Посещений:
ПЕРЕХОДНАЯ ЗОНА РЕСНИЧКИ

Структура и функция, гены и белки

The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicinePeter G. Czarnecki, Jagesh V. Shah
Volume 22, Issue 4, April 2012, Pages 201–210

Researchers from various disciplines, including cell and developmental biology, genetics and molecular medicine, have revealed an exceptional diversity of cellular functions that are mediated by cilia-dependent mechanisms. Recent studies have directed our attention to proteins that localize to the ciliary transition zone (TZ), a small evolutionarily conserved subcompartment that is situated between the basal body (BB) and the more distal ciliary axoneme. These reports shed light on the roles of TZ proteins in ciliogenesis, ciliary protein homeostasis and specification of ciliary signaling, and pave the way for understanding their contribution to human ciliopathies. In this review, we describe the interplay of multimeric protein complexes at the TZ, integrating morphological, genetic and proteomic data towards an account of TZ function in ciliary physiology.



Cilia: from architecture to function


С открытием ресничек (и жгутиков) они были обнаружены во многих ветвях древа эукариот и почти во всех клетках млекопитающих [1]. Самые ранние исследования сконцентрировались на роли ресничек в подвижности, как у большинства одноклеточных организмов и в специализированных тканях позвоночных (напр., в клетках респираторного эпителия и клеток репродуктивного тракта). В последние 10 лет интерес к ресничкам возродился. Получены доказательства роли ресничек в зависимых от ресничек механизмах в клеточных сигнальных процессах, тканевом гомеостазе, развитии и патогенезе болезней.
Значительная часть наших знаний о структуре ресничек получена с прогрессом ЭМ техники в 1950s -1970s (reviewed in [2]). Получены детальные морфологические карты. Согласно этим картам ресничка может быть разбита на разные субструктурные зоны с устойчивыми анатомическими свойствами: BB, TZ, зона дублетов и singlet зона с кончиковым комплексом реснички (Box 1). Из этих зон, TZ дает приют ряду удивительных ансамблей белков, которые, как полагают, обеспечивают соединение с мембраной реснички, создают барьер мембранной диффузии и пропускают белки, предназначенные для цилиарного компартмента. Более того, при болезнях человека из-за дисфункции ресничек, т.наз. 'ciliopathies', значительное количество белков располагается в TZ.

Box 1. General aspects of ciliary structure The ciliary TZ and axoneme arise from the BB. The structural core of the BB consists of a nonamer of MT triplets, in which the A-tubule is defined as the complete MT, associated with incomplete B- and C-tubules (Figure I). The BB terminates with the distal end of the C-tubule. From there on, the ciliary axoneme is composed of a scaffold of nine outer A-B MT doublets. In vertebrates, variations of the common ciliary theme are limited to immotile primary cilia and motile cilia, with a few exceptions. Immotile cilia share a common 9+0 (outer doublets, no central MTs) microtubular axonemal architecture and can be found in the form of primary cilia of epithelial and mesenchymal cells, or as highly specialized sensory cilia in olfactory or retinal photoreceptor cells. Motile cilia are characterized by a 9+2 constellation (outer doublets + central MTs) and are found on multiciliated cells of the respiratory tract or fallopian tube, as well as in the form of sperm flagella. One notable exception are the motile 9+0 cilia found at the embryonic node, which harbor dynein arms but no central pair. Toward the ciliary tip, B-tubules terminate in various organism- and cell-specific patterns, leaving behind distal A-tubule singlets. Those ultimately terminate in a ciliary tip substructure that also carries a variety of cell type specific characteristics. Not shown here are the molecules that support the dynamic process of intraflagellar transport (IFT) (reviewed in [43]). IFT is the primary mechanism by which proteins are transported within the ciliary compartment and, as such, plays a central role in cilium assembly and maintenance.



Figure I. Schematic representation of ciliary structure.

The ciliary TZ and the ciliary necklace


TZ зона реснички состоит из проксимальной части реснички, обладающей следующими свойствами (Figure 1): (i) TZ возникает на дистальном конце BB. Она соответствует propeller-like набору т.наз. переходных волокон, которые проецируются из B-тубул на уровне завершения C-тубул и проникают в плазматическую мембрану вокруг реснички. Как результат остов TZ состоит из 9 наружных дублетов микротрубочек (MT) с 9 оперенными пропеллерообразными структурами в их основании[3]. (ii) Основная часть TZ характеризуется присутствием множественных рядов Y-образных линкеров, проецирующихся из наружных дублетов и прикрепляющихся к мембране ресничек[4]. Эти линкеры совпадают с характерным окружным (circumferential) расположением инсерций мембранных частиц, обозначаемых как цилиарное ожерелье (Figure 1b), которое можно наблюдать на ЭМ замороженных и сколотых препаратах [5]. (iii) TZ заканчивается дистально последним рядом Y-линкеров. В 9+2 ресничках это совпадает с уровнем базальной пластинки и проксимальным концом центральной пары MT (Figure 1c).

Figure 1. The ciliary transition zone (TZ). (a) A schematic representation of the ciliary TZ shows its location between the basal body (BB) compartment and the doublet zone of the axoneme. At the distal end of the BB, terminal triplet microtubule (MT) architecture and transitional fibers are seen. The A- and B-tubules of the triplet MTs are continuous with the doublets (not shown here for clarity) within the TZ proper, where characteristic Y-linkers span from the doublets to the surrounding membrane. It is thought that these interactions produce (b) characteristic ciliary membrane imprints, referred to as the ciliary necklace. Reproduced, with permission, from [5]. (c) In the TZ of Chlamydomonas flagella, there is an additional central density with a barrel-shaped body within the space defined by the MT doublets and a wedge-shaped density projecting towards the membrane from the outer MTs. Reproduced, with permission, from [10]. (d) Although remarkably conserved, subtle structural differences exist between model organisms. At the start of the TZ, transitional fibers project from the B-tubule to the ciliary membrane at its junction with the apical cell membrane. The appearance of transitional fibers indicate the distal end of the BB because, at that point, C-tubules terminate and the TZ and axoneme consist only of outer MT doublets. Transitional fibers, also called alar sheets, form a propeller-like assembly leaving spaces of about 60 nm between neighboring sheets. The BB structures (grayed MT triplets) are only poorly discerned in Caenorhabditis sensory cilia, but transitional fibers can be observed. Within the TZ, all cilia have the characteristic Y-linkers connecting the outer doublet MTs to the ciliary membrane. In addition, Chlamydomonas has a stellate fiber array within the outer doublet array connected to all A-tubules that appears near the basal plate. Within the axoneme of motile cilia, such as in Chlamydomonas, an arrangement of radial spoke proteins connect the inner central pair of MTs to the outer doublets, and nexin fibers and dynein arms connect the outer doublets to each other. The sensory cilia of Caenorhabditis and the primary cilium of mammalian cells both lack the inner central pair and the basal plate from which they originate. In addition, they lack radial spokes, nexin fibers and dynein arms. Reproduced, with permission, from 10, 11, 30, 41 and 42. Scale bars, 100 nm.

Имеется несколько ключевых различий в свойствах TZ между организмами (Figure 1d). Напр., подвижные жгутики имеют признаки конфигурации 9+2, не наблюдаемой у 9+0 первичных ресничек, вместе с характерными динеиновыми плечами и радиальными спицами. Кроме того, внутренние цилиндры внутри просвета TZ являются уникальными для подвижных ресничек, как у Chlamydomonas (Figure 1d, left). BB Caenorhabditis плохо различимо с помощью ЭМ, но в сенсорных ресничках оно содержит мощные переходные волокна и их расположение может представлять собой минимальную структуру для зарождения (nucleation) TZ [6] (Figure 1d, middle). Сенсорные реснички Caenorhabditis также имеют singlet MTs, присутствующий в просвете аксонемы и TZ, которая не связана с центральной парой в подвижных ресничках. Даже с этими отличиями наблюдается высокая степень морфологического сходства между TZs в разных типах клеток, связанное с использованием набора консервативных составляющих и общих путей сборки.

Many human ciliopathy syndrome proteins localize to the TZ


Ciliopathies определяются как группа генетических нарушений, чьи генные продукты располагаются в ресничке. Многие цилиопатии являются сложными синдромами, которые включают почечные кисты, как одно из органных проявлений. Более того, многие цилиопатические гены были идентифицированы с помощью генетического анализа семей с синдромом кистозной болезни почек. Эти находки привели к гипотезе цилиарной природы polycystic kidney disease (PKD), это привело к предположению, что белковые продукты PKD генов располагаются в и осуществляют свои функции в или вблизи первичной реснички [7]. Напр., PKD1 и PKD2, генные продукты ответственны за более чем 95% случаев autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), оба обнаруживаются в первичных ресничках эпителиальных клеток почек [8].
Клиническое проявление синдрома аутосомно рецессивного кистоза почек начинается с nephronophthisis (NPHP), формы врожденной кистозной почечной дисплазии с прогрессивной потерей функции (Box 2). В качестве самостоятельного начала NPHP является наиболее распространенной причиной конечной стадии болезни почек в первые 30 лет жизни [9]. Однако, он может быть и компонентом более сложных нарушений. При Senior-Loken syndrome (SLSN), NPHP ассоциирует с пигментным ретинитом, приводя к дегенерации клеток фоторецепторов сетчатки и к последующей потере зрения. При Joubert syndrome (JBTS), NPHP сопровождается дегенерацией сетчатки, а также дефектами формирования паттерна ЦНС , преимущественно затрагивающими мозжечок. При Meckel-Gruber syndrome (MKS), наиболее тяжелыми заболеваниями в спектре, NPHP-подобная патология почек ассоциирует с фиброзно-кистозными изменениями в печени и желчной системе, дефектами сетчатки, полидактилия, тяжелые уродства ЦНС, такие как occipital encephalocele, и перинатальная летальность.



Box 2. Clinical and pathological features of human ciliopathies
Figure II. Clinical manifestations in the ciliopathy disease spectrum.

Human ciliopathies entail a large number of genetic defects that give rise to a wide spectrum of clinicopathologic entities [9]. Disorders of the motile cilium, such as Kartagener's syndrome, were the first discovered [44]. The large group of disorders of the primary cilium includes cystic malformation of the kidneys as one of the most consistent findings. In ADPKD, cysts grow throughout the renal parenchyma, resulting in massively enlarged kidneys (Figure IIa; reprinted, with permission, from [45]; mm ruler).
NPHP спектр синдромов следует аутосомно рецессивному паттерну наследования. При NPHP, цисты возникают в одной определенной зоне паренхимы почек, кортико-медуллярном соединении и приводят к атрофии канальцев и паренхимному фиброзу. В отличие от ADPKD, почки, однако, увеличены несущественно (Figure IIc; reprinted, with permission, from [46]; cm ruler).
SLSN представляет собой ассоциацию NPHP с пигментным ретинитом, приводящим к дегенерации пигментного эпителия сетчатки и потере зрения.
При JBTS, варьирующие степени NPHP сопровождаются дегенерацией сетчатки и уродствами ЦНС. Характерная гипоплазия vermis мозжечка проявляется клинически гипотонией, атаксией, аномальными движениями глаз и языка, нарушениями характера дыхания и психомоторной задержкой. Структурным эквивалентом является 'molar tooth sign', наблюдаемый на картинах головного мозга (Figure IIb; normal MRI on the left, molar tooth sign on the right; reprinted, with permission, from [47]). Фенотипический спектр JBTS может включать дальнейшие характерные органные проявления, с различной пенетрантность, приводящие к субклассам внутри спектра Joubert syndrome-related disorders (JSRD), таким как cerebello-oculo-renal syndrome (CORS). Синдромы, включающие врожденный фиброз печени также известны как COACH синдром (Coloboma, Oligophrenia, Ataxia, Cerebellar anomalies, Hepatic fibrosis).
MKS характеризуется почечной кистозной дисплазией, желчными кистами и печеночным фиброзом. Нарушения ЦНС очень тяжелые и часто сопровождаются occipital encephalocele с вытеснением задних частей головного мозга из черепа (Figure IId; reprinted, with permission, from [48]). Ассоциированные дефекты включают Leber congenital amaurosis (LCA) и постаксиальную полидактилию (Figure IIe; reprinted, with permission, from [49]). MKS ведет к плодной или перинатальной гибели. LCA является изолированным онтогенетическим дефектом фоторецепторных клеток сетчатки. В противоположность пигментному ретиниту не отмечается прогрессивной потери зрения после рождения. Др. цилиопатии, такие как Bardet-Biedl syndrome (BBS), синдром Alstrom, orofacial digital синдром и синдром Jeune обнаруживают симптомы клинически отличающиеся от спектра NPHP [9].


Хотя фенотипическое перекрывание между NPHP-ассоциированными цилиопатиями у человека широко распространено, но всё ещё пока мутации в 30 разных генах проявляют лишь небольшой набор хорошо определяемых клинических синдромов (Table 1 and Box 3). Это по большей части обусловлено локализацией цилиопатических генов в широко распространенных структурах, TZ первичной реснички. Это помещает TZ в центр цилиарной гипотезы; связывая ультраструктурные ансамбли с плейотропными дефектами тканей с ресничками. Как продукты этих генов взаимодействуют при сборке TZ и как действуют, чтобы специфицировать циллиарный компартмент. Существующая модель постулирует сборку иерархических продуктов генов NPHP/JBTS/MKS, действующих в качестве мультимерного белкового комплекса, чтобы сформировать TZ, которая в свою очередь будет предопределять сигнальный репертуар реснички.

Table 1. An overview of ciliopathy genes and their products Табл. см. в оригинале статьи

Box 3. Complex genetics of human ciliopathies NPHP syndromes are characterized by oligogenicity and significant phenotypic pleiotropy, and a lack of predictable genotype-phenotype correlations 50 and 51 (Table 1). For example, in MKS, the constellation of pathologic manifestations is complex and the penetrance of individual single-organ phenotypes is variable from patient to patient. Despite the characterization of many mutations, it is difficult to predict whether an affected individual carries homozygous mutations in MKS1, in TMEM67, or in another one of the 10 identified MKS genes, or in a yet unidentified gene. Moreover, certain single genes can produce the full spectrum of NPHP-related disorders, depending on the nature of the mutation. More than 100 unique human mutations were identified in the CEP290 ciliopathy gene (also referred to as NPHP6, JBTS5 or MKS4), giving rise to a range of phenotypes including isolated NPHP, LCA, characteristic SLSN, JBTS, BBS or the lethal MKS [52]. We also find that some genes are frequently associated with the less severe manifestations of the NPHP continuum, whereas others are found in the context of more severe ciliopathies. Ideally, systematic genetic screening would be a routine element in the clinico-pathologic diagnosis of ciliopathy cases, but complete sequencing data are often unavailable. As our understanding evolves, we may indeed find a linkage of specific genes to more or less severe disease phenotypes. Alternatively, we may find that most ciliopathy genes, like CEP290, produce the full pathologic spectrum of ciliopathy phenotypes.




Assembling the TZ from protein complexes


Как строятся и поддерживаются такие сложные структуры как TZ? Генетические исследования белков TZ с использованием мутаций, нокаута и RNAi нокдауна выявили зависимые паттерны TZ локализации и, в некоторых случаях, ультраструктурные корреляции со специфическими ансамблями TZ10-14. Эти исследования были расширены протеомным анализом сродства очищенных белковых комплексов, с использованием различных TZ белков как 'bait' 11,15,16 или путем непосредственного обогащения материала ресничек17-19. Системный анализ и корреляция данных по локализации, генетический анализ и паттерны протеомных взаимодействий выявили предварительную карту TZ белковой сети. Эта карта включает многие известные и немногие новые цилиопатические белки и выявляет организацию, по крайней мере, четырех взаимодействующих мультибелковых комплексов: NPHP1-4-8, MKS/B9, NPHP5-6 и Inversin compartment (Figure 2).

Figure 2. Organizational chart of transition zone (TZ) functional modules. Rpgrip1L/Nphp8 localizes independently and influences proper TZ localization of the NPHP1-4 and MKS/B9 complexes. The localization may be direct or through a cascade of consecutive localization and complex organization events. Within the MKS/B9 module, Mks1, Tmem216 and Tmem67, which are consistently associated with severe pathologies in humans, appear at the bottom of the localization hierarchy. Cep290 was considered the core of its own NPHP5-6 network in one study [15], but part of an MKS-like complex in another [11]. The inversin compartment is highly dynamic and spans a long stretch of ciliary axoneme from the basal body into the distal cilium proper. Through its localization and its interactions with members of all protein modules, it may serve as a bridge and contribute to multiple distinct signaling processes. Proteins within one module are highlighted by the same shape and color. Brighter color indicates more frequent association with severe disease. Higher position within one group and red arrows indicate intracomplex localization hierarchy. Black dotted arrows indicate physical interactions across modules. Note that not all depicted proteins are exclusively located in the TZ, but may also be found at the basal body (Rpgrip1L, B9D1, Cc2d2a, Tmem216, Cep290, Nphp5, inversin) or in the proximal doublet zone of the cilium proper (inversin, Nphp3, Nek8, Tmem67, Tctn-2, Tctn-3).

X-сцепленный retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein-1-like (Rpgrip1L)/Nphp8 белок организует как модуль 1-4-8, так и модуль MKS в TZ. Доказательства этого комплекса выявляются в двух типах работ. В культивируемых клетках, системном протеомном анализе, использующем tandem affinity purification followed by mass spectrometry-based protein identification (TAP/MS), продемонстрированы четкие реципрокные взаимодействия между Rpgrip1L, Nphp1 и Nphp4 [15]. Комплекс высоко консервативен как в эпителиальных (inner medullary collecting duct, IMCD) , так и мезенхимных (3T3) клетках, демонстрируя базовый стержневой консенсус комплекса у разных типов клеток. Второй тип доказательств получен при системном генетическом подходе у Caenorhabditis, где Rpgrip1L, как было установлено, является вершиной иерархической сборки, контролирующей локализацию Nphp1 и Nphp4 и весь комплекс MKS у нематод [14]. Мутации в NPHP1 или NPHP4 не оказывают эффекта на членов комплекса MKS. Интересно, что в случае одновременных мутаций (т.e. одной мутации из 1-4-8 и одной из MKS), зона TZ обнаруживает полную потерю Y-линкеров и и прикреплений к мембране, дефектный цилиогенез и аномальный трафик белков реснички. Множество ассоциаций Rpgrip1L и его роль в поддержании крупных доменов TZ может объяснить его участие в цилиопатиях во всех спектрах тяжести (Table 1) и, напротив, почему Nphp1 и Nphp4 могут быть ассоциированы с менее тяжелыми фенотипами.
В противоположность Rpgrip1L или Nphp1/4, почти все белки MKS/B9 модуля участвуют в MKS, в более тяжелом заболевании из всего спектра NPHP. Этот модуль, был установлен, с помощью протеомных методов во многих независимых исследованиях11,15,16. Все эти исследования использовали TAP/MS методы, но разные наживки (baits), подкрепляя доказательства для разных MKS модулей. Генетические доказательства на мышах и Caenorhabditis, вместе с interactomic анализом, выявили MKS модуль как мультибелковый комплекс, богатый нацеленными на мембрану доменами B9 и C2, а также некоторыми мембранными белками (Table 1). Как описано выше, любая комбинация мутаций MKS и NPHP1-4-8 вызывает значительные нарушения ультраструктуры TZ у нематод [14]. В отличие от мутаций у Caenorhabditis, скоррелированные ультраструктурные данные по архитектуре ресничек и TZ в случаях MKS у человека и у модельных мышей отсутствуют. Недавняя работа описывает идентификацию нового Joubert syndrome-related белка, Tmem237, который был локализован в TZ. Его делеция усиливает дефекты мембраны реснички на NPHP4-негативном фоне, как это описано для др. белков с модулем MKS. Хотя пока интерактомные данные ещё недоступны, но вполне возможно, что он будет идентифицирован как компонент комплекса MKS [20].
Сравнение компонентов комплекса MKS/B9 Caenorhabditis с interactomic данными по клеткам млекопитающих, показало, что очевидные гомологи белков семейства tectonic (Tctn) отсутствуют в геноме нематод. Др. отличие между белками MKS нематод и млекопитающих это их влияние на генез ресничек. В то время как имеются лишь незначительные дефекты изолированных MKS мутаций у Caenorhabditis, MKS белки оказывают более существенные эффекты на генез ресничек в клетках млекопитающих. Напр, RNAi-обусловленное снижение белка Mks1 в культуре клеток, как полагают, приводит к уменьшению цилиогенеза и дефектной миграции базального тельца [21]. Генетическая делеция MKS1 у мышей, моделирующих MKS, обнаруживает тканеспецифическую потерю ресничек с уменьшением образования ресничек в развивающейся нервной трубке, но в основном с нормальными ресничками в почечных канальцах [22]. Сходные тканеспецифические дефекты видны у модельных мышей с генетическими делециями белков с модулем MKS Tctn1, Tctn2 и Cc2d2a [11], но не были описаны у мышей с делециями TMEM231 и B9D1. Важным аспектом развития у червей является то, что все реснички располагаются в нейронах сенсорной системы и могут быть следствием общей программы развития ресничек [6]. У млекопитающих реснички из клеток эпителиальных в противоположность клеткам мезенхимного происхождения могут иметь разное морфологическое проявление и сигнальные роли, и нуждаются в разных цилиогенных белках. Такие тканеспецифические эффекты, скорее всего, отражают варьирующий состав или дифференциальную потребность в TZ белковых модулях для цилиогенеза и передачи сигналов.
'NPHP5-6' или Cep290 модуль первоначально был обнаружен в протеомных исследованиях в линиях клеток млекопитающих. Tandem affinity подход показал строгое взаимодействие Cep290 с MKS [11], тогда как другие постулировали самостоятельный модуль, группирующийся вокруг Cep290-Nphp5 кластера [15], подчеркивая ранее описанное функциональное взаимодействие [23]. У Chlamydomonas, с иммунозолотом ЭМ картирование Cep290 относительно Y-линкеров в TZ, и его мутации, приводящие к значительной, но не полной потере Y-линкеров [10], показывают. что Cep290 вносит вклад в образование Y-линкеров. Интересно, что очевидный ортолог CEP290 отсутствует в геноме Caenorhabditis, у которых присутствуют морфологически интактные Y-линкеры, подчеркивая роль др. белков (или функциональных гомологов у червейCep290) в формировании этих субструктур. Такой поразительный фенотип у Chlamydomonas и вовлечение CEP290 в весь спектр тяжелых цилиопатий у человека является удивительным, т.к. спонтанные in-frame делеционные мутации у мышей дают только дегенерацию сетчатки (rd16 мутация [24]). Более того, генетическая делеция обладает умеренным JBTS-подобным фенотипом (дегенерация сетчатки и дефекты формирования паттерна мозжечка) [25], но отсутствует кистоз почек или дефекты раннего развития, которые можно было ожидать. Вопрос, почему большинство рецессивных мутаций в CEP290 вызывают более тяжелые дефекты, чем генетические делеции, нуждается в детальном исследовании.
Особая роль приписывается Inversin, который взаимодействует и локализуется вместе с Nphp3 и Nek8, но не ограничен BB или TZ. Его широкое распространение может указывать на функцию образования мостиков между многочисленными модулями сети. В самом деле, взаимодействия были независимо установлены с Nphp1, Nphp5 и MKS модулями посредством JBTS белка Ahi1 [15]. Из всех доступных доказательств, кстати, Inversin компартмент выглядит динамическим, включая базальное тельце и вариабельные дистальные выпячивания вдоль ости реснички. Мутации в INV/NPHP2, NPHP3 или NEK8 не были скоррелированы с нарушениями самой структуры TZ как таковой [26].
Sang с коллегами оказались способны использовать белки в их комплексах, чтобы идентифицировать новые цилиопатические гены TCTN2 и ATXN-10, которые вызывают JBTS и NPHP, соотв. [15]. Возможность идентификации новых цилиопатических генов, разнообразные протеомные, биоинформационные [27] и next-generation sequencing [28] подходы, даже не у млекопитающих, скорее всего, существенно пополнят список TZ белков и их взаимодействий. Эти исследования подчеркивают необходимость систематических исследований. Ресничка является органеллой системной биологии. Подобно любой др. машине, которая имеет множество движущихся частей, она является ансамблем и скоординированными усилиями этих частей, которые собственно необходимы для её функционирования. Потеря одного из белков может приводить к драматическому фенотипу, но чтобы высказать гипотезу о механизме, мы д. знать, как такая потеря затрагивает др. компоненты.
За исключением Cep290, ни один из описанных TZ белков не был картирован на определенных TZ субструктурах. Следующей ступенью в характеристике NPHP и MKS белковых комплексов д. быть локализация индивидуальных белков на специфических составляющих элементах TZ. Это позволит добавить морфологическое измерение в карту TZ белков, которая пока базируется только на interactomic и генетических данных. Более того, детальные межбелковые взаимодействия, и ультраструктурный анализ необходимы не только понимания устройства дикого типа, но и также при генетических пертурбациях. Хотя иммунофлюоресценция и GFP мечение возможны практически во всех модельных цилиарных системах, световая микроскопия не дает разрешения, для определения архитектуры TZ. Имеющийся потенциал новых технологий, обещает супер-разрешение за границами обычных ~200 nm лимитов, чтобы просветить наше понимание TZ [29]. Однако даже при таких технологиях ультраструктурные методы с высоким разрешением визуализации TZ позволят помимо моделей Chlamydomonas и Caenorhabditis найти пути к системам позвоночных (e.g. [30]), чтобы наблюдать более замысловатые элементы TZ и их зависимость от TZ модулей.

Assembling signaling pathways through the TZ trafficking gate


Как белки проходят через сложный ансамбль структур в основании реснички и какова роль TZ? Уже давно было предположено, что селективный барьер в основании реснички распознает белки и мембранные пузырьки, которым намечено транслоцироваться в компартмент реснички, и запрещает доступ др. Присутствие переходных волокон, Y-линкеров и структур ожерелья составляет очевидную физическую границу и предположительно пропускной механизм. Более того, разнообразные цитоскелетные субструктуры, занимают большое пространство внутри и вокруг просвета реснички в её основании. В регионе переходных волокон пространство между двумя соседними слоями подсчитано не более 60 nm, это делает транспорт пузырьков в мембрану реснички маловероятным через осевой маршрут [31]. Эти размышления ещё больше осложняются находками, демонстрирующими, что разные домены мембраны реснички расширяются до приблизительно 1.8-µm-диаметра клеточной апикальной мембраны на участке вокруг основания реснички32,33. Этот регион вне реснички характеризуется специфическим составом из липидов и белков, который отличается от такового в окружающей апикальной мембране. Этот регион, как полагают, является местом стыковки для пузырьков с компонентами груза для ресничек, который затем перемещается латерально через TZ в ресничку32,33. Имеются также доказательства, что поступлению в ресничку могут препятствовать белки, закрепляющие их на окружающем цитоскелете [32]. Этот крупный регион может служить как место стыковки для предназначенного для реснички груза, но сам по себе он далек от TZ.
Структуры, расположенные проксимально к TZ , как полагают, выполняют локальную пропускную функцию. Барьерная функция была описана для сети septin (Sept2) в основании реснички, которая необходима для генеза реснички и обогащения белками этого компартмента [34]. Недавние доказательства подтвердили, что Sept2 осуществляет свою барьерную функцию посредством локализации членов белкового комплекса MKS/B9 Tmem231, B9d1 и Cc2d2a [16]. Этот барьер, по-видимому, пассивный, предупреждает смешивание между апикальной частью клетки и мембранами реснички, но не достаточно 'умел' , чтобы различать между грузами для ресничек и не для ресничек. Разрушение TZ Y-линкеров, как у мутантов Chlamydomonas CEP290 или у Caenorhabditis двойных мутантов модуля NPHP/MKS, приводит к несоответствующей локализации non-ciliary белков в ресничке10,14. У Chlamydomonas, анализировали профили жгутикового протеома дикого типа и CEP290 мутантов. Помимо относительной потери обильно встречающихся белков жгутиков, были идентифицированы некоторые белки, которые обычно не обнаруживаются в жгутике [10]. Сходным образом у мутантов Caenorhabditis GFP-нагруженные реснитчатые и non-ciliary белки были локализованы в ресничке [14]. Продукт гена с мембраной ассоциированного X-сцепленного retinitis pigmentosa RP2 отсутствовал в ресничках дикого типа, и у мутантных червей MKS1, TMEM67 и NPHP1, но присутствовал в ресничках of MKS1/TMEM67 двойных мутантов и у одиночных мутантов B9D1, B9D2, RPGRIP1L, CC2D2A и NPHP4. Трансмембранный белок TRAM-1a , обнаруживает почти идентичное поведение. Важно, что на этих генетических фонах, взаимодействия между аксонемой и мембраной и Y-линкеры оставались ультраструктурно интактными, указывая тем самым, что трудно уловимые молекулярные детерминанты селективности были потеряны. Хотя данные подтверждают модель сильного барьера для функции TZ, при этом белки ресничек получают доступ с помощью детерминант внутри TZ , а белки, не предназначенные ресничкам, исключаются. Когда TZ разрушен, белки ресничек или неспособны вступать или накапливаться, а белки не для ресничек проникают несоотв. образом. Альтернативно, было предположено, пропускная способность действует в обоих направлениях, исходя из наблюдений на живых клетках за трафиком в жгутиках у Chalmydomonas[35]. По существу несоотв. накопление в ресничках белков может указывать на путь активного удаления, который дефектен, когда разрушен TZ. Такой двунаправленный пропуск напоминает комплексы ядерных пор, чьи детерминанты трафика, путь Ran-Importin, участвует в некоторых аспектах трафика в ресничках [36].
Запрещающие сигналы могут удерживать белки вне компартмента реснички, но пропускной контроль в ресничку также зависит от распознавания разрешающего сигнала [31]. Рецептор somatostatin SSTR3 локализуется на ресничках на многих генетических фонах. Однако, трансмембранный энзим adenylylate cyclase III (ACIII) полностью отсутствует в ресничках TCTN1, TCTN2, CC2D2A или TMEM67 клеток нулевых murine embryonic fibroblast (MEF) [11]. Один из продуктов гена ADPKD, Pkd2, также отсутствует в ресничках TCTN1, TCTN2 или CC2D2A нулевых MEFs, но обнаруживает неизменную локализацию в ресничках TMEM67 нулевых клеток. Путь передачи сигналов Hh интимно связан с ресничками, как показывают некоторые исследования онтогенетических дефектов у мышей [37]. Активация передачи сигналов hedgehog участвует в транслокации в ресничку Smoothened, процесс, который, как было установлено, зависит от Tctn1, Tctn2 и Cc2d2a, но не зависит от Tmem67. Сходным образом, Arl13b, модифицируемый липидами и ассоциируемый с мембранами белок ресничек заметно снижается в ресничках TCTN1, TCTN2 или CC2D2A нулевых клеток, тогда как снижение в TMEM67 нулевых клетках было слабым. TCTN1/2 и CC2D2A нулевые мыши обнаруживают драматические дефекты развития со situs inversus, дефектами тканевого цилиогенеза и эмбриональной летальностью, тогда как TMEM67 нулевые мыши доживают вплоть до рождения, имеют кистозные почки во время эмбриогенеза и уменьшенные реснички в почечных канальцах. Итак, всё это указывает, что простого построения реснички недостаточно; важна экипировка их правильными компонентами. Важно понимание взаимоотношения между нарушением иерархии сборки TZ и изменениями в локализации белков ресничек, это может прояснить правило трафика в реснички. Более того, мы сможем идентифицировать те TZ белки, которые распознают специфические разрешающие сигналы на грузе, и природу этих сигналов.
В перспективе передачи сигналов полные пути д.быть собраны компонент за компонентом внутри реснички. Неспособность находить компоненты сигнального пути будет приводить к разрывы самого каскада. Напр., у CEP290 мутантных мышей (rd16), обонятельные рецепторы, типа G-protein-coupled receptor (GPCR), и соотв. adenylate cyclase isoform (ACIII) были соотв. локализованы в обонятельных ресничках; однако, гетеротримерный G белок (Golf), который действует между GPCR и ACIII, нет [38]. Как результат, эти пациенты и мыши с мутациями CEP290 имеют пониженное обоняние. Пути передачи сигналов в ресничках, такие как GPCRs (напр. somatostatin или melanocortin [39]), рецепторные тирозин киназы (напр. PDGF [40]) и кальциевые каналы [8] все они локализованы и трансдуцируются посредством первичной реснички. Каждый белок в каскаде д. поставляться в ресничку независимо или заранее подготовленные сигнальные центры д. транспортироваться en masse. Проверка того, как целые сигнальные пути транспортируются и собираются внутри первичной реснички, нуждается в подходах интегративной и системной биологии, описанных здесь. Понимание этих механизмов д. помочь вычленить механизмы, с помощью которых достигается клеточно-специфическая спецификация компартмента реснички посредством TZ-обеспечиваемой поставки белков ресничек. В конечном итоге мы д. быть способны оценить те типы клеточных дефектов, которые транслируются в различные тяжелые состояния цилиопатических фенотипов: частичная потеря сигнального пути вообще-то д. лежать в основе умеренного фенотипа, тогда как полная потеря спецификации реснички может быть результатом более драматической тканевой дисфункции, как это наблюдается у большинства тяжело затронутых пациентов.
Итак, сложные фенотипы, наблюдаемые при дисфункции TZ, подчеркивают концепцию сильной пропускной системы, которая помогает регулировать гомеостаз белков реснички. Белки, которые достигают TZ, по-видимому, благодаря набору сигналов, разрешающих транспортировку, безусловно их спрашивают об их 'документах' , чтобы позволить им вступать в компартмент реснички. Более того, те белки, которые неоднократно вызывают сомнения в компартменте реснички выводятся из реснички, если больше не нужны. Как такая пропускная система строится из уникальных ультраструктурных особенностей и белковых модулей рассмотрена здесь и д. стать центральной областью исследований в будущем. Кстати, как собирается сама TZ зона, необходимо понять, как TZ собирает сигнальные пути с помощью документации белков щетинки при нормальных и нарушенных условиях. Путем интеграции наших знаний о молекулярных комплексах, ультраструктурных ансамблях, клеточных функциях и организменных фенотипах, мы сможем начать выяснять, как эти малые органеллы осуществляют свой контроль в развитии и гомеостазе и как их нарушения продуцируют болезненные фенотипы у человека.
Сайт создан в системе uCoz