцев детерминируются с помощью SHH на ст. зачатка конечности. Они пришли к заключению, что функция Shh имеет две фазы. Первая является временной: tранняя фаза формирования паттерна регулирует качественные особенности пальцев, как показали Ahn et al.. Вторая является расширенной фазой, способствующей росту, во время которой расширяются области проспективных предшественников пальцев в такой последовательности 4-2-5-3. Важным вопросом является то, в какой последовательности область предшественника каждого пальца развивается в конечности мышей и является ли “growth and morphogen model” by Towers et al. согласующейся с этими экспериментальными результатами.

SHH из является митогеном (Kenney & Rowitch 2000). Отсутствующая часть мозаики, которая не упоминалась, это отвечают ли клетки, происходящие из ZPA, на градиент SHH пролиферацией. Как пролиферация индуцируется в клетках, происходящих из ZPA? У мышей, если такие производные клетки отвечают на градиент SHH, то клетки предшественники заднего пальца могут распространяться по другому вдоль градиента. Однако в конечностях мышей регионы проспективных предшественников пальцев увеличиваются в порядке, палец 4-2-5-3. Это означает, что пролиферация клеток в кончностаях мышей не контролируется непосредственно вдоль предполагаемого митогенного градиента SHH. В этой связи, когда и как происходят пролиферация и “спецификация” качественных особенностей пальцев вдоль градиента SHH у мышей не могут быть объяснены “моделью роста и морфогена”.

SHH signaling components and digit identity

SHH секретируется из ZPA и предопределяет AP ость в зачатке конечности. Белок SHH модифицируется холестеролом по C-концу и модифицируется palmitate по N-концу, чтобы стать зрелой и активной формой (Porter et al. 1996; Pepinsky et al. 1998). Добавление palmitate катализируется с помощью предпологаемой acyltransferase, называемой Skinny hedgehog (Ski) (Chamoun et al. 2001). Мыши, экспрессирующие Shh, которые лишены модификации с помощью palmitate обнаруживают редукцию пальца 2 задних конечносией (Chen et al. 2004a). Dispatched (mDisp1) необходим для высвобождения SHH из ZPA и ограничивает распространение градиента SHH (Li et al. 2006). Потеря активности mDisp1 ведет к потере пальца 2 также (Harfe et al. 2004). Эти результаты указываеют на то, что палец 2, который не происходит из SHH происзодных, также является наиболее чуствительным к сниженияю диффузииo SHH.

Patched является рецептором для SHH и обчно ингибирует Smoothened (Smo) (Stone et al. 1996) (Fig. 3). В отсутствии SHH, SMO участвует во внутриклеточном переносе пузырьков. GLI1, 2, 3 являются транскрипционными факторамим, стоящими ниже передачи сигналов SHH (Bьscher & Rьther 1998). Во время развития зачатка конечности Gli3 необходим для детеминации числа и качественных особенностей пальцев (Litingtung et al. 2002). Gli3^-/- мыши обнаруживали полидактилию и возникающие в результате пальцы походили на задние пальцы, но, как отмечалось выше, их нельзя было идентифцировать, из-за размера и формы фаланг (Litingtung et al. 2002). В отсутствие SHH, GLI3 локализуется в первичной ресничке в комплексе с KIF7 и SUFU (Fig. 3A). GLI3 фосфорилируется protein kinase A (PKA) (Wang et al. 2000; Hsu et al. 2011). Фосфорилированный GLI3 распознается с помощью β-TRCP, и вызывается убиквитинирование GLI3, приводя к частичной деградации в протеосомах (Bhatia et al. 2006). Такая укороченная форма GLI3, GLI3R, ингибирует транскрипцию генов мишеней (Wang et al. 2000).

Figure 3. SHH signaling pathway and GLI3 processing. In the absence of SHH, GLI3 is located in the primary cilium in a complex with KIF7 and SUFU, resulting in degradation to make the short form of GLI3, GLI3R. GLI3R inhibits transcription of target genes. (B) When SHH binds to PTC1, SMO rescues GLI3 degradation and full length GLI3, GLI3A is formed. GLI3A is a transcriptional activator which upregulates expression of target genes.

В присутствии SHH, SMO освобождается от ингибирования с помощью Patched (PTC), и фосфорилируется с помощью GRK2 (Chen et al. 2011). Затем, SMO образует комплекс с KIF3A и β-ARRESTIN и инггибирует SUFU (Kovacs et al. 2008). В этих условиях GLI3 поддерживается в длинной форме активатора, наз. GLI3A (Litingtung et al. 2002). GLI3A формируется в прямой пропорции от сигнала SHH и индуцирует экспрессию генов мишеней (Fig. 3B). Обусловленный нокаут Ptc1 или Kif3a вызывает полидактилию с потерей AP поярности (Liu et al. 2005; Butterfield et al. 2009) из-за усиления активности передачи сигналов SHH во всем зачатке конечности. В нормальном зачатке конечности соотношение GLI3A:GLI3R является высоким на задней стороне в присутствии SHH, и это позволят предполагать Litingtung et al. , что соотношение GLI3A:GLI3R детерминирует качественные особенности пальцев вдоль AP оси. Интересно, что как и предсказывает эта модель Gli3^-699 мыши, которые воспрозвоят преобразованную GLI3 изоформу у GLI3R мышей, имеют пальцы с двумя фалангами, что уникально для пальца 1 (Hill et al. 2009). Это подтверждает, что пальцы получают характеристики передних пальцев в присутствии только GLI3R. Напротив, постоянная активация передачи сигналов SHH в конечностях приводит к полидактилии, при этом задние пальце-подобные структуры, имеют 4 фаленги в задних кончностях кур (Litingtung et al. 2002). Итак, имеется подтверждение гипотезы, что соотношение GLI3A:GLI3R является критическим для детерминации качественных особенностей пальцев нижестоящей передачей сигналов SHH.

Necessity for SHH and its downstream target

В 2002, Shh^-/-;Gli3^-/- были получен компаундные нокаутрные мыши (Litingtung et al. 2002; te Welscher et al. 2002). Неожиданно, Shh^-/-;Gli3^-/- мыши имели пальцы в аутоподе и они были полидактиличными с неидентифицируемыми пальцами. Компаундные Shh^-/-;Gli3^-/- нулевые блыи неотличины от конечностей Gli3^-/-- нулевых мышей, даже если ген Shh присутствовал. Эти наблюдения показывают, что аутопод облает прирожденным потенциалом формировать пальцы, даже если не экспрессируется Shh, или если не присутствуют нижестоящие гены. В Wolpert модели ZPA, градиент SHH вдоль AP оси индуцирует особенные пальцы с неразличичмыми качественными особенностями. Однако вышеупомянутые генетические данные показывают, что пальцы без качественных особенностей могут формироваться в отсутствии Shh и что Shh необходим для формирования точного количества пальцев, а также для детерминации качественных особенностей пальцев. Интересно, что Shh^-/-;Gli3^+/- мыши, которые экспрессируют только GLI3R, имеют два пальца с двумя фалангами, идентифицированными как палец 1 в задних конечностях. Эти данные снова подтверждают идею, что соотношение GLI3A:GLI3R является критическим для детерминации качественных особенностей пальцев. Сегодня мы не понимаем, как зачатки пальцев начинают формироваться с помощью внутренне присущеих механизмов.

Пальцы могут формироваться без Shh; однако, экспрессия Shh необходима для детерминации качественных особенностей пальцев. Shh экспрессия необнаружима после St. 26 (Dunn et al. 2011), это соответствует детерминации interface щиколотки (tarsals) и иницииации autopod (metatarsals) с помощью удаления AER (Rowe & Fallon 1981). Более того, GLI3R является основной формой GLI3 в аутоподе (Chen et al. 2004b). Следовательно, очень возможно, что SHH функционирует не непосредственно в аутоподе. Harfe et al., предположили, что клетки зачатка конечности приобретают “память” , стоящую ниже SHH и что эта память д. контролировать качественные особенности палаьцев на более поздних стадиях (Harfe et al. 2004). Такая память д. быть или частью пути передачи сигналов SHH или отдельным вторичнм сигнальным путём, которые д. детермини ровать качественные особенности пальцев на стадии возникновения аутопода.

Вторичная передача сигналов, участвующая в детерминации качественных особенностей пальцев и стоящая ниже Shh

HoxD гены обнаруживают гнездовую экспрессию вдоль AP оси в аутоподе и каждый паттерн экспрессии коррелирует с конденсацией хряща зачатка пальца (Yokouchi et al. 1991). У Shh^-/- мышей и куриных ozd мутантов, экспрессия Hoxd11, 12 и 13 подавляется (Chiang et al. 2001; Ros et al. 2003). Следовательно, передача сигналов SHH необходима для 5'HoxD экспрессии в аутоподе. Morgan et al. сообщают, что эктопическая экспрессия Hoxd11 в зачатке конечности вызывает заднюю гомеозисную трансформацию пальца 1 в палец 2 в задних конечностях кур (Morgan et al. 1992). Этот трансформированный палец имеет три фаланги с морфологией, очень сходной с нормальным пальцем 2. Hoxd11 обычно не экспрессируется вокруг пальца 1. Следовательно, такая постериоризация пальца 1 в палец 2, как полагают, является результатом избыточной функции Hoxd11. Это было первым сообщением, показывающим, что экспрессия идентифицированного гена непосредственно контролирует качеественные собенности пальцев. Мыши Hoxa13^-/-;Hoxd13^-/- обнаруживают тяжелую гипоплазию формируемых пальцев (Fromental-Ramain et al. 1996). Гены HoxA и D д. также участвовать в формировании и коденсации зачатков пальцев (Kmita et al. 2005). Более того, уникальные методы манипуляции в экзогенными генами были использованы в этих экспериментах с избыточной функцией, с помощью птичьей ретровирусной Replication-Competent Avian sarcoma-leukosis Virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with Splice acceptor (RCAS) системы, чтобы вносить ген Hoxd11 в зачаток конечности (Morgan et al. 1992). С помощью этой системы экзогенный трансген может экспрессироваться в ограниченной области в определенны момент развития у эмбриона кур. Сходным образом, мы показали, что эктопическая экспрессия Tbx3 и Tbx2 с помощью RCAS ретровируса вызывает постериоризацию пальцев 2 и 3 в пальцы 3 и 4 (Suzuki et al. 2004). Tbx3 и Tbx2 являются транскрипционными факторами и экспрессируются в межпальцевом промежутке 3 и 4, но не в самом зачетке пальцев. Траскрипты Hoxd11 и Tbx3/2 генов экспрессируются в межпальцевых промежутках скорее, чем зачатках пальцев. Возможно, исходя из этих и др. данных (Dahn & Fallon 2000), что “память” SHH сохраняется в окружающей мезенхиме, окружающей зачаток пальца, в межпальцевом промежутке, и детерминирует размер и форму фаланг каждого пальца (Fig. 4A).

Figure 4. A model of digit identity determination by interdigit downstream of SHH. (A) Cells retain positional information from SHH in a dose- and time-dependent manner at the limb bud stage. (B) Memory of SHH is transduced in the interdigit. Each digit primordium does not have positional information when it starts to develop. (C) Each interdigit provides positional information to the anterior digit phalanx forming region (PFR) to determine each digit identity.

Interdigits determine each digit identity

Dahn and Fallon описали, что interdigits (IDs) необходимы для детерминируют качественные особенности каждого пальца в конечностях кур (Dahn & Fallon 2000). Они установили, что палец 2 и палец 3 были трансформированы в палец 1 и палец 2, соотв., после удаления ID2 или ID3 в задней конечности эмбрионов кур. Эти наблюдения подтверждают модель, что межпальцевой промежуток необхолдим для детерминации качественных особенностей пальца непосредственно впереди от промежутка. Кроме того, когда была внедрена танталовая фольльга в центр пальцевого луча пальца 3 после разделения пальцевого луча пальца 3 вдоль PD оси, то разделенная передняя половина луча пальца 3 трансформировалась в палец 2, который имеет три фаланги полного размера и формы нормального пальца 2, тогда как разделенная задняя половина пальца 3 развивалась как палец 3, с 4 фалангами. Здесь, пальцевые лучи были представлены проксимальными хрящевыми примордиями пальцев, неконденсированной сосудистой мезенхимой и наиболее дистальной лишенной сосудов мезенхимой, лежащей под сигнальнм центром проксимо-дистальной оси, apical ectodermal ridge (AER). Очень важно, что качественная особенность пальца не является фиксированным свойством, а лабильна, (т.e. качественная особенность пальца не детерминирована), прежде чем зачаток пальца начнет конденсироваться. Когда пальцевой радиус пальца 2 имплантируется в ID3, то палец 2 трансформируется в палец 3. Эти результаты демонстрируют, что межпальцевой промежуток обладает позиционной информацией для детерминации качественных характеристик пальца и естественнно для поддержания тго, что пальцевой луч не обладет позиционной информацией, когда зачаток каждого пальца начинает развиваться.

Bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 4 и 7 экспрессируются в межпальцевых промежутках (Suzuki et al. 2004) и они ассоциируют с апоптозом в межпальцевых промежутках (Gaсan et al. 1996; Pajni-Underwood et al. 2007), приводя к разделению пальцев у человека, мышей и кур. Важно, что когда кусочи, смоченные BMP антагонистом, Noggin, были имплантированы в ID3 на St. 27, перед началом апоптоза в межпальцевом промежутке, то качественные особенности пальца 3 были трансформированы в таковые пальца 2 (Dahn & Fallon 2000), как и в случае с удалением ID3. Т.о., , передача сигналов BMP в межпальцевом промежутке участвует в детерминации качественных особенностей пальцев до индукции апоптоза на более поздней стадии. Эктопическая экспрессия Tbx3 или Tbx2 также индуцирует активацию BMP2, 4 и 7 в межпальцевом промежутке (Suzuki et al. 2004). Это наблюение согласуется с ролью передачи сигналов BMP межпальцевом промежутке в детерминации качественных характеристик пальцев. Итак, качественные особенности пальцев ещё не были детерминированы, когда каждый зачаток пальца начинал развитие, а межпальцевой промежуток обладает позиционной информацией, включая BMPs, чтобы детерминировать качественную осоенность впереди находящегося пальца. Однако компаундные нокаутные мыши в комбинации с Bmp2/4/7 не обнаруживают трансформации пальцев у мышей (Bandyopadhyay et al. 2006). Это интересно, но эти двойные компаундны нулевые мутанты, не принимают во внимание всех протестированных членов семейства BMP, напр., Bmp5 (Zuzarte-Luнs et al. 2004) Gdf5/6 (Settle et al. 2003).

Следующий вопрос, как передача сигналов BMP из межпальцевого промежутка функционирует, чтобы детерминировать пальцевые характеристики. Что является мишенью для передачи сигналов BMP из межпальцевого промежутка? Мы установили, что клетки, расположенные дистальнее конденсирующегося хряща пальцевого примордия, наз. phalanx forming region (PFR), получают сигналы BMP из межпальцевого промежутка (Suzuki et al. 2008) (Fig. 4B). Далее мы показали, что клетки, расположенные под AER постоянно проникают в PFR (Fig. 4C). Т.о., выдвигается гипотеза, что PFR является местом пальцевого луча, где детерминируется качественная особенность пальца с помощью кзади расположенного межпалаьцевого промежутка. Клетки в PFR постоянно изменяются. как только происходит дистальная элонгация, старые более проксимальные клетки (которые были PFR клетками) формируют хрящ, тогда как новые клетки, возникающие под влиянием AER становтся PFR. Клетки, которые были PFR получают позиционную информацию от межпальцевого промежутка и формируют конденсат определенной фаланги в хрящ.

Экспрессия Sox9 и фосфорилированные SMAD1/5/8 обнаруживаются в PFR (Fig. 4C). Это означает, что фаланги становятся детерминированными и начинают приобретать характеристики клона хряща в PFR. Интересно, что мы обнаружили, что каждый PFR обнаруживает уникальные уровни активности SMAD1/5/8. Когда мы имплантировали ID3 в заднюю сторону пальцевого луча пальца 1, то палец 1 трансформировался в палец 3. Это сопровождалось уровнем активности SMAD1/5/8 в пальцевом луче 1, характерным для пальцевого луча 3. трансформированный палец 3 имеет 4 фаланги с полным размером и формой фаланг нормального пальца 3. Эти результаты напоминают гомеозисные трансформации пальцев, вызываемые эктопической экспрессией HoxD11 в ногах кур (Morgan et al. 1992). Т.о., уникальная активность SMAD1/5/8 в каждом PFR является характерной для детерминации качественных особенностей палаьцев.

Future questions about digit identity determination

An important question is whether the morphogen theory is supported when the most recent data on limb patterning are taken into account. For example, digit 3 needs the longest Shh expression in the mouse (Zhu et al. 2008). Digit 5 identity may be determined under the condition of high SHH activity for a short time (Ahn & Joyner 2004). In addition, it is crucial that mouse digits were not transformed to other digits when the timing of Shh expression and activity are changed (Scherz et al. 2007; Zhu et al. 2008). Moreover, digit identity has not been determined when the digital rays of the autopod appear as discrete entities separated by the interdigits (Dahn & Fallon 2000; Suzuki et al. 2008). Rather, interdigits have positional information for determining each digit identity through the PFR region that is located in the digital ray distal to the condensed cartilage of the digital ray (Suzuki et al. 2008).

Taken together, the recent observations discussed here imply that the function of SHH as a morphogen in mouse or chick limb development cannot be explained as currently proposed. The challenge is to integrate the genetic and molecular events in the limb bud with the genetic and molecular events in the autopod to produce a coherent understanding of the mechanisms governing digit determination and morphogenesis.

How is digit identity determined during limb development? Takayuki Suzuki Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 130–138, January 2013

How is digit identity determined during limb development?
Takayuki Suzuki
Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 130–138, January 2013