Традиционно сердце рассматривается как постмитттический орган, который неспособен к репарации любых форм повреждений (Cantin et al., 1981). Однако эта догма недавно была поставлена под угрозу, когда были обнаружены в сердце стволовые клетки. Накапливаются доказательства, что стволовые клетки и клетки предшественники располагаются вовзрослом сердце (Urbanek et al., 2006; Bearzi et al., 2007, 2009; Meinhardt et al., 2011). Более того, эти клетки ответственны за оорот и деления в ответ на повреждения миокарда (Poss et al., 2002; Beltrami et al., 2003; Oh et al., 2003; Laugwitz et al., 2004; Messina et al., 2004; Bollini et al., 2011). Кроме того, кандидаты на роль (cardiac stem cells)/CPCs (cardiac progenitor cells) были идентифицированы благодаря поверхностным клеточным маркерам, экспрессирущимися стволовыми клеткамми в др. тканях, такие как Sca-1 (stem cell antigen-1) (Matsuura et al., 2004), c-Kit (Miyamoto et al., 2010) и N-cad (N-cadherin; Frisch et al., 2008). Однако прямая идентификация определенных CSCs/CPCs проблематична из-за отсутствия специфических антигенов для стволовых клеток. Принимая во внимание, что сердце у взрослых млекопитающих является молчаливым органом, поэтому трудно идентифицировать и локализовать находящиеся в ткани CSCs/CPCs. Метод LRC (label retaining cell) является важным методом , используемым, чтобы локализовать стволовые клетки и идентифицировать их как медленно делящиеся, молчащие или сегрегирующие асимметрично хромосомы (Karpowicz et al., 2005; Shinin et al., 2006; Rando, 2007). ASCs (adult stem cells) могут быть мечены c помощью ДНК синтеза аналогов предшественников, такиех как 3H-TdR или BrdU (bromodeoxyuridine) во время развития или регенерации ткани. Ранние исследования показали, что эти метки, разводятся c помощью TACs (transit-amplifying cells) после продолжительной погони (chase). Напртив, ASCs должны сохранять эти метки в течение длительного периода (Cotsarelis et al., 1990). Соотв., долговременное сохранение меток клетками д. отражать их 'стволовость', и было использовано для идентификации располагающихся в ткани стволовых клеток и оценки оборота популяции стволовых клеток в др. соматических тканях (Smith, 2005; Foudi et al., 2009). Более важно то, что LRCs были обнаружены даже во взрослых почечных сосочках (Oliver et al, 2004) и печени (Li et al., 2010) с нечастыми клеточными делениями, а также c помощью этого метода во взрослом сердце мышей (Urbanek et al., 2006). Для дальнейшей идентификации и локализации CSCs/CPCs в сердце нормальных взрослых мышей были осуществлены эксперименты по сохранении метки у новорожденных мышей и LRCs были обнаружены, используя иммуногистохимический метод in vivo.
Медикамент 5-Fu (5-fluorouracil) является токсическим для клеток, которые синтезируют ДНК. Ранние исследования показали, что более примитивные стволовые клетки могут быть увеличены в числе после применения 5-Fu (Hodgson and Bradley, 1979); последующие исследования подтвердили более ранние исследования (Van, 1984). Здесь 5-Fu был использован, чтобы убивать быстро пролиферирующие клетки и активировать выжившие CSCs/CPCs, что делает возможным дальнейший экспреимент с мечением. Такой метод сохранения мечения и быстрый KAL метод использовали для идентификации и локализации возможных CSCs/CPCs.
Discussion
Полученные данные предоставили иммуногистохимические доказательства наличия популяции редких кардиальных клеток, которые могут сохранять яркую BrdU метку в течение 24 мес. in vivo. Это не только убедительно показывает, что LRCs (возможные CSCs/CPCs) существуют во взрослом сердце мышей, но и также подтверждают и объясняют данные 2- предыдущих BrdU pulse-chase экспериментов на взрослых грызунах (Urbanek et al., 2006; Gonzalez et al., 2008). Было также продемонстрировано, что LRCs преимущественно располагаются в верхушке, левом желудочке, кардиальных клапанах и сосудистых эндотелиальных регионах сердца, хотя предлагаются и некоторые предполагаемые анатомически компартменты CSCs/CPCs (Urbanek et al., 2006; Meinhardt et al., 2011).
На основании процедуры BrdU мечения, было показано, что ~4% кардиаьных клеток имели яркую BrdU метку спустя 24 мес. наблюдений, в противоположность предыдущим данным на взрослых мышах (~1.3% кардиальных клеток имели яркую BrdU клеток спустя 10 недель (Urbanek et al., 2006) и ~0.3% кардиальных клеток имели яркую BrdU спустя 12 мес. наблюдения (Meinhardt et al., 2011) и у крыс (~1% кардиальных клеток оказывались BrdU позитивными спустя 12 недель; Gonzalez et al., 2008). Остается неясным, связаны ли LRCs, идентифицированные в этих исследованиях, с регенерацией сердца. Имеются некоторые причины для разногласий. Одна из возможностей заключается в том, что имеются различия в возрасте и линиях животных или что LRCs в нашем исследовании являются более примитивными, чем клетки в исследованиях этих авторов. Более важно, что наши результаты отражают действительный размер тотального пула медленно делящихся клеток в сердце. Др. возможность заключается ву том, что LRCs , идентифицированные в др. исследованиях могут быть лишь TACs, и они естественно (bona fide) не являются кардиальными стволовыми клетками и клетками предшественниками. Количество CSCs/CPCs метящихся c помощью BrdU было больше, чем у взрослых мышей, но дальнейшие эксперименты помогут выяснить, не является ли это результатом различий в дозе BrdU. Наши BrdU позитивные клетки могут быть обнаружены у нормальных мышей в возрасте 4-5 недель после одиночного пульсового воздействия BrdU pulse, процент составляет ~0.3% (Figure 2A). Более того, после того как эти TACs были убиты под действием 5-Fu (Figure 2B), активируются находящиеся в ткани CSCs/CPCs и принимают участие в регенерации поврежденного сердца. Они будут также сохранять BrdU метку после завершения регенерации (Figures 2C and 3B-3E).
Кроме того, наше исследование открыло два новых аспекта, один в предоставлении более исчерпывающих данных о кинетике разбавления метки спустя 1 год наблюдения (Figure 1G); и также в предоставлении модели оборота LRCs от рождения до старости. Во-вторых, предоставлены более убедительные доказательства регенерации располагающихся в ткани CSCs/CPCs в сердце после повреждения, когда эти TACs были убиты. Во всем пуле стволовых клеток сердца только небольшое количество кардиальных клеток происходит из LRCs ( ~0.3%) в результате временно пролиферации.
Cairns (1975) впервые предложили гипотезу, что ASCs поддерживают 'бессмертную нить ДНК' c помощью асимметричных делений. С тех пор это было подтверждено большим количеством доказательств (Karpowicz et al., 2005; Foudi et al., 2009; Li et al., 2010), хотя имеются и доказательства, подтверждающие альтернативную точку зрения (Kiel et al., 2007). В нашем исследовании, меченные BrdU клетки были обнаружены в миокарде сердца после 24-мес. наблюдения (Figure 1F), это демонстрирует, что LRCs существуют в сердце взрослых мышей, которые могут содержать бессмертную нить ДНК. Эти результаты показывают, что оптимальное время мечения CSCs/CPCs наступает на 7-й день развития мыши.
Количество LRCs остается почти постоянным по мере старения и их процент становится ~4. Более того, присутствие 'BrdU bright' клеток спустя 24 мес. Указывает на то, что LRCs делятся асимметрично, что позволяет им сохранять метку после продолжительного наблюдения. Следовательно, не существует взаимосвязи между количеством LRCs и временем клеточных делений. Из данных, представленных выше, мы можем сделать вывод, что комбинация симметричных и асимметричных клеточных делений может происходить в ткани сердца у постнатальных мышей, тогда как LRCs (CSCs/CPCs) делятся асимметрично, чтобы сохранить 'бессмертную' нить ДНК для уменьшения в ней доли мутаций.
Как упоминалось выше, предыдущие исследования идентифицировали или изолировали c-Kit, Sca-1 позитивные клетки из сердца грызунов (Beltrami et al., 2003; Oh et al., 2003; Messina et al., 2004; Matsuura et al., 2004; Urbanek et al., 2006), и даже сердца человека (Bearzi et al., 2007), и идентифицировали N-cad+ клетки из костного мозга (Frisch et al., 2008). c-Kit или Sca-1 были впервые описаны как один из маркеров клеточной поверхности в HSCs (haemopoietic stem cells; van de Rijn et al., 1989; Okada et al., 1991). Кроме того, N-cad экспрессируется на поверхности длительно живущих HSCs (Frisch et al., 2008) и образуются на слипчивых соединениях посредством N-cad на поверхности остеобластов, представляющих ниши для HSCs в костном мозге взрослых животных. Сходный анализ был осуществлен в нашем исследовании; интересно, что BrdU/c-Kit и BrdU/Sca-1 двойные позитивные клетки составляли ~38 и ~15% что не соответствовало результатам др групп (Meinhardt et al., 2011) ( ~90% of LRCs были Sca-1) во время нормального состояния. Более того, c-Kit или Sca-1 позитивные клетки не были распределены в виде кластеров и локализовались в интерстициальных пространствах вблизи кардиомиоцитов, что находится в противоречии с предыдущими результатами (Urbanek et al., 2006; Bearzi et al., 2007; Meinhardt et al., 2011), что д. быть разрешено.
В дополнение, одна субпопуляция N-cad+ LTRs (long-term BrdU retaining cells) была идентифицирована в нормальном взрослом сердце и эти N-cad позитивные клетки не формировали интеркалированные дисковые структуры с соседними миоцитами, но формировали слипчивые соединения с соседними клетками (Figure 4C), которые, как полагают, составляют потенциальные ниши и могут слипаться с CSCs/CPCs.
Для индуцированных c помощью 5-Fu повреждений сердца, активированные CSCs/CPCs были распределены в виде кластеров с 0 ч до 4 дней, а две др. популяции c-Kit или Sca-1 позитивных клеток, по-видимому, были лишены экспрессии N-cad. Более важно, что процент этих клеток составлял ~15 и ~11% соотв (Figures 4D and 4E); однако процент BrdU и Sca-1 позитивных клеток оставался почти постоянным. Единственная возможность, что c-Kit+/BrdU+ клетки имеют длительное время пролиферации и что BrdU+/Sca-1+ клетки могут дольше идти по пути дифференцировки. Кроме того, экспрессия N-cad обнаруживается между 0 и 24 ч на 4-й день после повреждения. Далее, некоторые LRCs вместе с окружающими кардиомиоцитами формируют удивительное соединение в виде вмятины на 36 ч (Figure 3C). Следовательно, наши результаты подтверждают, что существует несколько разных субпопуляций CSCs/CPCs в сердце взрослых мышей и онии кооперируются вместе, чтобы репарировать поврежденное сердце при сдерживающих условиях.
После того, как TACs были убиты путем воздействия 5-Fu, более примитивных CSCs/CPCs активировались и метились. Более того, др. субпопуляции CSCs/CPCs также принимают участие в регенерации поврежденного сердца, помимо c-kit/BrdU и Sca-1/BrdU субпопуляций клеток (общий процент двух популяций >50%). Результаты временного пульсового воздействия BrdU показывают, что изменение в количестве CSCs/CPCs является удивительным после повреждения. Более того, эксперимент по отслеживанию также подтверждает, что время максимума уровня синтеза ДНК приходится на 0 ч до 4 дня после повреждения (Figure 3B). Более серьезные повреждения могут приводить к более короткому времени перехода G1/S. В то же самое время, 5-Fu-индуцированное повреждение, по-видимому,синхронизируется с клеточным циклом и быстрыми симметричными клеточными делениями CSCs/CPCs. По-видимому, CSCs/CPCs мобилизуются c помощью воздействия 5-Fu и делятся симметрично, чтобы увеличить популяцию стволовых клеток для генерации в поврежденном сердце. Наконец, ткани сердца полностью регенерируют сами себя в относительно короткий период времени. Последующие эксперименты позволят выявить, смогут ли варианты инъецируемых доз 5-Fu и BrdU влиять на результаты.
Итак, представленные выше находки вместе с ранними наблюдениями (Urbanek et al., 2006) подтверждают мнение о гетерогенности пула стволовых клеток, при этом из d-CSCs/CPCs возникают различные кардиальные клетки предшественники. Наиболее важно существование LRCs в сердце после индуцированного c помощью 5-Fu повреждения, это подтверждает, что LRCs играют важную роль в качестве пула регенеративных клеток.
Мы предоставили модель CSCs/CPCs в нормальном и поврежденном состоянии (Figures 1H and 4G): в нормальном состоянии при развитии после рождения часть активированных CSCs/CPCs д. превращаться в d-CSCs/CPCs, которые располагаются в компартментах. Однако эти d-CSCs/CPCs д. быть активированы и превращаться в активированные CSCs/CPCs снова, c помощью этих активированных CSCs/CPCs происходит регенераци в поврежденном сердце.
In summary,
although these experiments are only a small step in the study of CSCs/CPCs, the data prove conclusively that the LRCs of the heart are stem cells that are responsible for the regeneration of the injured heart. The experiments support the hypothesis put forward by Cairns, and produce direct evidence for LRCs (CSCs/CPCs) existing in the heart tissues of adult mice and containing immortal DNA strands. The LRCs are primarily located in the apex, left ventricular, cardiac valves and vascular endothelial regions of the mouse heart tissue, which indicate the heart is an organ regulated by several stem cell compartments. Similar to other tissues, heart tissues contain multiple compartments that have distinct responses to different types of injuries rather than a single location of CSCs/CPCs. The label retention method together with the KAL method provides a direct and rapid way to identify CSCs/CPCs and evaluate new stem cell markers within the heart.
