Используя массивы генных чипов, rtPCR и клеточные культуры, в этом исследовании были идентифицированы и подтверждены ряд генов, которые экспрессируются в виде градиентов в развивающемся неокортексе человека между 8 и 12 PCW (CS23-F4), важном времени кортикогенеза. Это соответствует периоду развития, когда формируется кортикальная пластинка [ст. 7.5 PCW (CS21), Meyer et al. 2000] и ранним ст. нейрогенеза (ten Donkelaar, 2000; Bystron et al. 2008) и регионализации, и происходит до врастания таламокортикальных волокон, которые могут оказывать внешние влияния на дифференцирующихся предшественников (Kostovic & Rakic, 1990).

Гены, которые контролируют становление ранней кортикальной карты у грызунов, как полагают, экспрессируются в виде градиентов в течение всего периода нейрогенеза в развивающемся неокортексе (Cecchi & Boncinelli, 2000). Поэтому мы предположили, что оценив ткани, происходящие из головного мозга, в возрастном промежутке 8-12 PCW (CS23-F4), мы сможем открыть сильные соотв. градиенты. Когда была осуществлена иерархическая кластеризация с помощью древовидного анализа, включающего все гены, то стоит отметить, что выборки собирались в кластеры в соответствии с их возрастом. Это было также подтверждено с помощью анализа принципиальных компонент, т.к. возраст, по-видимому, является основным компонентом изменчивости. Выборки, происходящие из передней и задней частей неокортекса в каждой возрастной границе давали кластеры, ближайшие др. к др., так, выборки между 9 and 12.5 PCW (F1-F4) давали группы, собранные в тесные кластеры, тогда как выборки на ст. 8 PCW (CS23) оказались менее связанными. Эти находки указывают, что на ст. 8 PCW (CS23) и возможно перед этим, могут появляться разные онтогенетические механизмы, давая в результате отличающиеся профили генной экспрессии. Это наблюдение подтверждается предыдущими исследованиями на человеке и демонстрирует, что онтогенетическое переключение может происходить между 8 и 9 PCW (CS23 and F1) приводя к изменению регуляции градиента PAX6 (high-anterior/lateral, low-posterior/medial), который сохраняется у грызунов в ходе всего кортикогенеза (Manuel & Price, 2005; Bayatti et al. 2008b). Недавние доказательства показали, что Pax6 градиент у грызунов не участвует непосредственно в процессе регионализации (Manuel et al. 2007; Pinon et al. 2008), поскольку мутантные мыши с избыточной экспрессией Pax6 не меняют экспрессии Emx2 или др. региональных маркеров. Избыточная экспрессия Emx2, однако, вызывает сдвиг в позиции и увеличение размера, прежде всего, областей, расположенных сзади по сравнению с передними структурами (Hamasaki et al. 2004). Следовательно, имеется чёткое крупное регионализационное влияние на развивающийся неокортекс, которое возникает кзади от генов, таких как EMX2 и COUPTFI. Их экспрессия репрессируется растворимыми факторами, такими как FGFs-8, -15 и -17, высвобождаемыми сигнальными центрами, расположенными спереди (O'Leary & Nakagawa, 2002; O'Leary et al. 2007; Rakic et al. 2009). Следовательно, д. быть обратно направленные градиенты, пока не открытых генов регионализации, которые предстоит идентифицировать. Существуют многочисленные известные гены, экспрессирующиеся в виде противоположных градиентов (Rakic et al. 2009); однако необходимо делать отличие в зависимости от то, влияют ли эти гены на регионализацию per se или возникают, будучи регулируемыми генами, которые будут индуцировать регион-специфический или локальный паттерн экспрессии. Классически такие гены регионализации экспрессируются в пролиферативной зоне, тогда как региональные гены экспрессируются ниже в специфических слоях развивающейся кортикальной пластинки (O'Leary et al. 2007).

Функциональный онтогенетический анализ выявил профили экспрессии, согласующиеся с добавлением процессов нейрального развития, происходящими в тканях, возникающими как впереди, так и сзади (Tables 4 и 5, соотв.). Однако гены, участвующие в категориях передачи сигналов внутри клеток, в адгезии, пролиферации и клеточной гибели, обнаруживали усиление активности в клетках, происходящих из передних, по сравнению с задними частями, подтверждая, что более значительные взаимодействия между клетками имеют место скорее впереди, чем сзади. Напротив, происходящие из задних частей, выборки обладают высокими уровнями экспрессии генов, участвующих в транспорте ионов, включая ионотрофные нейротрансмиттеры и транспортеры. Gene Ontology (GO) деление на категории пригодно для получения глобальной функциональной информации, но иногда оно непригодно для идентификации специфических групп генов, которые могут быть взаимосвязаны или на основе специфичности или на базе не известной или пока не определенной функции генов (напр., GO категория регионализации коры головного мозга GO:0021796 содержит EMX1 и EMX2, но не COUPTFI). Следовательно, при поиске вручную в списках генов мы оказались способны идентифицировать ряд впереди регулируемых генов, которые потенциально участвуют в регионализации на переднем полюсе развивающегося неокортекса. Сюда входят молекулы клеточной адгезии (такие как кадгерины и протокадгерины) и транскрипционные факторы, которые маркируют моторный кортекс или кортикоспинальные нейроны, или в месте возникновения кортикальных моторных нейронов в слое V или экспрессируются в их вырастающих волокнах (Molnar & Cheung, 2006).

Субнабор этих генов был выбран для подтверждения с помощью rtPCR в иссеченной ткани. Среди идентифицированных передних маркеров, CNTNAP2 является фронтальным маркером (Abrahams et al. 2007), PCDH17 является региональным маркером, соответствующим моторному кортексу у грызунов (Kim et al. 2007) и S100A10 является маркером слоя V для нейронов кортикоспинального тракта (Arlotta et al. 2005); все они обнаруживают сильные и соотв. высокие уровни в передних тканях. EMX2, COUPTFI (Simeone et al. 1992; Zhou et al. 1999) и FGFR3 (O'Leary & Nakagawa, 2002) являются генами регионализации и обнаруживают более высокие уровни экспрессии в тканях, происходящих из задних частей. Дополнительные члены семейства FGFR, которые экспрессируются на высоком уровне в головном мозге (Ford-Perriss et al. 2001) обнаруживают небольшие, но достоверные градиенты экспрессии. FGFR1 обладает более высокой экспрессией спереди, тогда как FGFR2 более высокой экспрессией сзади. Экспрессия PAX6 обнаруживает недостоверные отличия между передними и задними тканями. Однако нейрональный маркер MAP2 обнаруживает небольшое. но достоверное увеличение в передней ткани.

Чтобы определить, зависит ли регуляция этих генов, наблюдаемых в головном мозге, от их физиологического окружения, или ли такой информацией они наделены от природы, мы получали культуры диссоциированных нейронов из ткани неокортекса, иссеченной из переднего и заднего полюсов неокортекса на ст. 11 PCW (F3). Гипотеза прототипической карты утверждает, что предшественники обладают региональной прирожденной информацией к тому времени, когда они подвергаются своим финальным асимметричным делениям в вентрикулярной зоне и их потомство сохраняет эту информацию, так что ко времени. когда они начинают мигрировать в кортикальную пластинку, они могут фенотипически выглядеть так, как все остальные кортикальные нейроны, но генетически будут отличаться от своих соседей (Rakic, 1991). Используемые модели клеточных культур демонстрируют поддержание клеток в среде, вызывающей дифференцировку, что приводит к тому, что огромное большинство клеток реагирует положительно на нейрональный маркер, MAP2. Выявление GFAP- и Nestin-позитивных клеток подтверждает, что радиальная глия и астроциты и др. предшественники также присутствуют. Подсчет клеток с этими маркерами не выявил достоверных отличий между передними и задними культурами, показывая отсутствие различий процессах дифференцировки, происходящих в клетках после 3 DIV. Клетки были также окрашены антителами для PAX6 и EMX2, и в то время как PAX6-позитивные клетки не обнаруживали достоверных различий между культурами, происходящими из передних и задних частей, EMX2-позитивные клетки были достоверно более многочисленными в культурах клеток, происходящих из задних частей. Это подтвердило наши предыдущие доказательства, что PAX6 градиент не выявляется в развивающемся неокортексе в этот момент времени (Bayatti et al. 2008b). Более того, EMX2, который был описан как экспрессирующийся в пролиферативной зоне во время развития грызунов (Cecchi & Boncinelli, 2000), наблюдался экспрессирующимся в большинстве клеток в культуре из задней части, показывая, что белок д. быть экспрессирован в постмитотических нейронах, снова подтверждая недавние доказательства, показавшие, что EMX2 экспрессируется внутри кортикальной пластинки во время развития (Bayatti et al. 2008b). Это наблюдение ставит интересный вопрос, осуществляет ли EMX2 региональное влияние в кортикальной пластинке помимо участия в функции регионализации в пролиферативной зоне человека. Относительные уровни EMX2 в культуре после 3 DIV (posterior vs. anterior) отражают относительные уровни EMX2 , измеряемые в ткани (posterior vs. anterior) и это может указывать на степень прирожденной информации, содержащейся внутри экспрессирующих клеток. Real-time PCR подтверждает, что уровни экспрессии EMX2 и др. членов субнабора генов, тестированных в культуре, и обнаруживающих сходные posterior/anterior различия, выявляемые с помощью Affymetrix chip анализа и rtPCR использующего тканевые РНК. RNAs. Сильные и стойкие anterior-> posterior уровни CNTNAP2, PCDH17 и S100A10 были обнаружены, тогда как уровни EMX2, COUPTFI и FGFR3 были posterior -> anterior.

Мы поэтому идентифицировали раннее переднее пространственное образование кластеров из ряда маркеров, используя Affymetrix chip анализ всего генома. Сюда вошли потенциальные маркеры моторного кортекса/кортикальных двигательных нейронов/кортикоспинального тракта. Поскольку это происходит относительно рано в кортикальном развитии, то это подразумевает, что клетки могут иметь эту информацию, переданную им на ранней стадии, возможно как кортикальным предшественникам. Это доказательство также подтверждает, что передний неокортекс на этой стдии может быть местом происхождения нейронов позднее развивающегося моторного кортекса и кортикоспинального тракта таким же способом как переднее расположение моторного кортекса у грызунов (O'Leary & Nakagawa, 2002). В дополнение к этим передним маркерам, мы подтвердили ряд известных генов регионализации, образующих кластеры сзади. Сюда входит FGFR3, ген, как полагают, участвующий в регионализации, но описанный как участвующий в регуляции размеров головного мозга (Inglis-Broadgate et al. 2005). Это наблюдение интересно, поскольку это указывает, что предшественники или дифференцирующиеся нейроны, расположенные спереди обладают отличающимся балансом экспрессии FGFRs (высокий FGFR1, низкий FGFR3) по сравнению с расположенным сзади (высокий FGFR2/3), это д. приводить к дифференциальной сигнальной активности (Fortin et al. 2005). Т.о., FGF-8, сигнальная молекула, высвобождаемая передним сигнальным центром и с высоким сродством лиганда к FGFR3, может в принципе активировать впереди по сравнению с локализованными сзади предшественниками. Дальнейшие исследования д. идентифицировать предполагаемые различия в передаче клеточных сигналов между этими популяциями клеток, а также в нижестоящих эффектах, т.е. пролиферации и дифференцировке.

Различия в экспрессии между генами человека и грызунов отражаются на модельных клеточных культурах, представленных здесь. Примеры включают детекцию экспрессии EMX2 в дифференцированных нейрональных клетках и отсутствие наблюдаемого градиента PAX6. Эти находки подчеркивают пригодность культуральной системы в качестве модели регионализации у человека. Если скомбинировать с др. in vitro подходами, напр., очисткой специфических субпопуляций развивающихся кортикальных клеток (напр., радиальной глии) в культуре (Mo et al. 2007; Mo & Zecevic, 2008), то уровни экспрессии генов в предшественниках (регионализация) и генов нейрональных клеток (areal) могут быть сравнены во время ранних стадий кортикогенеза.