Immediate early response 2 (Ier2) был идентифицирован как индуцибельный фактором роста белок и были описаны сигналы, участвующие в его экспрессии (Charles et al., 1990; Latinkic and Lau, 1994), но функция Ier2 у эмбрионов мышей не была описана. Недавно мы выделили Ier2 у рыбок данио в качестве нижестоящей мишени для передачи сигналов FGF и описали его роль в формировании паттерна лево-правосторонней асимметрии у этого животного (Hong and Dawid, 2009). Помимо влияния на лево-правостороннюю асимметрию, нокдаун Ier2 рыбок данио также вызывает дефекты движений конвергентного удлинения со ст. поздней гаструлы и в ходе ранних стадий сегментации. Движения конвергентного удлинения являются критическими как у Xenopus, так и рыбок данио для элонгации involuting ткани и становления передне-задней оси тела эмбриона (Keller et al., 2000; Wallingford et al., 2002; Heisenberg et al., 2000; Sepich et al., 2000). Чтобы проверить, является ли функция Ier2 законсервированной у разных видов позвоночных, мы исследовали роль этого белка во время гаструляции и постгаструляционого развития тетрапод. Описывается выделение двух Xenopus ier2 генов и их экспрессия во время развития. Используя антисмысловые morpholino (MO) для ослабления экспрессии Ier2, мы исследовали роль Ier2 белка у эмбрионов и в животных эксплантах. Наши наблюдения показали, что XIer2 играет критическую роль в движениях конвергентного удлинения у этого животного.

Expression of xier2 during development

Чтобы исследовать экспрессию xier2, мы использовали полуколичественный RT-PCR анализ и in situ гибридизацию в целом, используя xier2a и xier2b. Транскрипты Xier2 обоих генов определялись в материнской РНК и во время эмбриогенеза на стадии головастика (Fig. 2A). Пространственная экспрессия xier2b делали видимой, используя гибридизацию in situ тотального препарата во время развития Xenopus. Транскрипты обнаруживались перед гаструляцией в анимальном регионе (Fig 2 B,C), и в маргинальном регионе во время гаструляции (Fig. 2 D,E). На ст. 13 xier2b транскрипты обнаруживались в заднем мозге и параксиальной мезодерме (Fig. 2F). Эти домены экспрессии сохранялись и во время более поздних стадий и кроме того в бранхиальных дугах, сомитах и хорде во время ст. головастика (Fig. 2 G-I). Смысловая нить в контроле не обнаруживала окрашивания на всех изученных стадиях (Fig. 2 J-L). Паттерн экспрессии xier2a сходен с таковым для xier2b Fig. 2 (data not shown).

Более того, в маргинальной области, зачатках хорды и бранхиальных дуг экспрессия xier2b была сходна с паттерном, наблюдаемым для ier2 рыбок данио (Hong and Dawid, 2009), у которых обнаруживается зависимость от дозы (Fig. 3 B,E,F,H). Устранение нокдаун фенотипа в целом эмбрионе оказалось недостижимым, возможно из-за того, что MO и мРНК генерируют фенотип и достижение настоящего баланса оказывается непрактичным. Однако, специфичность MO указывает на то, что восстановление может быть достигнуто в эксплантах животных.

Для дальнейшего изучения эффекта этого MO мы использовали анимальные шапочки, которые заставляли удлиняться путем воздействия activin; индуцированные анимальные шапочки подвергались клеточным движениям, которые соответствовали модельным системам для конвергентного удлинения эмбрионов (Tada and Smith, 2000; Wallingford et al., 2000). Необработанные анимальные шапочки были неспособны удлиняться (Fig. 4A), тогда как обработанные активином экспланты удлинялись (Fig. 4B). Эта элонгация строго подавлялась нокдауном Xier2b (Fig. 4C) и что важно, восстанавливалась в значительной степени при совместной инъекции 100pg мРНК xier2b (Fig. 4D). Соотв. фенотипы были пенетрантны на 100% при этих воздействиях (Fig. 4). Эти данные подтверждают мнение, что функция ier2 необходима для конвергентного удлинения в гаструле эмбрионов Xenopus.

Фенотипы, наблюдаемые после нокдауна Xier2 не связаны с ингибированием образования мезодермы. Некоторые маркеры дифференцировки мезодермы, включая xbra, bmp4 и fzb, а также маркер организатора gsc и нейральный маркер sox2 оставались неизменными в анимальных шапочках после инъекции Xier2 MO (Supplementary Fig. S1A). Сходным образом маркер параксиальной мезодермы myoD экспрессируется у MO , а также у эмбрионов, которым инъецировали РНК, хотя и в искаженной форме (Supplementary Fig. S1 B-D). Эти наблюдения подтверждают мнение, что Xier2 играет роль в движениях конвергенции и удлинения эмбриона.

Discussion

В данном исследовании описывается выделение у Xenopus laevis ier2 кДНК и сравнение аминокислотных последовательностей белков ier2 Fig. 3 (Left).

Fig. 4 (Right). Convergent extension defects in animal caps caused by knockdown of Xier2. Control animal caps round up (A), but elongate after addition of activin (B). Elongation is inhibited by ier2 knockdown (C), and is rescued by co-injection of xier2 mRNA (D). The number of animal caps showing the phenotype portrayed and the number of caps tested is listed in each panel.

Данные, базирующиеся на двух независимых экспериментах подтвердили сходство функций для ier2 во время эмбрионального развития Xenopus и рыбок данио.

Convergent extension defects result from knockdown and overexpression of Xier2

Чтобы исследовать функцию Xier2 в развитии Xenopus были получены антисмысловые Xier2 MOs, чтобы истощить эндогенный Xier2 путем воздействия на место старта трансляции. Мы инъецировали Xier2 MO в эмбрионы на стадии 4-х клеток два дорсальных бластомера и анализировали фенотипы. Инъекция Xier2b MO 40 ng на эмбрион приводила к тяжелому фенотипу, указывающему на ингибирование движений конвергентного удлинения, приводящему к укорочению оси и часто к открытой нервной трубке, тогда как инъекции 60ng контрольного MO не оказывали эффекта на развитие (Fig. 3 A,D,H). Сходные уровни MO Xier2a оказывали более слабый эффект на развитие, поэтому мы ограничились Xier2b MO.

Избыточная экспрессия ier2 с помощью инъекции синтетической мРНК также приводила к фенотипам, которые были менеее тяжелыми, чем после инъекции MO у некоторых позвоночных. Как наблюдалось ранее ier2 белки позвоночных имеют высоко законсервированную N-терминальную последовательность, тогда как оставшийся регион обнаруживает значительную вариабельность последовательностей (Hong and Dawid, 2009), и это заключение также верно для гомологов у X. laevis и X. tropicalis (Fig. 1). Паттерн экспрессии гена ier2 у Xenopus снова обнаруживает значительное сходство с паттерном, ранее обнаруженным у рыбок данио (Hong and Dawid, 2009). У рыбок данио зиготическая экспрессия ier2 ограничена маргинальным регионом и развивающейся хордой во время гаструляции. На более поздних стадиях паттерн экспрессии более динамичен, включает головной мозг, части бранхиальных дуг и кровеносные сосуды. Многие из доменов экспрессии Xenopus ier2 были теми же самыми, что и у рыбок данио, за исключением материнской экспрессии, наблюдаемой у Xenopus ier2, но не у рыбок данио.

Сходная экспрессия в маргинальной зоне у обоих видов во время гаструляции интересна, поскольку дефекты движений конвергентного удлинения, которые возникают у эмбрионов рыбок данио (Hong and Dawid, 2009) и Xenopus вследствие нокдауна ier2. Конвергентное удлинение преимущественно затрагивает маргинальный регион и развивающуюся хорду, а экспланты дорсальной маргинальной части спонтанно подвергаются движениям конвергентного удлинения. Эти движения ведут к становлению передне-задней оси у эмбрионов.

Как же ier2 выполняет свою роль в конвергентном удлинении? Ранее мы показали на рыбках данио, что ier2 геном мишень для передачи сигналов Fgf и является критическим в передаче сигналов Fgf во время формирования Kupffer's пузырьков и в конечном итоге в закладке лево-правостронней асимметрии (Hong and Dawid, 2009). Возможно, что ier2 является наиболее общим нижестоящим эффектором пути FGF, оказывающим влияние и помимо лево-правосторонней асимметрии. Такая гипотеза может легко объяснить потребность в ier2 для конвергентного удлинения, поскольку передача сигналов Fgf, как известно, является важным регулятором этого процесса. Роль Fgf в этом контексте, по-видимому, обеспечивается разными молекулами, которые, по-видимому, не составляют прямолинейный путь. Brachyury, хорошо известный ген мишень для Fgf, необходим для гаструляционных движений помимо различных ролей в дифференцировке мезодермы и детерминации хвостовых тканей (Conlon and Smith, 1999). Однако мы установили, что нокдаун ier2 не ингибирует экспрессии xbra в обработанных активином анимальных шапочках (Supplementary Fig. S1). Некоторые из эффектов Fgf в конвергентном удлинении регулируются ингибитором Sprouty2, который, по-видимому, влияет на движения по другому, чем на дифференцировку мезодермы и генную экспрессию (Nutt et al., 2001). Наиболее удивительным является наблюдение, что Xnr3, родственный по своей последовательности с семейством Tgf-β, воздействует на конвергентное удлинение посредством Fgf receptor 1 (Yokota et al., 2003), и, наконец, дополнительная мишень для Fgf, участвующая в гаструляционных движениях, обнаружена недавно (Chung et al., 2005). Мы полагаем, что ier2 является новым примером этого растущего набора генов мишеней для Fgf, которые помимо своих функций выполняют роль по контролю конвергентного удлинения, ключевого процесса в становлении плана тела позвоночных во время гаструляции.

XIer2 is required for convergent extension movements during Xenopus development SUNG-KOOK HONG, KOSUKE TANEGASHIMA and IGOR B. DAWID Int. J. Dev. Biol. 55: 917-921, 2011 doi: 10.1387/ijdb.113288sh

XIer2 is required for convergent extension movements during Xenopus development
SUNG-KOOK HONG, KOSUKE TANEGASHIMA and IGOR B. DAWID
Int. J. Dev. Biol. 55: 917-921, 2011 doi: 10.1387/ijdb.113288sh