Наша нервная система обнаруживает устрашающее разнообразие; она содержит 100 биллионов нейронов, которые обладают определенными функциями и соединениями. Внешний мир воспринимается периферическими нейронами, каждый из которых экспрессирует только один или стереотипированный набор рецепторов из огромного геномного репертуара [1]-[4]. Избирательная экспрессия рецепторов гарантирует специфическую функцию каждого сенсорного нейрона и продуцирует огромное разнообразие классов сенсорных нейронов.

В обонятельной системе мыши каждый olfactory sensory neuron (OSN) выбирает для экспрессии один odorant receptor (OR) из приблизительно 1200 генов OR [5]. Выбор OR у млекопитающих является частью стохастического процесса, ограничиваемого с помощью онтогенетического контекста, это проявляется паттернами ограниченной зональной экспрессии каждого OR [6]. Зональные паттерны могут быть воспроизведены экспрессией трансгенных OR промоторов [6],[7] и открывают возможность, что существуют транскрипционные факторы (TFs) которые в комбинации или в виде градиентов специфицируют экспрессию OR мышей. Два TFs, Lhx2 и Emx2, были идентифицированы в качестве генеральных регуляторов экспрессии OR [8]-[10], но качественные особенности TFs, которые регулируют специфические ORs мышей, неизвестны, поскольку большой размер репертуара OR делает системный анализ фенотипов TF громоздким и специфические дефекты трудны для обнаружения.

Как и у млекопитающих Drosophila ORs экспрессируются в виде паттерна сольи перец внутри доменов OSNs в антеннах (Figure S3) [11]. Экспрессия Drosophila OR создает 34 класса OSN со стереотипическим количеством и локализацией нейронов [12]-[14], указывая на строго предетерминированный процесс. Большое количество классов OSN и точная регуляция OR делает антенны Drosophila экстраординарной системой для изучения того, как ORs регулируются и как большое количество классов нейронов специфицируется. Кстати, только два TFs, Acj6 и Pdm3, как было установлено, специфицируют субнабор Drosophila ORs [15],[16].

Чтобы понять, как обонятельная система специфицирует уникальные качественные особенности OR большого числа сенсорных нейронов, мы предприняли первый систематический генетический скрининг (направленная RNAi) для детекции регуляторов экспрессии Drosophila OR. Тем самым мы идентифицировали набор лишь из 7 TFs, которые регулировали полностью коллекцию OR во взрослой обонятельной системе Drosophila. Был проведен систематический анализ, чтобы продемонстрировать, как эти TFs используют множественные стратегии, чтобы специфицировать качественные особенности класса OR.

Discussion

Мы идентифицировали 7 TFs, являющихся критическими регуляторами экспрессии обонятельных генов. Разные комбинации этих TFs необходимы для точного нейрон-специфичного начала экспрессии OR генов, а также для поддержания их в зрелых OSNs. Систематический анализ далее выявил, что идентифицированные TFs соединяются с разными мотивами ДНК, благодаря чему они могут действовать как активаторы, и как репрессоры экспрессии OR gene генов (Figure 7C).

The Seven Identified TFs Are OR Selector Genes

В 1975, Antonio Garcia-Bellido представил концепцию генов селекторов, TFs которых могут детерминировать определенную клеточную судьбу. Несколько уровней генов селекторов было найдено, которые контролируют генетические программы, которые индивидуально специфицируют тип органа, ткани и клеток [27]. Недавно исследования на Caenorhabditis elegans показали, что один фактор и его мотив могут быть достаточны для достижения экспрессии одного класса нейронов [28]-[30]. Эти наблюдения привели к формулировке гипотезы терминального селекторного гена [31], согласно которой только небольшой набор TFs постоянно необходим, чтобы экспрессировать гены, которые характерные для каждого класса нейронов, подобных ORs. Однако идентифицировано мало таких случаев.

Наш систематический анализ представил несколько наблюдений, которые подтвердили, что идентифицированные TFs является терминальными селекторными генами для экспрессии OR. Во-первых, постоянная экспрессия всех семи TFs необходима для экспрессии OR в зрелых OSNs (Figure 3C). Во-вторых, семь TFs экспрессируются в зрелых OSNs, в виде разных паттернов внутри антенны (Figure 2B). В-третьих, все 32 протестированных ORs нуждаются в разных комбинациях TFs для экспрессии (Figure 4A). Наконец, мотивы для TFs найдены расположенными выше ORs генов, которые они регулируют (Figure 5A), и мотивы, необходимые для функционирования OR промотора (Figure 5B). Соотв., кажется очевидным, что большое число паттернов экспрессии достигается за счет комбинаторного использования немногих TFs, которые действуют в качестве OR селекторных генов.

OR селекторные гены принадлежат к разным семействам белков (Figure 2A), это указывает на то, что эволюция предпочитает использовать TFs с очень отличающимися свойствами связывания ДНК скорее, чем расширять одно семейство, которое обладает базовым мотивом связывания ДНК, это д. обеспечить безопасность комбинаторного паттерна. С др. стороны, высокая специфичность мотива для каждого из факторов указывает на то, что потеря или избыток мотивов для одного из OR селекторов д. генерировать новый паттерн экспрессии OR и вообще новый OSN класс. Т.о., одиночный OSN класс экспрессии и высокая способность к развитию, два характерных признака эволюции обонятельной системы, могут быть частично обусловлены комбинаторной функцией OR селекторных генов.

Single OR Expression, a Large Regulatory Cost

Сколько OR селекторных генов необходимо для уникальной экспрессии одного OR в каждом OSN классе? Мы идентифицировали 7 OR селекторных гена, но учитывая ограничения RNAi, вполне возможно, что всего существует, по крайней мере, 10 критических TFs, чтобы специфицировать все OSN классы. Даже эти вероятно заниженные расчеты генерируют довольно высокое число TFs, принимая во внимание, что антенна Drosophila имеет 34 OSN классов, которые экспрессию ORs [13]. Теоретические количество TFs, необходимое для бинарного комбинаторного кода, чтобы сгенерировать 34 уникальных результата является равным 6 (2⁶ = 64). Семь TFs может по теории дать 2⁷ = 128 комбинаций, а десять TFs соответствует более, чем 1000 комбинаций, подтверждая наличие большого числа неиспользованных комбинаций. Этот излишек комбинаций может быть обусловлен врожденной случайностью эволюции и невозможностью создания случайно хорошо отлаженного кода. Др. возможность для такого большого количества является необходимость в высокой степени точности с незначительной или с отсутствием эктопической экспрессии OR, приспособленной собственно к функционированию обонятельной системы. Экстраполяция наших наблюдений на регуляторные потребности обонятельной системы млекопитающих указывает, что необходимо, по крайней мере, 200-300 TFs для обеспечения регуляторной системы, которая будет контролировать более 1000 ORs млекопитающих, устрашающее количество. Следовательно, разумно предположить, что механизм стохастической селекции OR, обнаруженный у позвоночных, был добавлен в ходе эволюции, чтобы приспособиться к сильному повышению регуляторной цены, возникающей из-за увеличения числа OR генов.

Combinatorial Activation and Repression Control OR Expression

Кстати, очень немногие TFs были обнаружены ограниченными небольшими популяциями нейронов в нейроэпителии или в развивающемся головном мозге в целом [32]. Эта ситуация подтверждает предположение, что комбинаторная регуляция с помощью TF определяет широкие паттерны экспрессии молекул, таких как нейротрансмиттеры, но недостаточна, чтобы генерировать огромное количество классов нейронов, напр., в обонятельной системе [33]. Сходным образом все семь селекторных генов в данном исследовании экспрессировались в антенне, но всё ещё были необходимы для экспрессии некоторых немногих ORs (Figures 2B and 4A). Как могут широко экспрессируемые TFs затем продуцировать ограниченные паттерны экспрессии? Мы сформулировали два объяснения. Во-первых, анализ наших промоторов показал, что специфичность классов OSN частично обусловлена репрессией. Большинство ORs имеет проксимальную регуляторную область по соседству с геном, которая достаточна для экспрессии в OSNs, но нуждается в репрессии из более дистальных регионов для пространственного ограничения каждого класса OSN (Figure 5D). В этой модели экспрессия TFs, которые продуцируют экспрессию OR, не должна быть особенно специфичной поскольку их нейтрализуют репрессивные факторы. Во-вторых, идентифицированные TFs могут как активировать, так и репрессировать экспрессию OR в зависимости от локализации сайта связывания или имеющихся в наличии кофакторов (Figures 6C, 6D, 7A, and 7B). Двойное использование TFs может увеличивать их регуляторную силу и вследствие этого снижать количество TFs, необходимых для экспрессии OR. Мы полагаем, что спецификация больших количеств классов нейронов в обонятельной системе и скорее во всей ЦНС, нуждается в двух уровнях комбинационного кодирования, один уровень терминальных селекторных генов, который продуцирует экспрессию и другой уровень репрессоров, которые ограничивают экспрессию каждого класса.

Combinatorial Activation and Repression by Seven Transcription Factors Specify Drosophila Odorant Receptor Expression Shadi Jafari, Liza Alkhori, Alexander Schleiffer, Anna Brochtrup, Thomas Hummel, Mattias Alenius PLoS Biol. (2012) 10(3): e1001280. doi:10.1371/journal.pbio.1001280

Combinatorial Activation and Repression by Seven Transcription Factors Specify Drosophila Odorant Receptor Expression
Shadi Jafari, Liza Alkhori, Alexander Schleiffer, Anna Brochtrup, Thomas Hummel, Mattias Alenius
PLoS Biol. (2012) 10(3): e1001280. doi:10.1371/journal.pbio.1001280