Model systems in developmental biology

Исследования развития метазоа имеют целью наблюдать и описывать огромное разнообразие видов, чтобы объяснить насколько возможно разнообразие животных, живущих на планете. Поэтому исследования развития проводятся на широком спектре видов. С конца 19-го столетия биологи переключили свои интересы с описательной на аналитическую тенденцию. Они начали расшифровывать механизмы, лежащие в основе процессов развития скорее, чем описывать их. С этого времени экспериментальные подходы были сфокусированы на ограниченном количестве видов животных, в надежде установить механизмы, посредством которых одиночная клетка, яйцо, дает организм. Эти виды могут рассматриваться как модельные системы для раскрытия процессов, участвующих в этих экстраординарных достижениях природы.

В начале двадцатого столетия морские ежи и лягушки были основными животными, используемыми с этой целью. Причина такого выбора заключена в том факте, что их эмбрионы развиваются в воде и их легко получить. В случае лягушек, эмбрионы крупные и достаточно мощные, чтобы с ними манипулировать даже на относительно поздних стадиях. Среди позвоночных эмбрионы млекопитающих наименее доступны, хотя их развитие вызывает наибольший интерес и любопытство. Эмбрионы птиц кажутся особенно привлекательными моделями по нескольким причинам: они развиваются очень быстро как и их аналоги млекопитающих (за исключением их самых ранних стадий), их легко получать и они доступны для непосредственных вмешательств на яйце. Они даже продолжают развиваться нормально, будучи эксплантированы in vitro .

C появлением генетики развития птичьи модели стали страдать от недостаточного знания генетики их развития. Напротив, в этом отношении намного их обогнали мыши. В течение первых двух третей двадцатого столетия было идентифицировано огромное количество мутаций у этого вида; мутации были законсервированы и стали пригодны для исследования. Более того, быстрое развитие генетического инженеринга в 1970s и 1980s сделало возможным изменение генома мышей посредством трансгенеза и даже инактивировать гены избирательно благодаря разработке технике гомологичных рекомбинаций. Др. важным техническим преимуществом в биологии развития млекопитающих стали успехи по культивированию яиц млекопитающих (see Waddington 1936). В 1960s работа Ralph Brinster (Brinster 1965a,b) определенно установила потребности в культуральной среде для культивирования яиц млекопитающих после оплодотворения до ст. бластоциста. Это позволило не только изучать ранние стадии развития, но и также получать бессмертные линии плюрипотентных, самообновляющихся эмбриональных стволовых клеток (ES клеток) (Martin 1981; Evans & Kaufman 1981).

Др. модели были выбраны среди позвоночных и беспозвоночных, которые внесли значительный вклад в наше знание о молекулярных и генетических механизмах развития. Наиболее выдающейся из этих моделей стала плодовая мушка, Drosophila melanogaster, которая экстенсивно использовалась для генетических исследований в начале столетия. Приход молекулярных техник сделал возможным эксплуатацию безмерных находок познания генетики плодовых мух и внес существенный вклад в становление основ генетики развития. Др. модель, продвинутая Sydney Brenner, Caenorhabditis elegans, чье развитие высоко стереотипично, как и у некоторых др. остистых рыб (рыбки данио, Brachydanio rerio и медака, Oryzias latipes) стали очень пригодными инструментами современной молекулярной биологии развития.

Поразительно наблюдать, что параллельно с этими успехами на разных моделях, особенно применительно к молекулярному анализу процессов развития, эмбрионы птиц остались очень эффективным инструментов для изучения ряда важных проблем развития. Они особенно благоприятны с появлением техники, которая заключается в конструировании жизнеспособных химер между двумя видами птиц, чьи клетки могут быть распознаны во время всего периода развития, даже после рождения (Le Douarin 1969, 1973).

Вторым важным преимуществом использования модельных птиц стала возможность переноса генов и избранные места развивающегося эмбриона с помощью электропортации в яйцо. Эта техника была изобретена и продвинута проф. Harukazu Nakamura и была немедленно адаптирована в большом числе лаб. (Yasugi & Nakamura 2000; Nakamura et al. 2004). В то же самое время генетические, а также геномные ресурсы вместе RNA interference были разработаны на цыплятах, делая эту модель всё боле и более пригодной для современных биологических исследований (Brown et al. 2003; International Chicken Genome Sequencing Consortium 2004). Можно рассматривать, что трансгенез с помощью электропортации в яйцо продвинул птичью модельную систему в 21-й век.

Some of the developmental problems in which the chick-model has been particularly instrumental

Обзор не претендует быть исчерпывающим, поскольку ряд проблем эмбриологии, которые стали принадлежностью использования эмбрионов кур в качестве модели, стал чрезвычайно широк (e.g. see Romanoff 1960).

Среди проблем, которые были изучены в большей степени на эмбрионах кур, следует упомянуть миграцию зародышевых клеток. Клетки, которые избегают сигналов, ответственных за становления плана тела, становятся специфицированными в раннем эмбриогенезе и достигают зачатков гонад, обозначаемых как генитальные гребни, позднее в развитии. Они затем дифференцируются в гаметы в гонадах. Эти примордиальные клетки были прослежены у эмбрионов птиц от стадии их сегрегации от соматических клеток тела и становления временно расположенными в генитальном полумесяце в ростральной части бластодиска. После этого они прогрессируют внутри сосудов в направлении зачатка гонад (for references see Romanoff 1960 and Dubois 1969). Эмбрионы кур оказались инструментом для отслеживания интригующего путешествия этих клеток на ранних стадиях эмбриогенеза.

Развитие определенных органов было изучено очень детально благодаря тому, что они были представлены превосходными моделями для изучения общих проблем развития. Напр., случай конечности позвоночных, на котором может быть продемонстрировано формирование паттерна, спецификация позиционной информации, индукция, генез органов и формирование тела, а также дифференцировка.

Зачаток конечности доступен для экспериментов у эмбрионов кур и стал предметом исследований, в которых были сделаны основные открытия вышеупомянутых проблем (e.g. for reviews: Tickle & Eichele 1994; Cohn & Tickle 1996; Niswander et al. 1993; Wolpert et al. 1979).

Исследования, проведенные на этой модели, привели к открытию принципов развития, которые оказались верными для всех позвоночных. Более того, эти результаты заложили основу изучения молекулярных аспектов этих проблем развития, которое стало доступным после онтогенетической генетической революции.

Влияния, получаемые развивающимися нейронами спинного мозга от сигнальных молекул, продуцируемых индукционными центрами, расположенными вдоль дорсовентральной оси на дорсальной и вентральной срединной линии спинного мозга, были доказаны на эмбрионах кур (see Basler et al. 1993; Lumsden 1995; Tanabe & Jessell 1996).

Как предопределяются количества нейронов спинного мозга и их дифференцировка? Эти вопросы были успешно изучены на эмбрионах кур. Victor Hamburger продемонстрировал с помощью простого и элегантного эксперимента, что во время раннего нейрогенеза большое количество нейронов продуцируется в спинном мозге и также в ганглиях дорсальных корешков. Количества нейронов, которые выживают и становятся функциональными, зависят от доступности трофических факторов, обнаруживаемых их соотв. аксонами на периферии (Hamburger 1934). Эта важная находка стала источником открытия Dr Rita Levi-Montalcini Nerve Growth Factor (NGF) , который в свою очередь позднее оказался первым из открытых членов семейства ростовых факторов, которые активны в ЦНС и ПНС (see Levi-Montalcini 1975).

Др. важный пример важности модельной системы кур в биологии развития открытый Olivier Pourquiй молекулярный осциллятор - часы сегментации - ассоциированный с ритмической продукцией сомитов эмбриона (Palmeirim et al. 1997). После этого прорыва его лаб. сосредоточилась на молекулярных механизмах, лежащих в основе этого молекулярного осциллятора.

Важен тот факт, что Nature Publishing Group признала это открытие сегментационных часов, также как и технику химер курица-перепел, позволяющей метить клетки развивающегося эмбриона (Le Douarin 1969, 1973) как две из 24 основных вех в развитии биологии за последние 100 лет.

A cell marking technique to follow the migration of cells in the avian embryo

В 1968, один из нас (N. Le Douarin) обнаружила, что изменение хода её исследований привело её к изобретению техники клеточного маркирования, которая пробудила интерес не только среди эмбриологов, работающих с курами в качестве модельной системы, но также среди более широкой аудитории.

Она исследовала межклеточные взаимодействия, происходящие во время развития печени и случайно установила, что в её распоряжении яйца вида птиц Японского перепела (Coturnix coturnix japonica), которые ещё не использовали в эмбриологических лаб.

Проблема, с которой она столкнулась, была связана с ролью мезенхимного компонента печени (septum transversum) на дифференцировку гепатоцитов из энтодермы. Она показала, что первая оказывает влияние на энтодерму путем индукции, критической для жизнеспособности, роста и дифференцировки в печени. Теперь известно, что fibroblast growth factors (FGFs) являются медиаторами этого эффекта. Её любопытство подвигло её посмотреть, происходят ли межклеточные взаимодействия точно также, если мезенхима и энтодерма принадлежат разным видам. Сегодня это кажется ясным, поскольку мы знаем, что молекулярные пути, используемые процессами развития удивительно консервативны в процессе эволюции, но это не было известно в то время. Она затем ассоциировала в органотипической культуре печеночную мезенхиму эмбриона перепела с энтодермой anterior intestinal portal (AIP) эмбрионов кур, которая, как она установила, является местом, где энтодермальные клетки приобретают судьбу гепатоцитов (и vice versa). Это был эксперимент, которые ранее она проводила с двумя компонентами из эмбрионов кур. Она установила дольки печеночной ткани, в которых мезенхимные клетки и гепатоциты были тесно ассоциированы, развивались в культуральной чашке.

При этом, когда она наблюдала микроскопические срезы долек химерной печени, возникшие благодаря ассоциации AIP энтодермы курицы с печеночной мезенхимой перепела, она отметила изменения, происходящие в энтодермальных клетках, когда они становились гепатоцитами, увеличение их ядрышка. Это было связано с увеличением синтеза белка, характерного для гепатоцитов. В химерной печени в результате ассоциации мезенхимы перепела и энтодермы курицы, куриные гепатоциты выглядели точно также как в нормальной печени кур, но мезенхимные клетки также обнаруживали увеличенные ядрышки, признак, не характерный для этого типа клеток.

Это позволило ей установить, что все типы эмбриональных и взрослых перепелиных клеток имеют более крупные массы гетерохроматина, ассоциированные с ядрышком, что делает эти органеллы очень объёмными. Она пришла к мысли, что конструирование химерных эмбрионов из двух видов может послужить способом отслеживать определенные группы клеток во время развития: их миграцию и их судьбы.

Клетки перепела легко опознаваемые в сравнении с клетками кур по структуре их ядрышка с помощью реакции Feulgen, специфической для ДНК, позволяя идентифицировать гетерохроматин, ассоциированный с ядрышком клеток перепела. У кур и большинства видов животных ядрышки Feulgen-негативные.

Её первый эксперимент для тестирования этой идеи с использованием 'quail nuclear marker' для отслеживания миграции клеток в эмбрионах птиц, заключался в замене фрагмента нервной трубки у эмбрионов кур на его перепелиный аналог до начала миграции клеток нервного гребня (NC).

Изучение таких химерных эмбрионов спустя несколько дней после операции с помощью окраски по Фёльгену срезов, четко показало миграцию клеток NC, которая легко распознавалась от куриных хозяйских клеток по структуре их ядра. В этом специальном эксперименте клетки перепела присутствовали не только в трансплантированной части спинного мозга,но и также диспергировали во многие др. места эмбриона (at E5-6): вдоль нервов, как Шванновские клетки, в периферические ганглии, в надпочечники. Картина, выявляемая с помощью микроскопа рассматривается как визуализация миграции клеток в теле эмбриона. Стало ясно, что эта техника по сравнению с предыдущей техникой, метящей клетки и прослеживающей их судьбы (H3-TdR, витальное окрашивание и частицы углерода), превосходит их благодаря стабильной и неизменяемой и не передаваемой соседним клетками метке. Степень её точности зависит от мастерства микрохирургии при замене тканью перепела удаленной хозяйской ткани др. вида.

Система маркеров перепел/курица активно использовалась Le Douarin's и др. лаб. в течение 3-х последних декад. Она была использована для решения ряда проблем развития, таких как гематопоэз и многие др. системы развития. Развитие сомитов было одной из них. А именно, происхождение в сомитах поперечно-полосатых мышц конечностей (Ordahl & Le Douarin 1992 and references therein).

Нервная система хорошо известна миграцией составляющих ей клеток во время эмбриогенеза, стала основной областью применения этой техники и не удивительно, что клетки NC стали одним из предметов использования системы quail/chick (Q/C).

The neural crest and its role in vertebrate development

Эта временная эмбриональная структура эмбрионов позвоночных открыта нем. гистологом Wilheim His (1868), стала предметом активных исследований. Они в основном проводились на эмбрионах амфибий. Только в конце 1960s, один из нас (N. Le Douarin) начала интересоваться этой частью нейрального зачатка. Мечение делящихся клеток triated-thymidine было первой попыткой мечения клеток NC у кур, что предшествовало технике химер Q/C (Weston 1963). Однако некоторые ограничения этого маркера (напр., разведения в результате клеточных делений, дисперсия метки в результате гибели меченных клеток) привело к переходу на гетероспецифическую химерную технику. Несколько лаб. внесли вклад в расшифровку судьбы и путей миграции клеток NC у эмбрионов птиц с помощью Q/C маркерной системы (see Le Douarin 1982 and Le Douarin & Kalcheim 1999 for reviews).

Среди наиболее важных результатов этих попыток стал существенный вклад цефалической части NC в формирование головы позвоночных. NC является источником всего лицевого скелета и большей части черепа, в котором только окципитальная и отическая капсула (частично) возникают из мезодермы (Couly et al. 1993). Было установлено, что формирование паттерна всей цефалической области расположенной ростральнее ромбомера 2 не зависит от Hox генов и в самом деле они не экспрессируются в этой ростральной части тела. Индуцированная экспрессия Hox генов (Hoxa2, Hoxb4 and Hoxa3) в цефалической части NC предупреждала развитие костей и хрящей головы, тогда как не влияла существенно на производные нейральной части NC (Creuzet et al. 2002). Более того, или индуцированная экспрессия Hox-генов или хирургическое удаление самого цефалического NC вызывало выраженные аномалии в развитии головного мозга. Результаты этих экспериментов послужили первой демонстрацией, что развитие скелета головы и головного мозга тесно связаны и спарены. Онтогенетической связкой между этими двумя эмбриологическими событиями является нервный гребень.

Однако NC сам по себе не вносит клетки в нервную ткань головного мозга (хотя он продуцирует цефалические оболочки (Le Douarin 1982)), но он регулирует рост латеральных частей передней части нервной пластинки, которые служат источником телэнцефалона, талямуса и optic tectum (Creuzet et al. 2006). Далее было продемонстрировано, что клетки NC Hox-негативного домена, которые являются источником скелета головы и лица (поэтому обозначенные как Facial Skeletogenic NC: FSNC) регулируют количество продуцируемого Fgf8 с помощью вторичных организаторов головного мозга: anterior neural ridge (ANR) и isthmus посредством продукции anti-BMP4 сигнальных факторов (подобных Noggin, Gremlin) (Creuzet 2009). Эти результаты продемонстрировали важную роль цефалического NC в развитии головы и головного мозга у позвоночных.

The neural crest, an important asset in vertebrate evolution

Эти эмбриологические результаты вместе с др. результатами привели Gans & Northcutt (1983) к выдвижению концепции 'New head' у позвоночных в связи с возникновением NC , важного для эволюционного перехода от протохордовых к позвоночным. Существующая форма головохордовых, Amphioxus, в целом рассматривается как очень похожая на таковую у родоначальника позвоночных, лишенного нервного гребня. Amphioxus имеет плохо развитые мозговые пузыри и не имеет сенсорных органов, которые характеризуют голову позвоночных. Согласно Gans and Northcutt, развитие головы в типе хордовых (chordate phylum) связано с появлением NC и совпадает с изменением стиля жизни. Amphioxus фильтруют воду для питания, тогда как позвоночные становятся хищниками. Это стало возможным благодаря приобретению сенсорных органов (зрения, обоняния, слуха), которые развились из плакод, которые подобно NC, являются инновациями у позвоночных. У позвоночных головной мозг становится всё более и более сложным и эффективным благодаря развитию ассоциативных нервных структур особенно в переднем и среднем мозге и мозжечке.

Конструирование карты судеб передней части нервной пластинки показало. что как и в своей оригинальной конфигурации, присутствующей у бесчелюстных позвоночных (миксин и миног), наиболее передняя часть раннего нейрального примордия соответствует диэнцефалону (thalamus, hypothalamus и гипофизу) лишь с умеренным развитием телэнцефалона в дорсальном направлении. Диэнцефалон соответствует переднему концу хорды, организующему центру у позвоночных, который играет важную морфогенетическую роль на разных ступенях формирования паттерна тела.

Olivier Pourquiй в своей докторской диссертационной работе продемонстрировал, что дифференцировка параксиальной мезодермы (цефалической и сомитной) в хрящи и кости зависит от сигналов, возникающих в хорде (Pourquiй et al. 1993), позднее идентифицированных как секретируемые молекулы Sonic-hedgehog (SHH). Хорда, присутствующая выше соединения мезэнцефалон-диэнцефалон, т.о., объясняет формирование позвоночного столба и окципитальной области черепа. Эволюция типа позвоночных характеризуется развитием мозговых полушарий, которые достигают пика у приматов. Используя Q/C химерную систему, мы сконцентрировали свое внимание на ранних ступенях развития мозговых полушарий (telencephalon), и показали, что они возникают из латеральных областей передней части нервной пластики. После слияния нервных складок и образования мозговых пузырей, эти латеральные области становятся местом интенсивного роста, так что они развиваются рострально за пределы конце хорды и аденогипофиза, чтобы сформировать телэнцефалон. Гипофиз оказывается 'погруженным' внутрь stomodeal полости, в то же время он сохраняет свои близкие взаимоотношения с вентральной частью (floor) диэнцефалона (которая дает гипоталямус). Благодаря отсутствию хорды и мезодермы на уровне телэнцефалона, не развивается скелета мезодермального происхождения, чтобы покрыть 'новый головной мозг', увеличивающийся в ходе эволюции. Этот новый головной мозг покрывается клетками, происходящими из NC, которые формируют менингиальные оболочки переднего мозга и череп (оптический и носовой скелет, лобные и теменные кости). Т.о., коэволюция передней части головного мозга и NC стала критической для развития высших когнитивных функций у большинства недавних форм позвоночных. Отметим, что это значительное развитие переднего мозга сопровождается возникновением сенсорных органов: глаз, которые происходят из диэнцефалона, и обонятельных органов, чьи клетки предшественники мы локализовали с передней нервной складке. Картирование судеб нервной пластинки (Couly & Le Douarin 1985, 1987) послужило точкой отсчета для многих исследований переднего головного мозга у млекопитающих, птиц, а также Xenopus др. группами. Приобретение головным мозгом высших функций у позвоночных было приспособленным к изменению стиля жизни по сравнению с питанием путем фильтрации у родоначальников, cephalochordates. Позвоночные стали способны видеть свою пищу и затем стали хищниками. Их лицевой скелет, который целиком происходит из NC (see Le Douarin 1982), содержит главный орган хищников, челюсти, которые уже хорошо развиты у некоторых костистых рыб. Эволюция головы позвоночных поэтому характеризуется увеличением участия эктодермы посредством нейрального зачатка. Последний не только генерирует головной мозг, но и также NC, который является критическим для построения лица и дает большую часть сердца и головной сосудистой сети (endothelium excluded).

Итак, эмбриологический анализ онтогенеза NC у эмбрионов птиц пролил новый свет на эволюцию всего филума позвоночных.

The early development of the brain studied in the chick embryo

Система Q/C химер послужила инструментарием для расшифровки некоторых морфогенетических событий, принимающих участие в ранних стадиях развития головного мозга. Это особенно наглядно для миграций клеток, происходящих во время миграций клеток во время онтогенеза мозжечка (Alvarado-Mallart & Sotelo (1984) and Hallonet et al. 1990).

Химеры Q/C также показали, что в противоположность общепринятому мнению в то время, тангенциальные миграции предшественников нейронов имели место в нейральном эпителии во время нейрогенеза переднего мозга (Balaban et al. 1988). Сходным образом, это в то же время было установлено у мышей, используя LacZ несущие ретровируся в качестве клеточных маркеров (Walsh & Cepko 1988).

Harukazu Nakamura и его сотрудники в Японии и французская группа Dr Alvarado-Mallart в Париже (Nakamura et al. 1986, 1988; Shigetani et al. 1997; Sugiyama et al. 1998; Alvarado-Mallart & Sotelo 1984; Sugiyama et al. 1998), используя технику трансплантации quail/chick, установили, что соединение среднего и заднего мозга является важным организатором развития головного мозга. Эти две группы показали, что трансплантации нейроэпителиальных трансплантатов из этой области в диэнцефалон или ромбэнцефалон приводят к индукции гена En2 в хозяйском соседнем нейральном эпителии и к дифференцировке tectal или мозжечковых структур в зависимости от места имплантации. Это привело к открытию Dr Salvador Martinez с коллегами (Crossley et al. 1996), что критическим фактором в этой индукции является FGF8, естественно продуцируемый соединением между средним и задним мозгом, детерминированным, чтобы стать перешейком (isthmus).

Embryonic chimeras and the study of brain functions

Многие годы Q/C химеры, которые были получены нами и др. лаб., наблюдали во время эмбриональной жизни, т.е. до вылупления.

C 1985 Le Douarin с коллегами реши исследовать, какова судьба нервной ткани, происходящей из чужеродного источника после рождения. Во-первых, будут ли эмбрионы, чья central nervous system (CNS) частично принадлежит др. виду, способны вылупляться если да, то каково будет их поведение. Проведена большая серия экспериментов, показавшая, что нервная ткань обнаруживает выгоды из-за привелигерованного иммунологического статуса. По сравнению с трансплантатами не из нервной ткани (напр., зачатка конечности) трансплантаты CNS не запускали иммунных атак со стороны хозяина в течение нескольких недель (даже месяцев в некоторых случаях) после достижения иммунной зрелости.

Это привело к разработке двух проектов: одного, связанного с проблемой 'nature versus nurture' в поведении и др., с происхождением аутосомной Менделевской рецессивной формы эпилепсии у линий кур и человека.

Determination of species-specific crowing in birds

Первый проект был инициирован Evan Balaban , который выбрал для своей postdoc работы, изучение видоспецифических криков (or call), вызванных у молодых птиц имплантами тестостерона. Он установил, что кукареканья были различны у молодых перепелов и кур. Более того, движения головы, сопровождаемые крики были также отличны у разных видов. Evan Balaban решил поискать в головном мозге место(а), управляющие вокализацией и поведением, связанным с кукареканьем. Marie-Aimйe Teillet и Evan Balaban заменяли специфические нейроэпителиальные области между E2 Q/C эмбрионами. В это время мозговые пузыри ещё не были васкуляризованы и слияние трансплантата с донорским нейроэпителием происходило быстро. Многочисленные химеры с Q/C головным мозгом вылуплялись и оказалось, что область видоспецифического кукареканья находится в мезэнцефалоне. Куриные трансплантаты в мезэнцефалоне перепела испускали типичные перепелиные крики. Однако одновременно движения головой были куриного типа. Далее Evan Balaban оказался способным определить источник типичных движений головы, сопровождющих крики у перепела, в стволе головного мозга (Balaban et al. 1988; Balaban 2005).

Итак, на ранних стадиях нейрогенеза нервная пластинка далеко не гомогенная структура с взаимозаменяемыми регионами. Напротив нервный эпителий уже является местом структурализации, которая касается генетических и видоспецифических встраиваемых характеристик. Во время нейрогенеза различные регионы так настроены, чтобы приобрести соотв. функциональность вместе с их дифференцировкой в контексте соединений, которые они устанавливают с соседними структурами.

The epileptic chickens

Рассматривая возможность обмена частями головного мозга между двумя эмбрионами проф. Robert Naquet, общепризнанный специалист по эпилепсии, предложил использовать химерную модель птиц для определения источника аутосомной Mendelian рецессивной формы эпилепсии на линиях кур, открытых в Канаде R. D. Crawford (1970). Генетические формы эпилепсии известны у людей и характеризуются судорогами, запускаемыми, среди прочих причин, зрительными и слуховыми стимулами (напр., импульсным освещением). Они рассматриваются как относящиеся к субкортикальному типу эпилепсии. Однако , что генерирует судороги и каковы области головного мозга ответственные за этот процесс, неизвестны, хотя предполагалось, что фокус располагается в стволе головного мозга.

Как упоминалось ранее эмбриональные пересадки нейрального эпителия отторгаются у межвидовых химер спустя 1-3 мес., когда молодые птицы становится иммунологически компетентными, событие, которое происходит спустя 2 недели после рождения. Во время нашей работы с иммунологическими реакциями хозяина на нейральные трансплантаты, мы заметили, что открывается новый путь исследований. Нейральные трансплантаты между Major Histocompatibility Complex (MHC)-отличающимися эмбрионами оказались перманентно допустимыми. Это привело нашу группу к разработке серии экспериментов в сотрудничестве с проф. Robert Naquet и Dr Cesira Batini, нейрофизиолога из CNRS в Париже. Нарушение, которое затрагивает гомозиготных epileptic chickens (epi/epi) заключается в судорогах типа 'grand mal' вследствие или световой или звуковой стимуляции. Путем трансплантации целых или частичных prosencephalic, mesencephalic или rhombencephalic пузырей головного мозга, попытались определить нервные пути, участвующие в начале световой или аудигоенной формы эпилепсии (Teillet et al. 2005). Было установлено, что ядро mesencephalicus (pars dorsalis) запускает судороги после переработки любого из стимулов (звука или света). Мутантные 'epi' цыплята теперь можно рассматривать как уникальную животную модель для плохо изученного субкортикального типа эпилепсии человека (Guy et al. 1992; Fadlallah et al. 1995; Teillet et al. 1995; Batini et al. 1996).

The avian embryo in developmental immunology

The 'small lymphocytes' enigma

В 1960s не существовало в литературе общего согласия относительно источника и даже точной роли класса белых клеток крови, обозначаемых в то время 'малыми лимфоцитами'. Эти клетки характеризуются узким ободком цитоплазмы, были обнаружены в значительных количествах в тимусе эмбрионов и молодых животных, а позднее в жизни после регрессии тимуса и полового созревания, в лимфатических узлах, селезенке, костном мозге и циркулирующей крови. У птиц дополнительным местом накопления малых лимфоцитов стал орган, присоединенный к клоаке, сумка Fabricius, котора не существует у др. позвоночных. Ничто в то время не позволяло различать морфологически малые лимфоциты из разных мест. Было установлено, что эти клетки принадлежат двум разным семействам, в зависимости от их эмбрионального происхождения и их функции в иммунном ответе, благодаря экспериментам на эмбрионах кур.

Наблюдение, что подобно тимусу сумка Fabricius (BF) регрессирует при половом созревании птиц позволило предположить, что развитие этого органа, чья функция оставалась загадкой, находится под гормональным контролем. Bruce Glick, эндокринолог проверял эту гипотезу путем воздействия тестостерона на эмбрионов кур. Если эмбрионы подвергались воздействию рано (5-7 дни инкубации) , то развитие сумки ингибировалось полностью. При более поздних инъекциях (11-12 дни) её развитие серьёзно затормаживалось и не происходило дифференцировки лимфоцитов: BF не становилось лимфоидной и выглядела подобно пустому эпителиальному мешку при рождении. Во всех случаях эмбрионы кур, обработанные тестостероном были лишены плазмоцитов и циркулирующих в крови антител и не были способных иммунной реакции, хотя они всё ещё обладали малыми лимфоцитами, происходящими из тимуса. Гуморальный иммунитет т.о., отсутствовал у таких птиц, следовательно, лимфоциты, развивающиеся из сумки птиц являются предшественниками плазмоцитов.

D Melbourne, Miller (1960) как раз в это время показал с помощью удаления тимуса у новорожденных мышей, что функция лимфоцитов, которые дифференцируются в тимусе, ответственна за обеспечиваемый клетками иммунитет против вирусной инфекции и за отторжение трансплантатов (Glick 1957, 1964; Good et al. 1966; Cooper et al. 1966).

Удивительно, но птицы с удаленной сумкой всё ещё оказывались способны отторгать гетерологическую ткань трансплантатов. Эти наблюдения показали, что малые лимфоциты, происходящие из тимуса были ответственны за обеспечиваемый клетками иммунитет (в основном направленный против вирусной инфекции) и отторжение трансплантатов.

Впоследствии были распознаны два класса лимфоцитов: T-лимфоциты, происходящие из тимуса, ответственные за обеспечиваемый клетками иммунитет и отторжение трансплантатов, и B-лимфоциты, продуцирующие антитела и гуморальный иммунитет, происходящие из BF у птиц и из костного мозга у др. позвоночных, у которые не обнаружено эквивалента сумки.

Эти открытия заложили основу для существенного прогресса в области клеточного иммунитета.

On the embryonic origin of the lymphocytes

Др. проблема, связанная с лимфоцитами, выявилась в начале 1970s. Эмбриональный источник (в терминах зародышевого слоя) лимфоцитов оказался неясным. Для некоторых авторов T-лимфоциты дифференцируются из эпителиального компонента тимуса, сам он происходит из глоточных карманов. Согласно др. авт. лимфоциты развиваются из первичного лимфоидного органа (тимуса и сумки Fabricius), происходящего из внешнего источника: hematopoietic stem cells (HSC) мезодермального происхождения, как полагали, колонизирующих энтодермальные рудименты этих оранов. Существование плюрипотентных стволовых клеток, способных генерировать различные клеточные компоненты крови у взрослых и их способность к самообновлению в недифференцированном состоянии, было установлено, перед этим in vivo Till & McCullock (1961) и in vitro Don Metcalf in Melbourne and Leo Sachs in Israel (see Metcalf & Moore 1971 and Le Douarin 1976 for references).

Т.о., мнение, согласно которому лимфоциты происходят из энтодермальных-эпителиальных предшественников ставит лимфоциты в др. ряд по сравнению с др. клетками крови, которые, как было установлено, происходят из мезодермы посредством HSC.

Первым намеком, указывающим на энтодермальное происхождение лимфоцитов, стали не совсем аккуратные эксперименты Moore & Owen (1965). Эти исследователи получали сосудистые анастомозы между эмбрионами кур разного пола посредством их внеэмбриональных мембран. Если анастомозы вызывали до 7-го дня инкубации, то клетки, содержащиеся в тимусе позднее происходили не только от хозяина этого органа, но и также от животного др. пола, с которым был установлен общий кровоток. Диагностика эмбрионов базировалась на наблюдения половых хромосом в метафазе арестованных клеток. Пропорция таких метафазных клеток среди всех клеток органа была очень низкой. Хотя и было продемонстрировано, что развивающийся тимус воспринимает клетки из крови во время свой дифференцировки в гематопоэтический орган, эксперимент не показал, что лимфоциты тимуса были из внешнего источника.

Маркерная система quail/chick была использована для решения этой проблемы (Le Douarin & Jotereau 1973, 1975; Le Douarin et al. 1975).

Это положило конец противоречиям о источнике лимфоцитов, эксперименты определенно показали, что они возникают как и др. клетки крови из общего предшественника, HSC. Впервые это было показано на птицах, а затем подтверждено на др. позвоночных (Le Douarin & Jotereau 1973, 1975; for a review see Le Douarin et al. 1975).

Emergence of the regulatory T cell (Treg) concept: Role of the thymic epithelium in the development of cells able to down regulate the peripheral immune response

Механизмы, лежащие в основе толерантности к собственным клеткам, остается центральной проблемой иммунологии. Frank Macfarlane Burnet и Peter Medawar получили Nobel Prize в 1960 за предположение, толерантность к самому себе индуцируемая с помощью тканевых антигенов, присутствует уже в эмбриональной и ранней постнатальной жизни. Наши собственные эксперименты состоящие в реципрокном введении тканевых трансплантатов эмбрионам двух очень близких видов птиц, перепела (Coturnix coturnix japonica) и кур (Gallus gallus) задолго до начала дифференцировки иммунных клеток, показали, что этот механизм недостаточен для объяснения аутотолерантности: в наших экспериментах чужеродная ткань, хотя и присутствовала в ходе всего развития, не становилась толерантной и отторгалась, как только реципиент достигал иммунной зрелости. Мы установили, что может быть индуцирована безупречная толерантность чужеродной ткани, даже от др. вида, если трансплантат соматической периферической ткани (конечности, сердца, сумки Фабрициуса) от эмбриона перепела имплантируется эмбрионам кур вместе с эпителием донорского тимуса (Le Douarin et al. 1996; Salaьn et al. 2005 for reviews).

Согласно гипотезе Burnet and Medawar's , позднее доработанной Lederberg (1959), обучение 'self' приобретается с помощью 'негативного отбора'.

Чтобы гарантировать защиту организма от инфекционных агентов иммунная система д. быть оснащена полным репертуаром антигенных специфичностей. Др. словами, она д. быть способна распознавать все возможные молекулярные формы, которые могут нести патогены и чужеродные клетки, с которыми может столкнуться. Это специфическое распознавание д. быть связано c механизмами избавления, которые элиминируют микробов и нейтрализуют токсины. Более того, такое специфическое распознавание в основном происходит от случайных генетических процессов, которые оперируют соматически в локусах иммуноглобинов и T-клеточных рецепторах во время дифференцировки лимфоцитов, каждый из которых в конечном итоге оснащается одиночной специфичностью.

Универсальные способности к распознаванию приобретаются T и B лимфоцитами, как же оказывается возможным, что иммунная система позвоночных распознает все антигены за исключением тех, что принадлежат самому организму?

Согласно Burnet, Medawar и позднее Lederberg (1959) недавно продуцированные лимфоциты проходят через состояние незрелости, во время которого распознавание антигенов приводит к их гибели. У эмбрионов и во время ранней постнатальной жизни они контактируют с собственными антигенами. Лимфоциты, которые оснащаются рецепторами с высоким сродством к собственным антигенам, поэтому элиминируются , тогда как лимфоциты в тимусе, костном мозге или на периферии со специфичностью, направленной не против самого себя, выживают. Следовательно, такой 'негативный' клон элиминирует потенциально угрожающие клетки вскоре после их возникновения. Эта теория была очень привлекательна из-за свой простоты и пока рассматривались T клетки, стали раздумывать, как подтвердить, что 'тимус отбирает пригодные, пренебрегает безвредными и расстраивает вредные' (von Boehmer et al. 1989) , которые позднее должны были становиться само-реактивными очень опасными лимфоцитами.

Некоторые проблемы, однако, вызвали сомнения относительно этой теории, среди прочих тот факт, что само-реактивные лимфоциты могут регулярно обнаруживаться в периферической крови и тканях здоровых индивидов, указывая, что негативный отбор не полон (see Coutinho et al. 1995) и др. механизм д. нейтрализовать потенциально вредные ауто-реактивные клетки, которые сбежали из тимуса (Coutinho 2005).

Поэтому к 'по умолчанию' индуцированной толерантности, возникающей в результате негативной селекции, была добавлена 'доминантная' толерантность, указывающая, что некоторые T клетки приобретают при контакте с эпителием тимуса способность ингибировать активацию само-реактивных клеток, присутствующих на периферии (Coutinho 2005). Это стало демонстрацией механизма, способного 'супрессировать' активацию лимфоцитов, которые распознают антигенные детерминанты, относящиеся к 'самому себе'.

Такие клетки, чье существование было впервые продемонстрировано у птиц в экспериментах с химерами (Ohki et al. 1987, 1988), позднее они были найдены также у модельных мышей и продемонстрировали их принадлежность к CD4 T клеткам (Salaьn et al. 1990; Modigliani et al. 1995, 1996; Coutinho et al. 1993; : Thomas-Vaslin et al. 1997). Эти находки находятся в согласии с открытием регуляторных T клеток (Treg) (Sakaguchi 2000; Wood & Sakaguchi 2003; Sakaguchi et al. 2008), которые теперь активно исследуются во многих иммунологических лаб. мира.

About the embryonic origin of the blood cell lineage

Исследования происхождения клеток крови у высших позвоночных в значительной части были проведены на эмбрионах кур, у которых, как и у амниот, клетки крови и эпителий, выстилающий внутреннюю стенку кровеносных сосудов, возникает сначала в желточном мешке, где происходит разделение двух клонов: периферические клетки из клеточных агрегатов, обозначаемые как кровяные островки, становится эндотелиальными, тогда как внутренние клетки островков дифференцируются в клетки крови. После пионерских исследований Maximow (1909) и Vera Dantschakoff (1909), которые предположили возможную онтогенетическую связь между гематопоэтическими и эндотелиальными клетками, Murray (1932) придумал термин 'hemangioblast', чтобы обозначить постулируемый общий предшественник. Это предположение было доказано годы спустя, продемонстрировав, что гемангиобласты оказываются отделенными рано от др. типов клеток мезодермального происхождения: они экспрессируют рецептор для vascular endothelium growth factor (VEGFR2), как было установлено, Eichmann et al. (1997) на эмбрионах птиц. Изолированные в культуре при соотв. условиях эти VEGRF1-позитивные клетки были способны давать как эндотелиальные клетки, так и HSC.

По следам их демонстрации, что рожденные кровью HSCs колонизируют все гематопоэтические органы, отличные от желточного мешка, Moore and Owen выдвинули в 1967 дальнейшую гипотезу, согласно которой желточный мешок д. быть как у эмбрионов птиц, так и млекопитающих, исключительным местом продукции HSCs на всё время жизни индивида. Позднее, однако, гематопоэтическая активность гемангиобластов желточного мешка, как было установлено, является временной и замещается во время развития HSCs, возникающими во внутриэмбриональном сайте (Dieterlen-Liиvre 1975). Это впервые было открыто с помощью уникальной химерной конструкции, придуманной у птиц (Martin 1972), благодаря особой компановке эмбрионов этого класса позвоночных, которые лежат плашмя на желтке, их центральная область является презумптивным телом эмбриона, более периферическая область становится желтковым мешком. Операция состояла в замещении in vivo тела курицы эквивалентной зоной бластодиска перепела. Шов, наложенный между трансплантированной центральной тканью и ткань периферического мешка, давал эмбрион перепела с куриным желточным мешком. У таких химер все гематопоэтические органы иные, т.к. желточный мешок содержал исключительно кровяные клетки перепела. Циркулирующие в крови эритроциты были куриными вплоть до 5-го дня инкубации 5 и постепенно замещались эритроцитами перепела (Beaupain et al. 1979). Замещение крови было обнаружено в химерах курица/курица, чьи два компонента были получены от линий, отличающихся или по MHC class I антигенам или гаплотипам иммуноглобулина. У этих химер одного вида было установлено, что во время вылупления все кровяные клетки, происходящие из стволовых клеток желточного мешка, исчезают (Lassila et al. 1978, 1982). Возникновение внутриэмбриональных гематопоэтических стволовых клеток может быть приписано вентральному аспекту аорты (Cormier & Dieterlen-Liиvre 1988), происходящей из более ранней ткани para-aortic спланхноплевры.

Существование второго источника HSCs было подтверждено у амфибий с помощью трансплантаций меченных вентральных кровяных островков (VBI) у эмбрионов (Turpen et al. 1981; Turpen & Knudson 1982), или с помощью мечения клонов индивидуальных бластомеров на 32-клеточной стадии (Ciau-Uitz et al. 2000). Более поздние эксперименты показали довольно ясно, что компартмент, эквивалентный аортальной области птиц (дорсальная латеральная пластинка у Xenopus) происходит из бластомера, отличного от тех, которые дают компартмент, эквивалентный желточному мешку (VBI).

Это мнение о происхождении HSC у эмбрионов птиц инспирировало исследования на эмбрионах мышей с использованием in vitro культур и трансплантаций взрослым иммунодефицитным мышам (Godin et al. 1993; Medvinsky et al. 1993; Cumano et al. 1996a; Medvinsky & Dzierzak 1996). Э ти подходы, распространенные на млекопитающих привели к заключению, продемонстрированному на эмбрионах птиц. Даже у эмбрионов человека аорта, как было установлено, дает HSCs, т.е. является вторым гемогенным местом, помимо желточного мешка (Tavian et al. 1996; review in Tavian et al. 2010).

Yet another step of HSC commitment: the allantois (fetal component of the placenta) is hemogenic

Наконец, птичий образец открыл новую перспективу, возникающую из демонстрации, что др. придаток эмбрионов птиц, аллантоис, продуцирует HSCs. У эмбрионов кур и перепала аллантоис является относительно поздно вырастающих зачатком, придатком. который возникает из кишки в начала 3-го дня инкубации. Будучи перенесен в культуру, зачаток продуцирует большие количества эритроцитов. Это наблюдение способствовало in vivo подходам, заключавшимся в гетеротопических трансплантациях этого раннего рудимента от перепела в целом кур. Хозяйский костный мозг предоставлял кров спустя 2 недели до 8% клеткам перепела, которые были диагностированы как гематопоэтические или эндотелиальные клетки (Caprioli et al. 1998). Появление этих HSCs и EC предшественников может быть отслежено обратно к не васкуляризованному зачатку аллантоиса (Dieterlen-Liиvre et al. 2010).

Эта находка была расширена на плаценту мыши, установив плодный компонент этого придатка (происходящий из аллантоиса) в качестве главного поставщика HSCs развивающемуся плоду (Alvarez-Silva et al. 2003; Gekas et al. 2005; Ottersbach & Dzierzak 2005; Zeigler et al. 2006; Corbel et al. 2007; Barcena et al. 2009).

Developmental history of the aortic hemangioblast

Как было описано выше существование гемангиобласта, общего предшественника для HSCs и ECs, было предположено и продемонстрировано на культурах клеток из будущего желточного мешка из очень ранних бластодисков птиц (Eichmann et al. 1997). Второй эмбриональный сайт, где эндотелиальные клетки и гематопоэтические клетки обнаруживают очень интимные анатомические взаимоотношения во время развития это дно аорты на 3-й день инкубации. Анатомические связи предполагают общую историю (Jordan 1916). У эмбрионов кур аортальные кластеры появляются вскоре после слияния двух зачатков аорт. Они обладают многими общими поверхностными белками с ECs и экспрессируют общие транскрипционные факторы. Клетки дна оказываются резко демаркированы от ECs, когда они начинают экспрессировать транскрипционные факторы c-myb и runx1 (необходимые для возникновения гематопоэза) и теряют VEGFR2 и ve-cadherin (специфичные для эндотелия молекулы) (see Jaffredo et al. 2010 for a review). Эти клетки, отличающиеся от др. эндотелиальных клеток аорты, развиваются в кластеры из округлых клеток, которые выпячиваются в просвет аорты и исчезают спустя 24 ч.

Механизм, который специфицирует особую судьбу этих вентральных аортальных клеток, интригующий. Чтобы декодировать этот механизм был использован экспериментальный подход с помощью моноклональных антител MB1/QH1, которые распознают кровяные и эндотелиальные клетки перепела, но не кур (Pйault et al. 1983; Pardanaud et al. 1987). Построение аорты уникальный процесс: она возникает из двух латеральных зачатков, производных мезодермальной спланхноплевры, которые сливаются по срединной линии эмбриона. Путем обмена сомитами между эмбрионами перепела и кур, было показано, что примитивный эндотелий аорты оказывается полностью замещен клетками, продуцируемыми сомитами. Клетки, предназначенные для гематопоэза, происходят из примитивной спланхноплевральной мезодермы, которая вступает на путь гематопоэза, когда они оказываются расположенными в дне аорты, где они форсируются с помощью направленного в вентральную сторону продвижения клеток из сомитов (Pardanaud & Dieterlen-Liиvre 1999; Pardanaud et al. 1996; Jaffredo et al. 1998, 2000, 2005; review in Jaffredo et al. 2010). Клетки, происходящие из спланхноплевры исчезают полностью после образования гематопоэтических кластеров. Т.о., аортальные клетки, которые переключаются на гематопоэз, происходят из спланхноплевральной мезодермы, тогда как дефинитивные эндотелиальные клетки аорты происходят из сомитов. Клетки из сомитов также дают эндотелиальные клетки кровеносных сосудов стенки тела и конечностей, но никогда не мигрируют во внутренние органы. Следовательно, это два самостоятельных эндотелиальных клона появляются во время развития, вентральный происходит из спланхноплевральной мезодермы, который дает весцеральные эндотелии и гематопоэтические кластеры в аорте, и дорсальный клон сомитного происхождения, ответственный за васкулогенез в соматоплевре и за формирование дефинитивной аорты (Pardanaud et al. 1996). На этих ранних стадиях развития только вентральный клон, по-видимому, содержит предшественники как с эндотелиальным, так и гематопоэтическим потенциалом.

Некоторые исследователи предпочитают заменить термин 'гемангиобласт' выражением 'гемогенный эндотелий' , чтобы отдавать долг последовательным событиям, посредством которых выстилка эндотелиальных клеток эмбрионального сосуда трансформируется в гематопоэтические клетки.

Является ли история развития аорты, открытая у птиц, такой же и у млекопитающих, остается открытым вопросом. Очень интересно, однако, что эндотелиальные клетки могут быть помечены на определенной стадии эмбриогенеза путем скрещивания мышей, несущих индуцибельный Ve-cadherin (специфичный для эндотелия кадгерин) Cre ген в ROSA26R Cre репортерной линии (Zovein et al. 2008). Короткое пульсовое воздействие tamoxifen, оказываемое на стадии внутриаортальных кластеров, индуцирует Cre, и таким образом метит постоянно эндотелий, присутствующий на этой стадии и его потомство. Обильно меченные гематопоэтические клетки обнаруживаются позднее в печени плода, костном мозге и тимусе. Эта специфическая экспериментальная система предоставляет, как и модельные птицы, выдающиеся преимущества, которые позволяют отслеживать у эмбриона процесс развития. Прохождение через эндотелий-подобный фенотип было также открыто на культивируемых клетках, происходящих из эмбриональных стволовых клеток, путем наблюдения за исчезновением специфичных для эндотелия антигенов и появления гематопоэтических антигенов или транскрипционных факторов (Choi et al. 1998; Lancrin et al. 2009; Eilken et al. 2009). Однако эта искусственная клеточная система не позволяет быть уверенным, что происходит на определенных стадиях развития в изменяющихся микроусловиях, которые превалируют в эмбрионе. Итак, разные линии доказательств подчеркивают появление эндотелиальной стадии в переходе от мезодермы в направлении гематопоэза во время аортальной фазы возникновения HSC.

Возможно, что будущие исследования привнесут больше ясности в эту картину. Во всяком случае, многоступенчатая детерминация HSCs, также как и онтогенетические взаимоотношения между EC и HSCs, которые хорошо установлены, впервые были расшифрованы на модельных птицах и позднее распространены на др. классы позвоночных, особенно млекопитающих.

Concluding remarks

This overview relates a few of the advances in our knowledge about developmental mechanisms that emerged from work using the avian embryo. As emphasized here, this model turned out to be remarkably powerful.

One of its major features, adaptability, is highlighted in this brief historical survey. The avian embryo was first used to test the toxicity and teratogenicity of various substances and also to produce different types of developmental abnormalities purposefully. The making of monsters was, at the dawn of experimental embryology, a method to try and understand development (e.g. Wolff 1936).

A novel and fruitful experimental approach was opened when the transplantation of the entire embryo in a culture dish leading to normal early development was devised (New 1959). Another improvement came from culturing developing tissues and organ rudiments in a manner that maintained the tridimensional arrangement of their constitutive cells (see the organotypic culture system of Wolff & Haffen (1952).

Easy access to the embryo in the egg during the entire period of development and robustness favored greatly the use of the avian model for experimental embryology, by allowing sophisticated microsurgery in vivo. The quail/chick cell marking technique based on the construction of viable chimeric embryos was a significant progress. It increased the value of the model by making it possible to follow the migration of embryonic cells and to disclose their fate not only in embryos but also after birth. Problems related to immunological tolerance and neural behavior thus became approachable in a novel and original way. Finally, the avian model entered the molecular era when the chick genome was sequenced (2004) and when localized in vivo transgenesis was made possible by in vivo electroporation (Nakamura et al. 2004).