Восприятие сил клетками и, следовательно, необходимость механического ответа, чтобы стабилизировать клеточные сосединения как с соседними клетками, так и подлежащим внеклеточным матриксом. Cadherins являются слипчивыми белками, составляющими слипчивые соединения межклеточных контактов, тогда как с кадерином ассоциирвоанные белки и актиновый цитоскелет обеспечивают стабильрность и структурную поддержку между соседними клетками. E-cadherin комплекс идентифицирован как механосенсор в межклеточных контактах, где прикладывемые силы на внеклеточный домен E-cadherin приводят к vinculin-зависимому повышению жесткости клеток [1]. Vinculin-зависимая жесткость клеток наблюдается также в интегриновых соединениях [2,3], указывая на сходную роль vinculin в обоих подверженных воздействию сил межклеточных и клетка-матрикс соединениях. Т.о., vinculin может быть ключевым белком в генерации напряжения межклеточных контактов в ответ на внешние воздействия от соседних клеток.

Vinculin первоначально был идентифицирован как белок, ассоциированный с концами актиновых волокон, заканчивающихся в плезматической мембране [4]. Вместе с F-actin [5,6], дополнительными партнерами по связыванию с vinculin в фокальных адгезиях являются talin [7,8], paxillin [9],α-actinin [10] и фосфолипиды [11,12]. Vinculin состоит из головного и хвостового домена, которые связаны вместе посредством богатой пролином линкерной области и существует или в открытом, активированном состоянии, или закрытом, ауто-ингибированном состоянии, при котором головной и хвостовой домены взаимодействуют [13-15]. В открытом состоянии до этого скрытые сайты для партнеров по связыванию в vinculin стаовятся доступными. Активация винкулина достигается путем взаимодействия с одном из нескольких партнеров по связыванию с vinculin [14,16-18].

Ассоциация vinculin с integrins в фокальных адгезиях хорошо изучена, здесь vinculin соединяется с talin и paxillin, двумя integrin-связывающими белками [7-9]. В фокальных адгезиях, vinculin участвует в механических связях между интегринами, связанными с подлежащим внеклеточным матриксом, и актиновым цитоскелетом [3,19,20]. В этом положении vinculin выполняет основную роль в процессах, генерирующих силы, таких как клеточная миграция по двухмерной поверхности [21] и инвазия клеток в трехмерном матриксе [22]. Vinculin регулирует генерацию сил actomyosin в ответ на внешние сигналы посредством хвостового домена винкулина [3]. Хотя vinculin фокальных адгезий хорошо изучен, его роль в межклеточных контактах не изучена.

При биохимических исследованиях с очищенными белками возникают прямые взаимодействия между головным доменом vinculin и cadherin-ассоциированным белком α-catenin [23-25], при этом сайт связывания vinculin на α-catenin располагается между aa 326-509 [14,24]. Описаны дополнительные взаимодействия vinculin с β-catenin [26,27] или миозином VI [28]. Интересно, что рекрутирование vinculin в межклеточные контакты снижается с помощью ингибитора миозина II blebbistatin в некоторых линиях эпителиальных клеток [1,25,29], т.о., подтверждается роль vinculin в реакции на увеличение натяжения в межклеточных контактах. Ингибирующая область для связывания vinculin была идентифицирована на α-catenin (aa 510-697) и это указывает, что α-catenin существует или в закрытой конформации с ингибирующим доменом, закупоривающим сайт связывания vinculin, или в открытой конформации при повышении натяжения, так что сайт связывания vinculin становится доступным [25].

MDCK клетки являются протипической моделью поляризованных эпителиальных клеток, всё же взаимодействие vinculin с E-cadherin комплексом в MDCK клетках отличается от др. клеточных линий. Это приписывается низкому натяжению в монослое клеток MDCK в нормальных условиях возможно из-за уникального распределения cadherin в межклеточных контактах MDCK [30], это приводит к отсутствию zonula adherens со скоплениями vinculin, которое обычно наблюдается в др. линиях эпителиальных клеток [29]. Однако накопление vinculin возрастает в слипчивых соединениях, выстилающих края ран в модели заживления ран у MDCK, процесс, ингибируемый с помощью blebbistatin [25,29]. Кроме того, антитела к α-catenin, распознающие последовательность вблизи сайта связывания винкулина, располагаются в соединениях вдоль края раны, указывая тем самым доступность сайтов связывания vinculin на α-catenin в межклеточных контактах при повышении натяжения [25]. Также в обработанных HGF высоко миграторных клетках MDCK, повышенное укомплетование винкулином межклеточных контактов полностью меняется с включением blebbistatin, указывая на зависимость от myosin II [1]. Это указывает, что vinculin рекрутируется при условиях повышенного натяжения межклеточных контактов зависимым от активности myosin II способом. Интересно, что в монослое клеток MDCK с низким натяжением межклеточных контактов vinculin всё ещё локализуется в межклеточных контактах. Следовательно, дополнительные факторы (независимые от myosin II) могут быть рекрутированы с помощью vinculin в места межклеточных контактов, но механизмы, с помощью которых vinculin накапливается при таких условиях остаются неясными.

Целью данного исследования было изучение роли vinculin в испытывающих воздействие сил слипчивых соединениях и его рекрутирование в места межклеточных контактов. Использовали нокдаун винкулина и GFP-vinculin экспрессирующие клетки в методе заживления ран, было установлено, что vinculin необходим для собственно закрытия ран, а дефицит винкулина ведет к снижению скорости закрытия ран. Кроме того, показано, что рекрутирование vinculin в межклеточные контакты увеличивается со стабизацией F-actin.

Наши данные показали существование двух пулов vinculin в местах межклеточных адгезий: зависимых и не зависимых от myosin II пулов. В MDCK клетках myosin II зависимый пул выявляется только, когда межклеточные контакты находятся в условиях высокого натяжения (напр., производящие силы конткты во время заживления ран, Figure 5C), тогда как в покоящихся межклеточных контатах рекрутирование vinculin усиливается с помощью фармакологической стабилизации F-actin (Figure 5A and 5B). Отметим, что покоящиеся межклеточные контакты после воздействия как blebbistatin (Figure 4A) , так и jasplakinolide (Figure 5A and 5B) повышают силу F-actin, но только стабилизация F-actin с помощью jasplakinolide увеличивает рекрутирование vinculin в межклеточные контакты, указывая, что уровень F-actin не всегда коррелирует с рекрутированием vinculin. Рекрутирование зависимого от контрактильности пула vinculin скорее всего обеспечивается с помощью чувствительных к силам конформационных изменений α-catenin, это в свою очередь экспозирует ранее замаскированные сайты связывания vinculin [25]. Поскольку продуцирующие силы сайты клеток края раны содержат VASP, рекрутируемый с помощью zyxin, чтобы способствовать полимеризации актина [33], vinculin может также способствовать динамике актина, возможно, посредством нуклеационной активности его колючего конца [34], необходимой для трансмиссии сил.

В покоящихся межклеточных контактах jasplakinolide-индуцированная стабилизация актина способствует накоплению винкулина. Активность винкулина по side-binding/bundling актина может быть важной для поддержания стабильной актиновой сети в межклеточных контактах. Низкая концентрация vinculin в межклеточных контактах MDCK согласуется с нестабильной динамикой актина, наблюдаемой в зрелых межклеточных контактах [32]. Физиологический механизм стабилизации актина остается неясным, но димеры α-catenin, как было установлено, взаимодействуют в актиновыми филаментами, чтобы способствовать образованию пучков актина [35]. Следовательно, как α-catenin, так и vinculin могут работать вместе, чтобы поддерживать стабильной актиновую сеть в зрелых межклеточных соединениях. Более того, у эмбрионов Drosophila присутствуют две самостоятельные динамики актина, чтобы регулировать подвижность cadherin [36]. Эти два разных пула vinculin могут быть критическими для ключевой дивергенции функции актина и могут быть фундаментальным свойством регуляции актига в межклеточных контактах.