Способность развивающегося эмбриона соотв. образом выполнять свои морфогенетические программы зависит, частично, от регулируемых изменений в межклеточной адгезии (Steinberg, 2007; Hammerschmidt and Wedlich, 2008). Сверхсемейство адгезивных молекул cadherin является интегрирующим в этом процессе у всех позвоночных и многих беспозвоночных организмов (Gumbiner, 2005; Abedin and King, 2008). В целом cadherins составляют семейство Ca++-зависимых трансмембранных молекул клеточной адгезии, которые вносят вклад в способность клеток к сортировке и они играют критические роли в раннем развитии эмбриона. Protocadherins представляют самую большую группу cadherin-подобных молекул и широко экспрессируются в ходе всего развития и осуществляют многочисленные функции (Morishita and Yagi, 2007). Недавно роль не собираемых в кластеры non-clustered δ-protocadherins в эмбриональном развитии начала исследоваться. Эта подгруппа содержит разные группы молекул, которые экспрессируются во всех организмах позвоночных и недавно даже было установлено их присутствие у хордовых ciona (Yagi, 2008; Noda and Satoh, 2008). Сегодня известны 9 членов этой подгруппы, которые в дольнейшем могут быть подразделены на δ1 (PCHD -1,-7,-9,-11) и δ2 (PCDH -8,10,-17,-18,-19) protocadherins. Члены обеих подгрупп, как было установлено, играют критические роли в раннем эмбриональном развитии. PAPC (paraxial protocadherin, PCDH-8) является вообще-то лучше всего изученным в этой группе протокадеринов. Он экспрессируется рано в параксиальной мезодерме и его функция необходима для морфогенеза параксиальной мезодермы во время гаструляции, включая конвергентные и удлиняющие движения, разделение ткани и сомитогенез (Kim et al., 1998; Rhee et al., 2003; Medina et al., 2004; Unterseher et al., 2004; Chen and Gumbiner, 2006). PAPC обеспечивает эти процессы благодаря свой способности специфически подавлять адгезивную активность C-cadherin (Chen and Gumbiner, 2006; Chen et al., 2009) и благодаря свой способности взаиодействовать с Wnt рецептором, Frizzled-7 (Medina et al., 2004) чтобы активировать нижестоящую передачу сигналов посредством JNK и RhoA (Unterseher et al., 2004).
Др. δ-protocadherins также недавно были идентифицированы в качестве критических регуляторов морфогенеза. Напр., протокадерин нейральных складок, (NFPC, PCDH-7) и PCDH-19 специфически используются в морфогенезе нейральной эктодермы. Однако, делают это они за счет разных механизмов. NFPC взаимодействует с TAF1 на его цитоплазматическом хвосте в нейральной складку Xenopus, это взаимодействие необходимо для непосредственных цитоскелетных изменений (Heggem and Bradley, 2003; Rashid et al., 2006). У рыбок данио, PCDH-19 взаимодействует непосредственно с N-cadherin, чтобы обеспечить изменения в клеточной адгезии у рыбок данио, чтобы управлять нейруляцией в передней части нервной пластинки (Biswas et al., 2010). PCDH-18a также участвует в нейральном развитии у рыбок данио, где он влияет на клеточную адгезию и миграцию, но не на качественне особенности клеток (Aamar and Dawid, 2008). Фактически, ниодин из исследованных protocadherins не обнаруживал участия в изменениях клеточных судеб.
Axial protocadherin (AXPC, PDCH-1), как было установлено, участвует в морфогенезе хорды у
Xenopus laevis и , как полагают, действует также посредством своей адгезивной функции и способности вызывать рассортировку клеток (Kim et al., 1998; Kuroda et al., 2002). Его экспрессия совпадает с началом гаструляции, которая обнаруживает реципрокный паттерн относительно PAPC, при этом AXPC в области аксиальной хорды, PAPC в области параксиальных сомитов. Это открывает интересную возможность, как protocadherins действовать совместно, чтобы облегчить образование различных типов тканей. Согласно предыдущему сообщению избыточная экспрессия укороченной формы AXPC зарагивает морфогенез, с минимальными последствиями от потери функции (Kuroda et al., 2002). Поэтому мы исследовали более тщательно потерю AXPC и механизмы, с помощью которых AXPC способствует морфогенезу хорды.
DISCUSSION
Участие протокадерина в морфогенезе ранних эмбрионов представляет огромный интерес. Здесь мы показали, что AXPC, член подгруппы δ-protocadherin молекул, играет важную роль в морфогенезе хорды, благодаря свой способности регулировать экспрессию генов в дорсальной мезодерме. Мы идентифицировали второй аллель AXPC и установили, что этот аллель преимущественно экспрессируется во время раннего эмбриогенеза. Используя вновь созданный morpholino к этому аллелю, мы установили. что экспрессия AXPC необходима для морфогенеза эмбриона и, в частности, аксиальной мезодермы. Благодаря различиям в экспрессии аллелей, стало ясно, что ранее опубликованные данные, обнаруживающие слабые фенотипические отклонения с MO-1 (Kuroda et al., 2002) , обусловлены недостаточным уменьшением уровней белка AXPC.
Фенотип изгибания оси, связанный с потерей AXPC, отражает структурный дефект хорды. На стадии хвостовой почки клетки хорды оказываются сильно вакуолизированы, а на стдии головастика, усиливается осмотическое давление в хорде, тем самым генерируются очень жесткие палочко-подобные структуры, идущие вдоль A-P оси (Adams et al., 1990). Если имеются локальные дефекты в самой хорде, такие как потеря компонентов ECM, то хорда будет “деформироваться” в направлении ослабленной стороны , когда давление будет нарастать (Skoglund and Keller, 2007). Тот факт, что AXPC MO2–обработанные эмбрионы всегда искривляются в направлении стороны потери AXPC (и соотв. уменьшения компонентов ECM) подтверждает идею, что AXPC в конечном итоге вносит вклад в структурную целостность хорды. Поскольку клетки хорды первоначально не специфицированы и неспособны устанавливать границу с параксиальной тканью, то потеря матричных белков возможно отражает вторичных эффект потери AXPC, ведущий к наблюдаемым структурным дефектам.
Исследование эмбрионов с более тяжелыми фенотипическими отклонениями показало, что AXPC действительно участвует в ранних стадиях морфогенеза хорды, при этом, скорее всего, функционаирует в дорсальной мезодерме, чтобы помочь инициировать морфогенез аксиальной и параксиальной мезодермальных тканей. Наблюдаемая задержка закрытия бластопора может быть легко объяснена тем фактом, что дефекты в формировании паттерна мезодермы, как было установлено, вызывают задержку гаструляции, включая закрытие бластопора (Kofron et al., 1999; Yasuo and Lemaire, 2001). Поскольку дорсальная мезодерма у AXPC нокдаун эмбрионов лишена каких-либо различимых аксиальных или параксиальных структур и, фактически, полностью дезорганизована, не удивительно, что обнаруживается тяжелая задержка этого процесса.
Мы не нашли доказательств функционировани AXPC в качестве молекул клеточной адгезии, из-за их неспособности обеспечивать события клеточной сортировки. В отличие от PAPC, который подавляет адгезивную активность C-cadherin и олегчает клеточную сортировку (Chen and Gumbiner, 2006; Chen et al., 2009), AXPC обнаруживает незначительную способность вызывать события сортировки у сходных первичных клеток бластомера. Поскольку AXPC и PAPC экспрессируются в соседних тканях и преимущественно вместе в инициальной мезодермальной популяции в ранней гаструле, возможно, что они вообще-то функционируют вместе, чтобы обеспечить такое разделение. Однако, когда экспрессируются в противопложных клетках, то, по-видимому, не возникает составной эффект, помимо простой PAPC-обеспечиваемой сортировки, показано, что AXPC не влияет на функцию рассортировки клеток PAPC в транс-положении. Поскольку “отсутствие сортировки” приводит к отличиям от ранее опубликованных наблюдений с использвоанием укороченного AXPC (делеция всего цитоплазматического хвоста), то мы полагаем, что использование полной длины AXPC дает более аккуратное представление о биологической функции AXPC.
Несмотря на это отсутсвие сортирующей активности, целенаправленная избыточная экспрессия AXPC дает дефекты мезодермального развития, т.к. наблюдается дезорганизация сомитной мезодермы, экзогенно экспрессирующей AXPC, демонстрируя, что AXPC не обладает биологической активностью. Сходные нарушения у эмбрионов, экспрессирующих укороченный AXPC белок, наблюдались Kuroda et al (Kuroda et al., 2002), которые приписали эти пертурбации изменениям в клеточной сортировке, в отсутствие соотв. потери экспрессии маркерного гена. В обоих примерах экзогенная экспрессия AXPC может позволить экспрессию генов мишеней, поскольку происходит нарушение регуляции простаранственного и/или временного паттерна и, следовательно, нарушается развитие хорды и сомитов.
Наши результаты подтверждают гипотезу, что AXPC управляет морфогенезом хорды посредством регуляции качественных характеристик мезодермальных клеток. Пониженные количества chordin и MyoD достаточны для объяснения потери мезодермальных производных, поскольку оба необходимы для спецификации осевой и параксиальной мезодермы. соотв. (Harvey, 1992; Oelgeschlager et al., 2003). Эффект нокдауна AXPC специфичен для спецификации аксиальной и параксиальной мезодермы, т.к. общие ранние мезодермальные маркеры (Xbra и Xombi) активно экспрессируются. В подтверждение специфичности, экспрессия энтодермальных генов , по-видимому, нормальная у AXPC MO–инъецированных эмбрионов. Однако, экспрессия Sox2, специфичного для нейроэктодермы гена, существенно снижена. Это снижение Sox2 может быть объяснено тем фактом, что chordin необходим для индукции нервной ткани (Schulte-Merker et al., 1997; Oelgeschlager et al., 2003) , а потеря chordin должна обязательно приводить к потере экспрессии нейральных генов. Посколку “неспецифицированная” осевая мезодерма не воспринимает новую судьбу энтодермы или эктодермы, то скорее всего, программа развития по превращению общей в осевую мезодерму ингибируется.
Активная экспрессия AXPC начинается с началом гаструляции во время индукции общей мезодермы (Kuroda et al., 2002). Т.к. потеря AXPC приводит к неспособности мезодермальных клеток экспрессировать или chordin или MyoD, то мы предположили. что AXPC действует выше обоих этих генов. Тот факт, что chordin и MyoD являются маркерами аксиальной и параксиальной мезодермы. соотв. ведет к вопросу, как AXPC может участвовать в спецификации качественных особенностей как осевых, так и параксиальных клеток в одно и то же время? Возможно, что AXPC необходим рано для перехода качественных характеристик от общей к специфической мезодерме, а также позднее для поддержания выбранной судьбы хорды. Альтернативно, AXPC может быть специфически необходим для обеспечения качественных особенностей хорды, которые затем генерируют сигналы, необходимые для развития параксиальной мезодермы. Во всяком случае, когда AXPC теряется, то вся популяция мезодермы оказывается неспособной специифицироваться соотв. образом и морфогенетический план терпит неудачу.
Недавно было показано, что protocadherins играют важную роль в управлении разными аспектами морфогенеза эмбриона посредством разнообразных биологических функций. Образующие кластеры протокадерины могут или не могут регулировать клеточную адгезию во время развития нейронов (Yagi, 2008), но мало, если вообще, не образующие кластеры протокадерины обнаруживают непосредственную регуляцию межклеточной адгезиии. Однако, некоторые могут косвенно регулировать межклеточную адгезию и сортировку клеток (Chen and Gumbiner, 2006; Rashid et al., 2006; Aamar and Dawid, 2008; Biswas et al., 2010).
Здесь мы продемонстрировали, что AXPC функционирует в морфогенезе путем модулирования генной экспрессии скорее, чем с помощью событий клеточной сортировки. Способность AXPC регулировать экспрессию генов является уникальной функцией среди δ-protocadherins. Ни один др. член не обнаруживает непосредственного влияния на экспрессию генов. F PAPC также экспрессируется в ранней гаструле, но в отличие от AXPC, потеря PAPC только нарушает морфогенез мезодермы, и это не ведет к дефектам генной экспрессии (Unterseher et al., 2004). PAPC, как было установлено, обладает сигнальными способностями, т.к. он участвует в непосредственном тканевом разделении посредством XFz7 и в JNK пути посредством своего цитоплазматического хвоста (Medina et al., 2004), но возникающие в результате изменения в генной экспрессии не установлены. Полученные результаты добавляют ещё к функциям прокадеринов и подчеркивают важность этих молекул в критических эмбриологических процессах.
