Генетический Контроль

Systematic Identification of Rhythmic Genes Reveals camk1gb as a New Element in the Circadian Clockwork Adi Tovin, Shahar Alon , Zohar Ben-Moshe, Philipp Mracek, Gad Vatine, Nicholas S. Foulkes, Jasmine Jacob-Hirsch, Gideon Rechavi, Reiko Toyama, Steven L. Coon, David C. Klein, Eli Eisenberg, Yoav Gothilf PLoS Genet 8(12): e1003116. doi:10.1371/journal.pgen.1003116
A wide variety of biochemical, physiological, and molecular processes are known to have daily rhythms driven by an endogenous circadian clock. While extensive research has greatly improved our understanding of the molecular mechanisms that constitute the circadian clock, the links between this clock and dependent processes have remained elusive. To address this gap in our knowledge, we have used RNA sequencing (RNA–seq) and DNA microarrays to systematically identify clock-controlled genes in the zebrafish pineal gland. In addition to a comprehensive view of the expression pattern of known clock components within this master clock tissue, this approach has revealed novel potential elements of the circadian timing system. We have implicated one rhythmically expressed gene, camk1gb, in connecting the clock with downstream physiology of the pineal gland. Remarkably, knockdown of camk1gb disrupts locomotor activity in the whole larva, even though it is predominantly expressed within the pineal gland. Therefore, it appears that camk1gb plays a role in linking the pineal master clock with the periphery. Рисунки к статье	Все организмы демонстрируют широкое разнообразие физиологических, биохимических и поведенческих ежедневных ритмов, которыми управляют внутренние осцилляторы, известные как циркадные часы. Эти осцилляторы работают в гармонии с 24 ч периодической изменчивостью средовых изменений. Поддержание и синхронизация циркадных осцилляторов обеспечивает адаптивные преимущества, на что указывает высокая эволюционная консервация суточных систем [1]. Современная догма относительно механизма циркадных осцилляторов базируется на позитивной и негативной петлях с обратной связью на транскрипцию-трансляцию с периодом времени ~24 ч. Согласно этой модели у позвоночных позитивный транскрипционный комплекс, CLOCK:BMAL гетеродимер, активирует транскрипцию компонентов негативных часов, гены period (per) и cryptochrome (cry), путем соединения с E-box элементами в их промоторах. Негативная обратная связь достигается с помощью PER:CRY гетеродимеров, которые вступают в ядро и супрессируют свою собственную транскрипцию путем физической ассоциации с CLOCK:BMAL гетеродимерами, закрывая таким образом петлю обратной связи. Трансдукция циркадной информации из этого основного осциллятора сопровождается ритмической активацией clock-контролируемых подчиненных (output) генов, которые, в свою очередь, регулируют нижестоящие процессы [2]. Некоторые output гены вносят вклад в аккуратность и стабильность осциллятора. Они кодируют регуляторы транскрипции, которые составляют дополнительные петли, которые связаны обратным образом с основными петлями или пост-трансляционными модификаторами основных clock белков. Эта система регулирует разнообразные биохимические пути, которые, как полагают, в конечном итоге ведут к к широкому разнообразию физиологических и поведенческих суточных ритмов [2]. В последние годы, некоторые факторы, которые воспринимают информацию от основных часов и контролируют (schedule) различные пути продукции, были выявлены [3]-[5]. Скорее всего, что эти факторы не объясняют всех основных процессов, регулируемых часами. Как и у др. позвоночных у рыбок данио шишковидная железа, как полагают, функционирует как ведущий орган циркадных часов; он является воспринимающим свет и является основным местом для самоподдерживающихся автономных часов, которые управляют суточным ритмом синтеза мелатонина, важного эндокринного элемента циркадной системы позвоночных [6], [7]. Помимо продукции этого гормона, нейроны шишковидной железы проецируются в мишени головного мозга [8]. Посредством этих нейрональных и гормональных сигналов шишковидная железа, как полагают, передает информацию относительно циркадного цикла физиологическим и поведенческим процессам [9]. Поэтому, эта ткань активно исследовалась в стремлении выяснить молекулярные компоненты основных часов [10]-[13]. Однако точные пути, которые связывают основной молекулярный осциллятор в шишковидной железе с ритмами физиологических и поведенческих процессов во всем организме остаются в основном неизвестны. Технология микромассивов ДНК является мощным инструментом, используемым для идентификации циркадных изменений в большом числе транскриптов (т.e., в циркадных генах) во всем царстве животных. Используя этот подход в разных тканях, включая и шишковидную железу, было продемонстрировано, что циркадные часы контролируют группы генов, сцепленные с большим количеством молекулярных и клеточных функций [14]-[17]. Неожиданно. разные исследования выявили лишь умеренный уровень перекрывания среди генов. идентифицированных как циркадные в одной и той же ткани разных видов, иногда даже в одном и том же виде [18], [19]. Эти расхождения могут быть объяснены действительными биологическими различиями или использованием разных экспериментальных процедур и методов анализа данных [18]. Однако эти расхождения могут быть частично приписаны врожденными ограничениям технологии микромассивов ДНК, напр., перекрестно-гибридизационных наборов зондов [20]. Улучшение профилирования циркадных генов теперь возможно с использованием следующего поколения технологий секвенирования для осуществления RNA-seq. Этот метод лучше он дает несмещенные измерения всего транскриптома, не ограничиваясь только субнабором генов, исследуемым в наборе зондов в чипе микромассивов [21]. Однако методы, чтобы минимизировать ошибки и отклонения, генерируемые RNA-seq, всё ещё разрабатываются [22]. Здесь мы систематически идентифицировали циркадные гены в шишковидной железе рыбок данио, применяя как микромассивы ДНК, так и RNA-seq; полученные находки в дальнейшем были подтверждены с использованием независимых количественных методов. Discussion В данном исследовании мы идентифицировали новые молекулярные элементы. которые затрагивают систему циркадного времени или непосредственно через основные часы или косвенно путем воздействия на время ретрансляции информации от основных часов нижестоящим процессам. Ранее было продемонстрировано, что циркадные гены посредством микромассивов ДНК могут приводить к открытию ранее не распознанных компонентов часов [42]. Мы полагали, что использование RNA-seq существенно улучшит количество обнаруживаемых циркадных генов. Однако новая техника внесла нетривиальные проблемы в анализом данных и также может вносить ошибки в количественные оценки генов [43]-[46]. Эти затруднения могут быть преодолены за счет интеграции нескольких экспериментальных процедур и использования строгого и точного анализа данных. В этом исследовании мы сфокусировались на шишковидной железе рыбок данио: 1) большинство молекулярных компонентов часов скорее всего функционально в этой автономной ткани часов. В сомом деле, экспрессия почти всех генов основных часов имела суточный ритм в этой ткани (Figure 2). 2) Сконцентрировавшись на генах шишковидной железы может быть выявлена связь между основными часами и периферическими тканями. В самом деле, мы продемонстрировали, что camk1gb, концентрация которого увеличена в шишковидной железе, контролирует циркадные нижестоящие процессы в шишковидной железе и во всем животном (напр., локомоторная активность). Связь между camk1gb и циркадной локомоторной активностью интригует, особенно из-за того, что locomotor activity is intriguing, camk1gb является геном, концентрирующимся в шишковидной железе. Хотя существует возможность, что camk1gb воздействует на циркадную локомоторную активность благодаря низкой экспрессии в структурах вне шишковидной железы, нельзя исключить, что усиленная и циркадная экспрессия этого гена в шишковидной железе (Figure 3) действует иным образом. По крайней мере, два возможных механизма могут объяснить, как camk1gb передает информацию о времени суточного ритма из шишковидной железы. Один с помощью регуляции секреции мелатонина: нокдаун camk1gb вызывает 50% снижение в ночное время экспрессии aanat2, ключевого энзима в продукции мелатонина [35]. Воздействие мелатонином вызывает выраженный эффект на ритмы локомоторной активности у многих организмов, включая рыбок данио [47], [48]. Следовательно, можно предполагать, что это нарушение уровней мелатонина ведет к наблюдаемым альтерациям в циркадной локомоторной активности. Однако роль ритмов эндогенного мелатонина для поддержания нормальной локомоторной активности у рыбок данио всё ещё недостаточно изучена и нуждается в дальнейшем изучении. Второй возможный механизм связан с модулированием нейрональной иннервации между шишковидной железой и глубокими регионами головного мозга [8]. Camk1g млекопитающих, как известно, координирует морфогенез нейронов. CaMKI изоформа является белком, закрепленным в мембране, многочисленным в нейронах, это обеспечивает рост аксонов и дендритов в культуре нейронов [49], [50]. У костистых рыб большинство клеток фоторецепторов шишковидной железы формируют контакты с постсинаптическими нейронами, которые посылают отростки в головной мозг. Фракция фоторецепторных клеток шишковидной железы обладает длинными аксонами, которые проецируются непосредственно в головной мозг [9]. Интересно, мы установили, что camk1gb, в сомом деле, экспрессируется в фоторецепторах (Figure S7 and Methods). Итак, эти наблюдения подчеркивают возможность того, что camk1gb необходим для трансмиссии циркадной временной информации от центральных часов в шишковидной железе в головной мозг. Мы предоставили доказательства, что camk1gb регулирует транскрипцию aanat2. Естественно, что понимание этого регуляторного механизма важно. Как и в случае для большинства членов семейства CaMKI, ранее было продемонстрировано in vitro, что транскрипционный фактор cAMP-response element-binding protein (CREB) является одной из мишеней фосфорилирования гомологом млекопитающих, Camk1g [30]. Сообщалось также, что Camk1g регулирует CREB-обеспечиваемую транскрипцию [51]. Интересно, что фосфорилированный CREB регулирует транскрипцию Aanat у млекопитающих [52], [53], и возможно у др. позвоночных [37]. Следовательно, возможно, что camk1gb модулирует уровни фосфорилированного CREB, это в свою очередь на уровни транскрипции aanat2. Мы отметили, однако, что пик экспрессии camk1gb приходится на средину дня, тогда как пик aanat2 на средину ночи (Figure 3 and Figure 5). Разумным объяснением может быть ожидаемый time lag между транскрипцией camk1gb и появлением продукта его трансляции. Альтернативный механизм может быть связан с косвенным эффектом, с помощью которого camk1gb регулирует основные часы шишковидной железы и тем самым контролирует транскрипцию aanat2. Однако мы не нашли доказательств, что нокдаун camk1gb воздействует на механизм основных часов (Figures S5 and S6). Несмотря на это, исходя из находок, что удаленные члены семейства CaMK могут модулировать гены основных часов [38]-[41], дальнейшее исследование этой возможности в тканях, др., чем шишковидная железа оправданы. Всестороннее рассмотрение циркадного транскриптома шишковидной железы позволило выявлению функций, которые связаны с часами внутри шишковидной железы. Как и ожидалось, гены, которые принадлежат к пути 'Circadian rhythms', существенно обогащены в циркадном транскриптоме шишковидной железы (Table S5 and Methods). Процессы 'Glycolysis' и 'Pyruvate metabolism' также существенно обогащены (Table S5), включая 4 циркадных энзима из 10, необходимых для гликолиза (Table S6a). Недавние исследования установили тесную связь между основными часами и метаболизмом, которая обеспечивается с помощью REV-ERB транскрипционных факторов [3], [4]. В частности, rev-erb связывает glycolysis/gluconeogenesis с основными часами в печени мыши [54]. Наши находки подтверждают, что связи между гликолизом и основными часами не ограничены печенью, но могут быть и в др. тканях. Др. интересная функция, которая была найдена, связана с увеличенной 'Oxidation reduction' (Table S5). 25 циркадных генов принадлежат этому пути, включая catalase и 7 разных cytochromes P-450 (Table S6b). Некоторые гены пути 'Oxidation reduction', как было установлено, являются регулируемыми часами [55]. В клетках рыбок данио catalase участвует в зависимой от света транскрипции генов часов [56]. Наши данные подтверждают, что связь между этим путем и системой часов может быть более общей и включает как центральную, так и периферические ткани часов. Мы сконструировали базу данных, которая содержит множество интересных кандидатов для будущих исследований в контексте или регуляции основных часов или в связи основных часов и нижестоящими путями. Мы сфокусировались на camk1gb и показали, что этот ген ритмически экспрессируется в шишковидной железе и влияет на суточные ритмы поведения. У млекопитающих открыты некоторые гены, которые соединяют основные часы с нижестоящей циркадной локомоторной активностью [57]. Все они обладают общими характеристиками 1. ритмическая экспрессия в основных часах (которые находятся в suprachiasmatic ядре у млекопитающих). 2. альтерации в их уровне нарушают циркадную локомоторную активность. Т.к. camk1gb обладает этими свойствами и регулирует aanat2, и тем самым возможно melatonin, поэтому мы предполагаем, что этот ген служит для соединения основных часов с циркадной локомоторной активностью у рыбок данио. Рыбки данио представляют собой идеальную модель позвоночных для идентификации и характеризации новых компонентов часов [10]. Однако за исключением нашей работы [58], не было идентифицировано новых компонентов часов с помощью этого метода. Вместо этого рыбки данио использовались для характеристики компонентов часов, которые ранее были идентифицированы у млекопитающих.

Все организмы демонстрируют широкое разнообразие физиологических, биохимических и поведенческих ежедневных ритмов, которыми управляют внутренние осцилляторы, известные как циркадные часы. Эти осцилляторы работают в гармонии с 24 ч периодической изменчивостью средовых изменений. Поддержание и синхронизация циркадных осцилляторов обеспечивает адаптивные преимущества, на что указывает высокая эволюционная консервация суточных систем [1].

Современная догма относительно механизма циркадных осцилляторов базируется на позитивной и негативной петлях с обратной связью на транскрипцию-трансляцию с периодом времени ~24 ч. Согласно этой модели у позвоночных позитивный транскрипционный комплекс, CLOCK:BMAL гетеродимер, активирует транскрипцию компонентов негативных часов, гены period (per) и cryptochrome (cry), путем соединения с E-box элементами в их промоторах. Негативная обратная связь достигается с помощью PER:CRY гетеродимеров, которые вступают в ядро и супрессируют свою собственную транскрипцию путем физической ассоциации с CLOCK:BMAL гетеродимерами, закрывая таким образом петлю обратной связи. Трансдукция циркадной информации из этого основного осциллятора сопровождается ритмической активацией clock-контролируемых подчиненных (output) генов, которые, в свою очередь, регулируют нижестоящие процессы [2]. Некоторые output гены вносят вклад в аккуратность и стабильность осциллятора. Они кодируют регуляторы транскрипции, которые составляют дополнительные петли, которые связаны обратным образом с основными петлями или пост-трансляционными модификаторами основных clock белков. Эта система регулирует разнообразные биохимические пути, которые, как полагают, в конечном итоге ведут к к широкому разнообразию физиологических и поведенческих суточных ритмов [2]. В последние годы, некоторые факторы, которые воспринимают информацию от основных часов и контролируют (schedule) различные пути продукции, были выявлены [3]-[5]. Скорее всего, что эти факторы не объясняют всех основных процессов, регулируемых часами.

Как и у др. позвоночных у рыбок данио шишковидная железа, как полагают, функционирует как ведущий орган циркадных часов; он является воспринимающим свет и является основным местом для самоподдерживающихся автономных часов, которые управляют суточным ритмом синтеза мелатонина, важного эндокринного элемента циркадной системы позвоночных [6], [7]. Помимо продукции этого гормона, нейроны шишковидной железы проецируются в мишени головного мозга [8]. Посредством этих нейрональных и гормональных сигналов шишковидная железа, как полагают, передает информацию относительно циркадного цикла физиологическим и поведенческим процессам [9]. Поэтому, эта ткань активно исследовалась в стремлении выяснить молекулярные компоненты основных часов [10]-[13]. Однако точные пути, которые связывают основной молекулярный осциллятор в шишковидной железе с ритмами физиологических и поведенческих процессов во всем организме остаются в основном неизвестны.

Технология микромассивов ДНК является мощным инструментом, используемым для идентификации циркадных изменений в большом числе транскриптов (т.e., в циркадных генах) во всем царстве животных. Используя этот подход в разных тканях, включая и шишковидную железу, было продемонстрировано, что циркадные часы контролируют группы генов, сцепленные с большим количеством молекулярных и клеточных функций [14]-[17]. Неожиданно. разные исследования выявили лишь умеренный уровень перекрывания среди генов. идентифицированных как циркадные в одной и той же ткани разных видов, иногда даже в одном и том же виде [18], [19]. Эти расхождения могут быть объяснены действительными биологическими различиями или использованием разных экспериментальных процедур и методов анализа данных [18]. Однако эти расхождения могут быть частично приписаны врожденными ограничениям технологии микромассивов ДНК, напр., перекрестно-гибридизационных наборов зондов [20]. Улучшение профилирования циркадных генов теперь возможно с использованием следующего поколения технологий секвенирования для осуществления RNA-seq. Этот метод лучше он дает несмещенные измерения всего транскриптома, не ограничиваясь только субнабором генов, исследуемым в наборе зондов в чипе микромассивов [21]. Однако методы, чтобы минимизировать ошибки и отклонения, генерируемые RNA-seq, всё ещё разрабатываются [22].

Здесь мы систематически идентифицировали циркадные гены в шишковидной железе рыбок данио, применяя как микромассивы ДНК, так и RNA-seq; полученные находки в дальнейшем были подтверждены с использованием независимых количественных методов.

Discussion

В данном исследовании мы идентифицировали новые молекулярные элементы. которые затрагивают систему циркадного времени или непосредственно через основные часы или косвенно путем воздействия на время ретрансляции информации от основных часов нижестоящим процессам. Ранее было продемонстрировано, что циркадные гены посредством микромассивов ДНК могут приводить к открытию ранее не распознанных компонентов часов [42]. Мы полагали, что использование RNA-seq существенно улучшит количество обнаруживаемых циркадных генов. Однако новая техника внесла нетривиальные проблемы в анализом данных и также может вносить ошибки в количественные оценки генов [43]-[46]. Эти затруднения могут быть преодолены за счет интеграции нескольких экспериментальных процедур и использования строгого и точного анализа данных.

В этом исследовании мы сфокусировались на шишковидной железе рыбок данио: 1) большинство молекулярных компонентов часов скорее всего функционально в этой автономной ткани часов. В сомом деле, экспрессия почти всех генов основных часов имела суточный ритм в этой ткани (Figure 2). 2) Сконцентрировавшись на генах шишковидной железы может быть выявлена связь между основными часами и периферическими тканями. В самом деле, мы продемонстрировали, что camk1gb, концентрация которого увеличена в шишковидной железе, контролирует циркадные нижестоящие процессы в шишковидной железе и во всем животном (напр., локомоторная активность).

Связь между camk1gb и циркадной локомоторной активностью интригует, особенно из-за того, что locomotor activity is intriguing, camk1gb является геном, концентрирующимся в шишковидной железе. Хотя существует возможность, что camk1gb воздействует на циркадную локомоторную активность благодаря низкой экспрессии в структурах вне шишковидной железы, нельзя исключить, что усиленная и циркадная экспрессия этого гена в шишковидной железе (Figure 3) действует иным образом. По крайней мере, два возможных механизма могут объяснить, как camk1gb передает информацию о времени суточного ритма из шишковидной железы. Один с помощью регуляции секреции мелатонина: нокдаун camk1gb вызывает 50% снижение в ночное время экспрессии aanat2, ключевого энзима в продукции мелатонина [35]. Воздействие мелатонином вызывает выраженный эффект на ритмы локомоторной активности у многих организмов, включая рыбок данио [47], [48]. Следовательно, можно предполагать, что это нарушение уровней мелатонина ведет к наблюдаемым альтерациям в циркадной локомоторной активности. Однако роль ритмов эндогенного мелатонина для поддержания нормальной локомоторной активности у рыбок данио всё ещё недостаточно изучена и нуждается в дальнейшем изучении. Второй возможный механизм связан с модулированием нейрональной иннервации между шишковидной железой и глубокими регионами головного мозга [8]. Camk1g млекопитающих, как известно, координирует морфогенез нейронов. CaMKI изоформа является белком, закрепленным в мембране, многочисленным в нейронах, это обеспечивает рост аксонов и дендритов в культуре нейронов [49], [50]. У костистых рыб большинство клеток фоторецепторов шишковидной железы формируют контакты с постсинаптическими нейронами, которые посылают отростки в головной мозг. Фракция фоторецепторных клеток шишковидной железы обладает длинными аксонами, которые проецируются непосредственно в головной мозг [9]. Интересно, мы установили, что camk1gb, в сомом деле, экспрессируется в фоторецепторах (Figure S7 and Methods). Итак, эти наблюдения подчеркивают возможность того, что camk1gb необходим для трансмиссии циркадной временной информации от центральных часов в шишковидной железе в головной мозг.

Мы предоставили доказательства, что camk1gb регулирует транскрипцию aanat2. Естественно, что понимание этого регуляторного механизма важно. Как и в случае для большинства членов семейства CaMKI, ранее было продемонстрировано in vitro, что транскрипционный фактор cAMP-response element-binding protein (CREB) является одной из мишеней фосфорилирования гомологом млекопитающих, Camk1g [30]. Сообщалось также, что Camk1g регулирует CREB-обеспечиваемую транскрипцию [51]. Интересно, что фосфорилированный CREB регулирует транскрипцию Aanat у млекопитающих [52], [53], и возможно у др. позвоночных [37]. Следовательно, возможно, что camk1gb модулирует уровни фосфорилированного CREB, это в свою очередь на уровни транскрипции aanat2. Мы отметили, однако, что пик экспрессии camk1gb приходится на средину дня, тогда как пик aanat2 на средину ночи (Figure 3 and Figure 5). Разумным объяснением может быть ожидаемый time lag между транскрипцией camk1gb и появлением продукта его трансляции. Альтернативный механизм может быть связан с косвенным эффектом, с помощью которого camk1gb регулирует основные часы шишковидной железы и тем самым контролирует транскрипцию aanat2. Однако мы не нашли доказательств, что нокдаун camk1gb воздействует на механизм основных часов (Figures S5 and S6). Несмотря на это, исходя из находок, что удаленные члены семейства CaMK могут модулировать гены основных часов [38]-[41], дальнейшее исследование этой возможности в тканях, др., чем шишковидная железа оправданы.

Всестороннее рассмотрение циркадного транскриптома шишковидной железы позволило выявлению функций, которые связаны с часами внутри шишковидной железы. Как и ожидалось, гены, которые принадлежат к пути 'Circadian rhythms', существенно обогащены в циркадном транскриптоме шишковидной железы (Table S5 and Methods). Процессы 'Glycolysis' и 'Pyruvate metabolism' также существенно обогащены (Table S5), включая 4 циркадных энзима из 10, необходимых для гликолиза (Table S6a). Недавние исследования установили тесную связь между основными часами и метаболизмом, которая обеспечивается с помощью REV-ERB транскрипционных факторов [3], [4]. В частности, rev-erb связывает glycolysis/gluconeogenesis с основными часами в печени мыши [54]. Наши находки подтверждают, что связи между гликолизом и основными часами не ограничены печенью, но могут быть и в др. тканях. Др. интересная функция, которая была найдена, связана с увеличенной 'Oxidation reduction' (Table S5). 25 циркадных генов принадлежат этому пути, включая catalase и 7 разных cytochromes P-450 (Table S6b). Некоторые гены пути 'Oxidation reduction', как было установлено, являются регулируемыми часами [55]. В клетках рыбок данио catalase участвует в зависимой от света транскрипции генов часов [56]. Наши данные подтверждают, что связь между этим путем и системой часов может быть более общей и включает как центральную, так и периферические ткани часов.

Мы сконструировали базу данных, которая содержит множество интересных кандидатов для будущих исследований в контексте или регуляции основных часов или в связи основных часов и нижестоящими путями. Мы сфокусировались на camk1gb и показали, что этот ген ритмически экспрессируется в шишковидной железе и влияет на суточные ритмы поведения. У млекопитающих открыты некоторые гены, которые соединяют основные часы с нижестоящей циркадной локомоторной активностью [57]. Все они обладают общими характеристиками 1. ритмическая экспрессия в основных часах (которые находятся в suprachiasmatic ядре у млекопитающих). 2. альтерации в их уровне нарушают циркадную локомоторную активность. Т.к. camk1gb обладает этими свойствами и регулирует aanat2, и тем самым возможно melatonin, поэтому мы предполагаем, что этот ген служит для соединения основных часов с циркадной локомоторной активностью у рыбок данио.

Рыбки данио представляют собой идеальную модель позвоночных для идентификации и характеризации новых компонентов часов [10]. Однако за исключением нашей работы [58], не было идентифицировано новых компонентов часов с помощью этого метода. Вместо этого рыбки данио использовались для характеристики компонентов часов, которые ранее были идентифицированы у млекопитающих.