Краниальные плакоды являются временными утолщениями эмбриональной головной эктодермы в специфических позициях, которые могут быть выявлены во время развития позвоночных. Краниальные плакоды, обнаруживаемые у кур, являются гипофизарными, обонятельными, хрусталиковыми, тройничными, отическими и эпибранхиальными (Fig. 1). Все эти плакоды, за исключением гипофизарных, вносят вклад в сенсорные компоненты ПНС и обычно обозначаются как сенсорные плакоды. Гипофизарная плакода в конечном счете формирует эндокринную часть гипофиза. Среди сенсорных плакод хрусталиковые являются единственными плакодами, которые не дают каких-либо нейрональных производных. Индивидуальные плакоды дают специфические типы клеток и все вместе плакоды формируют разные типы клеток, включая сенсорные рецепторные клетки, нейроны, эндокринные клетки и поддерживающие клетки.

Figure 1. Location of cranial placodes. Schematic figure of a stage 9/10 stage embryo depicting the locations of the cranial placodes; the hypophyseal, olfactory, lens, trigeminal, otic and epibrancial.

Краниальные плакоды происходят из края нервной пластинки (border), региона эмбриональной эктодермы, расположенного между проспективным нейральным и проспективным эпидермальным доменами. Недавние исследования показали, когда и как внеклеточные сигналы приводят к спецификации краевых клеток и индивидуальной спецификации различных плакод. Хотя спецификация предшественников плакод, по-видимому, частично регулируется общими молекулярными механизмами, развитие и формирование паттерна индивидуальных краниальных плакод контролируется уникальными молекулярными кодами. Ключевым вопросом во время развития любой ткани или органа является, как клетки воспринимают одну судьбу из многих других. Столь же важно понять, как происходят морфологические движения, формирующие ткани и органы специфической формы. Развитие плакод, включающее как эти онтогенетические процессы, так и эти события, д. быть строго скоординированным, чтобы сформировать функциональные зрелые структуры. Чтобы анализировать приобретение клетками качественных характеристик и морфогенетических движений, были использованы различные молекулярные и биологии развития техники у эмбрионов кур (Box 1).

Box 1. Valuable techniques in chick

Expression analysis: Northern and Western blot analyses detect RNA and protein in cell lysates or tissue extracts. In situ hybridization and immunohistochemistry detect RNA and protein expression, and will give information about in vivo expression patterns if used on whole or sectioned embryos. These are basic techniques, but crucial for being able to interpret functional experiments.

Morphological analysis: Cell shape changes and tissue movements are important for the formation of anatomical structures. Parameters that are analyzed are; cell size, cell shape, cellular translocations and detection of markers related to the cytoskeleton network.

Fate map: This technique consists of marking cells or group of cells (grafts), often with fluorescent dyes, to detect them during the subsequent development, thereby being able to determine the fates and locations of their progeny. The classic chick/quail transplant model introduced by Le Douarin (1969), takes advantage of a specific condensed heterochromatin complex associated with the nuclei of all quail cells, but not present in chick cells, which makes it possible to distinguish between chick and quail cells. This is a useful technique to determine cell lineage and topological relationships.

Cell cultures: Dissociated cells from various tissues cultured in vitro can be used to analyze a broad range of molecular, physiological and chemical questions.

Explant/tissue culture: Dissected small pieces of tissue (explants) or larger tissue are cultured in vitro alone or in the presence of activators or inhibitors. This method is used for determining cell specification and commitment. Specified cells have acquired sufficient positional information to maintain their fate if removed from the embryo and cultured in vitro in the absence of exogenous factors. Committed cells maintain their fate even in the presence of inhibitors or activators. Tissue, but not explant cultures might be used to analyze morphological changes. A recent study described the combination of using slice cultures and time-lapse imaging to monitor in detail sensory placode formation and morphogenesis (Shiau et al. 2011).

In ovo electroporation: In vivo technique that is described in detail by Dr Nakamura in this review (Nakamura & Funahashi 2012). Briefly, DNA or RNA is transferred in chick cells by the use of low voltage to either activate or inhibit gene expression. Thus, the region and time of transfection are highly controllable. This method is very useful when studying morphological changes.

Specification of the neural plate border

Краниальные плакоды происходят из краевой области и краевые клетки оказываются специфицированными уже на ст. поздней бластулы, сразу после спецификации эпидермальных и нейральных эктодермальных клеток (Patthey et al. 2009). На этой стадии краевые клетки специфицированы как клетки нервного гребня независимо от их ростро-каудального положения и не выявляется плакодных клеток после культивирования краевых эксплантов (Patthey et al. 2009). Клетки ст. поздней бластулы краевых трансплантатов временно экспрессируют транскрипционные факторы Sox2 и Otx2, ранние нейральные маркеры (Bally-Cuif et al. 1995; Rex et al. 1997), прежде чем приобрести характеристики нервного гребня (Patthey et al. 2009). Кроме того, транскрипционный фактор Dlx5, как было установлено, обнаруживается в краевой позиции путем репрессии нейральных признаков, но этого недостаточно для ингибирования эпидермальных характеристик (McLarren et al. 2003). итак. эти данные показывают, что краевые клетки происходят из клеток с первоначальными нейральными характеристиками и что краевые клетки с плакодными характеристиками специфицируются после спецификации клеток нервного гребня.

Краевые клетки специфицируются на ранней фазе с помощью передачи сигналов Wnt в отсутствие активности bone morphogenetic protein (BMP), на более поздней стадии это сопровождается Wnt-индуцированной передачей сигналов BMP (Patthey et al. 2009). Генерация краевых клеток нуждается в этом разделении во времени Wnt и BMP сигналов, чтобы избежать одновременного раннего воздействия на клетки эпибласта двух классов сигналов и последующей генерации эпидермальных клеток (Wilson et al. 2001; Patthey et al. 2009). Детальные описания краевой спецификации и регионализации недавно были рассмотрены (Patthey & Gunhaga 2011).

Placodal progenitors

Карты судеб и спецификаций, полученные на ст. головной складки гаструлы, показали, что плакодные предшественники преимущественно располагаются в краевой области между нейральной и эпидермальной эктодермой (Fig. 2A) (Couly & Le Douarin 1985; Streit 2002; Bhattacharyya et al. 2004; Martin & Groves 2006; Sjodal et al. 2007; Patthey et al. 2008, 2009; Xu et al. 2008). На стадиях гаструлы предшественники обонятельных и хрусталиковых плакод перемешаны на ростральной части края (Fig. 3A) (Bhattacharyya et al. 2004). Более того, экспланты, культивируемые из этой области генерировали как обонятельные, так и хрусталиковые плакодные клетки в разных доменах (Sjodal et al. 2007), показывая тем самым, что и обонятельные и хрусталиковые плакодные клетки специфицируются на стадии поздней гаструлы. На этой стадии, каудальная часть краевых клеток специфицируется как клетки нервного гребня (Patthey et al. 2008), др. краевые производные вместе с плакодными клетками будут вносить вклад в разные части ПНС (Fig. 2A). Эти данные показывают, что гипофизарные, отические и эпибрахиальные типы плакодных клеток специфицируются на более поздних стадиях.

Figure 2. Location of placodal progenitors in relation to the neural ectoderm, epidermal ectoderm and neural crest. (A) At the late gastrula stage, both rostal placodal progenitors and caudal neural crest precursors are located between the neural and epidermal ectoderm. (B) At neurula stages, rostral placodal progenitors are located between the neural and epidermal ectoderm. Caudal placodal progenitors are located between the neural crest and the epidermal ectoderm.

Figure 3. Intermingled placodal progenitor domains. (A) At the head fold stage, olfactory and lens placodal progenitors are intermingled at the rostral border. (B) At neural fold stages, otic and epibranchial placodal progenitors are intermingled in the border region anterio-lateral to the somites. (C) At early head fold stage, ophthalmic (opV) and maxillomandibular (mmV) placodal precursors are intermingled in the head ectoderm positioned at the level of the midbrain-hindbrain boundary. Modified from original fate maps (Streit 2002; Bhattacharyya et al. 2004; Xu et al. 2008).

На ст. гаструлы ростро-каудальная регионализация края регулируется активностью Wnt, при этом Wnt сигналы способствуют приобретению каудальных краевых характеристик и ограничивают ростральные плакодные характеристики (Litsiou et al. 2005; Patthey et al. 2008). На этой стадии, антагонисты Wnt активируются в ростральной части эмбриона, тогда как активность Wnt сохраняется в каудальной части эмбриона (Chapman et al. 2004). Соотв., исследования потери или избытка активности Wnt в эксплантах показали, что клетки могут переключаться между ростральными (хрусталиковыми или обонятельными) плакодными и нервного гребня характеристиками в ответ на изменения в активности Wnt (Patthey et al. 2008). В то же самое время весь краевой домен подвергается воздействию Bmp2 и Bmp4, и экспрессирует BMP нижестоящий активатор, phosphorylated (p) Smad-1/5/8 (Chapman et al. 2002; Faure et al. 2002). Независимо от ростро-каудального уровня, BMP активность ингибирует нейральные характеристики и направляет клетки в направлении приобретения краевых характеристик (Sjodal et al. 2007; Patthey et al. 2008, 2009). Соотв. на ст. гаструлы активность BMP необходима и достаточна для индукции ростральных краевых клеток, которые д. давать обонятельные и хрусталиковые плакодные клетки, а в отсутствие активности BMP, экспланты рострального края будут генерировать нервные клетки с характеристиками переднего мозга (Sjodal et al. 2007). Более того, клетки ростральных плакодных предшественников после воздействия дополнительных сигналов BMP будут генерировать эпидермальные клетки (Sjodal et al. 2007). Т.о., баланс уровней BMP, по-видимому, является критическим для спецификации клеток плакодных предшественников. Это частично регулируется с помощью активности FGF, поскольку ингибирование передачи сигналов FGF в ростральных краевых эксплантах генерирует эпидермальные клетки (Sjodal et al. 2007).

На ст. нейрулы краевая область четко регионализована (Baker & Bronner-Fraser 2001; Streit 2002; Bhattacharyya et al. 2004; McCabe & Bronner-Fraser 2009). На уровне проспективного переднего мозга ростральный край представлен предшественниками гипофизарной, обонятельной и хрусталиковой плакод (Fig. 2B). Клетки каудального края вблизи нейральной пластинки дают клетки нервного гребня (Fig. 2B). Каудальные краевые клетки, локализованные между нервным гребнем и эпидермисом будут давать тройничную, отическую и эпибранхиальную плакоды (Fig. 2B). Некоторые исследования по картированию судеб показали, что плакодные предшественники первоначально перемешаны с краевой областью по мере хода развития плакодные предшественники становятся пространственно разграниченными (Streit 2002; Bhattacharyya et al. 2004; Xu et al. 2008). Происходит ли индивидуальная спецификация разных плакодных клеток в краевом домене или в их финальном пространственном месте предназначения, предстоит ещё определить.

На стадии нейрулы экспрессируется ряд молекулярных маркеров (таких как Dlx3/5, Six1/4 и Eya1/2) в виде гомогенного плакодного поля. Базируясь на паттерне экспрессии этих генов поле проспектиыных плакодных клеток часто обозначается как пре-плакодный или пан-плакодный домен (rev. Streit 2004, 2007; Schlosser 2006, 2008). Примечательно, что на более ранних стадиях Six, Eya и Dlx гены экспрессируются как в краевых клетках, так и проспективных эпидермальных клетках (Streit 2002; Litsiou et al. 2005). Это может быть одним из объяснений, почему эктопические Six1 или Eya2 по одиночке или в комбинации недостаточны, чтобы индуцировать плакодные клетки в проспективные эпидермальные клетки на стадии первичной полоски у эмбрионов (Christophorou et al. 2009). Кроме того, эктопический Dlx5 может индуцировать экспрессию Msx1 и Six4 в клетках нервной пластинки, но не генов, специфичных для хрусталиковой, обонятельной или отической плакод (McLarren et al. 2003). Т.о., хотя Six, Eya, Msx и Dlx гены могут быть необходимы для формирования поля плакодных предшественников, необходимы дополнительные молекулы для специфической индукции плакодных клеток.

Как регулируется экспрессия Six, Eya, Msx и Dlx? На ряде эксплантов и в экспериментах по пересадкам перепел/курица наблюдали, что Eya2 и pan-Dlx экспрессируются в клетках, которые генерируют характеристики отических плакод в ответ на активность fibroblast growth factor (FGF) , тогда как не экспрессирующие Eya2 и pan-Dlx эктодермальные клетки не генерируют плакодных клеток при этих условиях (Martin & Groves 2006). Др. исследование подтвердило, что баланс BMP и FGF необходим, чтобы ограничивать нейральные и эпидермальные клеточные характеристики, соотв. (Sjodal et al. 2007). Соотв., BMP сигналы необходимы для экспрессии плакодами Six1 и Dlx5 (Sjodal et al. 2007). Кроме того, FGF8-покрытые кусочки достаточны для индукции Dlx5 и Eya2, но не Six4 во внеэмбриональных клетках (Litsiou et al. 2005), тогда как BMP, но не FGF сигналы достаточны, чтобы индуцировать Six1 и Dlx5 плакодную экспрессию в проспективных передних нейральных эксплантах (Sjodal et al. 2007).

Individual cranial placodes

The hypophyseal placode

Гипофизарная плакода дает эндокринный аденогипофиз гипофиза. Только что инвагинировавшая гипофизарная ямка, обычно обозначаемая как карман ратке, расположена в своде ротовой полости вентральнее задней части диэнцефалона, из которого происходит нейрогипофиз. Аденогипофиз формируется, когда карман Ратке отсоединяется от покрывающей свод ротовой послости эктодермы. Детальное исследование, как специфические области кармана Ратке дифференцируются в специфические регионы аденогипофиза у кур, было проведено Sasaki et al. (2003). Вместе аденогипофиз и нейрогипофиз составляют функциональный гипофиз. Внутри аденогипофиза разные эндокринные клетки генерируются, которые продуцируют различные гормоны, которые регулируют функции, рост и метаболизм гонад, щитовидной железы и надпочечника. Высвобождение специфических гормонов контролируется гипоталямусом.

Эксперименты in vitro по тканевым взаимодействиям показали, что вентральная часть диэнцефалона может индуцировать развитие аденогипофиза в ростральной эктодерме головы контакт-зависимым способом (Gleiberman et al. 1999). В этом исследовании качественные характеристики аденогипофиза определяются клетками, экспрессирующими adrenocorticotropic hormone (ACTH), первый окончательно дифференцированный тип клеток аденогипофиза (Gleiberman et al. 1999). Индукция клеток аденогипофиза в эктодерме головы с помощью вентральной части диэнцефалона зависит от поддерживающего действия со стороны мезенхимы, независимо от происхождения мезенхимы (Gleiberman et al. 1999).

Молекулярные механизмы, важные для развития аденогипофиза, были изучены боле детально на мышах и рыбках данио (rev. Kelberman et al. 2009; Pogoda & Hammerschmidt 2009) по сравнению с курами. Тем не менее, некоторые исследования на курах описали паттерны экспрессии различных сигнальных молекул и транскрипционных факторов в ходе инвагинации гипофизарной плакоды и в кармане Ратке, а также экспрессия гормонов аденогипофиза (Maseki et al. 2004; Ellestad et al. 2006; Sjodal & Gunhaga 2008; Takagi et al. 2008; Parkinson et al. 2010; Proszkowiec-Weglarz et al. 2011). Благодаря этим исследованиям стало ясно, что некоторые сигнальные пути, подобные ретиноевой кислоте (RA), BMP, Sonic Hedgehog (Shh) и FGF могут играть роль в развитии аденогипофиза. Соотв., у vitamin-A-deficient (VAD) эмбрионов перепела, которые были лишены эндогенной ретиноевой кислоты, карман Ратке полностью отсутствовал (Maden et al. 2007). Кроме того, в плакодном домене для аденогипофиза VAD эмбрионов экспрессия Bmp2, Fgf8 и Shh была сильно снижена или отсутствовала, это указывает на то, что RA необходима для экспрессии этих сигнальных молекул (Maden et al. 2007). Т.о., всё ещё предстоит определить, обусловлено ли отсутствие кармана Ратке у VAD эмбрионов непосредственной потребностью в передаче сигналов RA или опосредованно снижением активности BMP, FGF и/или SHH.

Подтверждает эту идею то, что активность Shh важна для развития аденогипофизной плакоды, на ст. головной складки Shh экспрессируется в мезодерме, расположенной под проспективной аденогипофизной плакодой и эта плакода сама по себе экспрессирует Ptc2, непосредственную мишень для пути Hedgehog (Sjodal & Gunhaga 2008). Напротив, мезодерма, расположенная по презумптивными хрусталиковой и обонятельной плакодами не экспрессирует Shh (Sjodal & Gunhaga 2008). Сообразно talpid3 мутанты кур, которые дефектны по активации пути Shh , формируют эктопические хрусталики, наиболее часто расположенные по срединной линии, происходящей от или соединения с гипофизарным протоком (Buxton et al. 2004; Davey et al. 2006). В согласии с этими исследованиями ингибирование Shh в проспективных аденогипофизных плакодных эксплантах генерируют клетки хрусталика и характеристики обонятельного эпителия (D. Gustavsson and L. Gunhaga, unpubl. data, 2007). Эти наблюдения указывают на то, что активность Shh в ростральной части поверхностной эктодермы является критической для спецификации клеточных характеристик аденогипофизарной плакоды.

The olfactory placode

Обонятельная плакода расположена вблизи вентральной части телэнцефалона и дает сенсорный эпителий и респираторный эпителий в носовой полости. Респираторный эпителий генерирует не нейральные слизь продуцирующие клетки, которые удаляют частицы, вдыхаемые с воздухом. Сенсорный эпителий дает несколько типов клеток, из которых наиболее изучены обонятельные сенсорные нейроны, которые трансдуцируют сигналы запахов через свои аксоны первого черепного нерва в обонятельные луковицы, расположенные в телэнцефалоне. Др. типы клеток в сенсорном эпителии это про-нейральные клетки, глиальные клетки, поддерживающие клетки, горизонтальные клетки, шаровидные клетки и Bowman's клетки. Также присутствуют в обонятельном эпителии gonadotropin-releasing hormone (GnRH) нейроны, которые д. мигрировать в направлении переднего мозга посредством обонятельного нерва. GnRH регулирует высвобождение гормона репродукции из аденогипофиза. Происходят ли GnRH нейроны из обонятельной плакоды или из ткани, соседствующей с обонятельной территорией, предмет споров (Akutsu et al. 1992; El Amraoui & Dubois 1993; Norgren & Gao 1994; Sabado et al. 2012). Клетки обонятельных плакод, как полагают, детерминируются приблизительно на ст. Hamburger & Hamilton (1951) 14 (Bhattacharyya & Bronner-Fraser 2008), когда плакода становится морфологически видимой (Maier & Gunhaga 2009).

На ст. гаструлы предшественники обонятельной и хрусталиковой плакод перемешаны в ростральной части края (Fig. 3A) (Bhattacharyya et al. 2004), и экспланты, культивируемые из этого региона, д. генерировать как обонятельные, так и хрусталиковые плакодные клетки в разных доменах (Sjodal et al. 2007). Внутри обонятельного плакодного домена эти культивируемые экспланты, генерируют нейроны (Sjodal et al. 2007; Patthey et al. 2008). Это указывает на то, что технические проблемы могут препятствовать нейрональной дифференцировке краевых эксплантов в др. исследованиях, использующих гаструлу на стадии головной складки (Bailey & Streit 2006; Bhattacharyya & Bronner-Fraser 2008).

На ст. нервных складок нервной трубки клетки предшественники ростральных плакод могут переключаться между качественными характеристиками обонятельных и хрусталиковых плакод в ответ на изменения активности BMP, при этом активность BMP способствует приобретению хрусталиковых характеристик за счет характеристик обонятельных плакод (Sjodal et al. 2007; Pandit et al. 2011). На ст. нервных складок активность FGF, как полагают, играет роль в развитии клеток обонятельных плакод (Bailey et al. 2006). Однако, на этой стадии, FGF8 недостаточен, чтобы индуцировать обонятельные характеристики в клетках предшественниках хрусталиков, а ингибирование передачи сигналов FGF не блокирует генерации клеток обонятельных плакод (Bailey et al. 2006; Sjodal et al. 2007). Несмотря на это активность FGF необходима для генерации нейронов, происходящих из обонятельных плакод (Bailey et al. 2006; Sjodal et al. 2007).

Обонятельная плакода морфологически впервые становится видимой приблизительно на ст. 14 (Fornaro et al. 2003; Bhattacharyya & Bronner-Fraser 2008; Maier & Gunhaga 2009). На этой стадии активная передача сигналов BMP и FGF изменяется по сравнению с более ранними стадиями; теперь передача сигналов BMP способствует появлению характеристик респираторного эпителия, тогда как передача сигналов FGF необходима для генерации клеток сенсорного эпителия и впоследствии нейрогенеза (Maier et al. 2010). Нейроны генерируются уже во вновь сформированной обонятельной плакоде и обонятельный эпителий является одной из редких структур, которая поддерживает нейрогенез в течение последующей жизни. Несколько нейрогенных маркеров, подобных Hes5, Cash1, Ngn1 и HuC/D экспрессируются в обонятельной плакоде и позднее ограничиваются сенсорным эпителием (Maier & Gunhaga 2009). Др. известные молекулярные маркеры, экспрессируются в обонятельной плакоде, это Raldh3, FoxG1, Dlx5 и Keratin (Bhattacharyya et al. 2004; Bailey et al. 2006; Sjodal et al. 2007). В обонятельной ямке, латерально расположенные клетки респираторного эпителия экспрессируют Msx1/2 и Id3 (Maier et al. 2010). BMP сигналы необходимы в сенсорном эпителии для собственно генерации нейронов, частично за счет ингибирования активности Notch , способствуя тем самым дифференцировке (Maier et al. 2010, 2011). Одновременно с инвагинацией плакоды большинство очень рано сформированных нейронов мигрирует прочь от обонятельного эпителия по направлению к вентральной части телэнцефалона (Fornaro et al. 2003; Maier & Gunhaga 2009; Maier et al. 2011). предполагается, что функция этих первых миграторных нейронов заключается в построении обонятельного нервного тракта (Mendoza et al. 1982; Fornaro et al. 2003; Maier et al. 2011).

The lens placode

Хрусталиковая плакода образует прозрачный хрусталик в глазу и является единственной плакодой, которая не дает какого-либо типа нейрональные клетки. Хрусталик ответственен за проецирование зрительной картинки на центральную часть сетчатки и поэтому важен для зрения. Чтобы выполнить свою функцию, хрусталик д. быть прозрачным и иметь преломляющую поверхность с соотв. изгибом. Эти физиологические свойства гарантируются с помощью активации специальных кристаллиновых белков (Simpson et al. 1995) вместе с деградацией органелл в клетках хрусталиковых волокон (Wride 2011). На ст. ранней нервной трубки презумптивная эктодерма хрусталика лежит поверх зрительного пузырька. Постепенно презумптивная хрусталиковая эктодерма утолщается, чтобы сформировать хрусталиковую плакоду, которая позднее инвагинирует в хрусталиковый пузырек. Вплоть до ст. хрусталикового пузырька большинство проспективных хрусталиковых клеток активно пролиферируют. После этой стадии большинство хрусталиковых клеток выходит из клеточного цикла и удлиняется в первичные хрусталиковые волокна. С др. стороны, спереди расположенные клетки хрусталикового пузырька, формируют хрусталиковый эпителий и сохраняют свою высокую пролиферативную способность. Во время более позднего развития величина клеточной пролиферации постепенно снижается и оказывается ограниченной герминативной (экваториальной) зоной, небольшой областью эпителиальных клеток выше экватора хрусталика, которая остается митотически активной в течение всей жизни.

Как упоминалось выше, хрусталиковые клетки специфицируются на ст. поздней гаструлы и активность BMP необходима и достаточна для индукции клеток хрусталиковой плакоды (Sjodal et al. 2007). На ст. 11, перед появлением видимой плакоды, Sox2 и Pax6 экспрессируются в проспективной эктодерме хрусталика (Pandit et al. 2011), и на ст. хрусталиковой плакоды развитие хрусталика вызывает активацию экспрессии L-Maf (Ogino & Yasuda 1998). Во время этих стадий хрусталиковая эктодерма экспрессирует pSmad1, показатель активности BMP (Belecky-Adams et al. 2002; Pandit et al. 2011). Соотв., предшественники хрусталика нуждаются в устойчивом воздействии сигналов BMP, чтобы поддерживать характеристики хрусталика, частично путем ингибирования генерации клеток обонятельных плакод, также как и индукции L-Maf (Sjodal et al. 2007; Pandit et al. 2011). Напротив, генерация Sox2 и Pax6 позитивных клеток не зависит от сигналов BMP (Pandit et al. 2011).

Около ст. 17, происходит первая ступень дифференцировки хрусталиковых волокон, которая использует активацию crystallin белков, где δ-crystallin является первым кристаллиновым белком, активируемым у кур (Shinohara & Piatigorsky 1976; Reza & Yasuda 2004a). Некоторые исследования привели к заключению, что Pax6 и Sox2 взаимодействуют непосредственно, чтобы активировать экспрессию L-Maf в хрусталиковой плакоде, это сопровождается образованием регуляторного комплекса из Pax6, Sox2 и L-Maf, который индуцирует экспрессию δ-crystallin (Ogino & Yasuda 1998; Kamachi et al. 2001; Reza et al. 2002; Yoshida & Yasuda 2002; Shimada et al. 2003). В соответствие с этими результатами, δ-crystallin энхансер содержит три сайта связывания для Sox2, два для Pax6 и два для Maf (Muta et al. 2002). После начальной активности L-Maf, последующая активация δ-crystallin не зависит от передачи сигналов BMP (Pandit et al. 2011). Итак, BMP сигналы необходимы для активации L-Maf, который вместе с Sox2 и Pax6 будут индуцировать δ-crystallin независимо от активности BMP. Важно отметить, что передача сигналов BMP всё ещё является критической для активации др. маркеров хрусталика, элонгации клеток хрусталиковых волокон и для жизнеспособности клеток хрусталикового эпителия (Belecky-Adams et al. 2002; Jarrin et al. 2012). Дополнительная информация о роли и регуляции с помощью Maf генов и δ-crystallin во время развития хрусталика рассмотрена в обзоре Drs Reza and Yasuda (Reza & Yasuda 2004a,b). Помимо Sox2, Pax6 и L-Maf, и др. транскрипционные факторы, подобные семействам Six и Hes, Otx2, Pitx3, FoxE3 и Prox1 также важны для развития хрусталика, они недавно детально были описаны (Ogino et al. 2012).

Др. сигнальной молекулой, которая играет важную роль в развитии хрусталика, является FGF (Lovicu & McAvoy 2005; Robinson 2006; Cvekl & Duncan 2007; Gunhaga 2011). На ст. поздней гаструлы, время, когда специфицируется хрусталиковая плакода, активность FGF предупреждает проспективные клетки хрусталиковой плакоды от приобретения эпидермальной судьбы (Sjodal et al. 2007). Однако, FGF8 недостаточен, чтобы индуцировать характеристики клеток хрусталика в проспективных нейральных или проспективных эпидермальных клетках (Sjodal et al. 2007). Более того, индукция экспрессии δ-crystallin не регулируется непосредственно сигналами FGF, поскольку ингибирование FGF не супрессирует генерации δ-crystallin-позитивных клеток на ст. 13 или ст.15в эксплантах хрусталика и сетчатки (Loren et al. 2009; Jarrin et al. 2012). Напротив, на ст. ранней нервной трубки неправильная экспрессия Fgf8 в головной эктодерме кур эктопически индуцирует экспрессию L-Maf (Kurose et al. 2005). Принимая во внимание эти результаты и существующую роль активности BMP, рассмотренную выше, мы полагаем, что эктопическая экспрессия Fgf8 в эктодерме ингибирует генерацию эпидермальных клеток, позволяя тем самым сигналам BMP эктопически индуцировать в клетках хрусталиковые характеристики скорее, чем наделять непосредственной ролью индукции хрусталика сигналы FGF. Для более поздних онтогенетических событий, др. исследования показали, что FGF сигналы необходимы для хрусталиковой пролиферации, а также для первичной дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (Le & Musil 2001a; Jarrin et al. 2012). Кроме того, активация Caprin2, маркера клеток хрусталиковых волокон, индуцируемого после экспрессии δ-crystallin, зависит от активности FGF (Loren et al. 2009).

Др. область хрусталика, где передача сигналов FGF играет роль, это каналы щелевых соединений. Поскольку хрусталики лишены кровеносных сосудов, то каналы щелевых соединений, которые соединяют клетки хрусталика являются главными для снабжения питательными веществами и удаления отходов из клеток. Было установлено, что передача сигналов FGF важна для активации и поддержания межклеточных сообщений посредством щелевых соединений (Boswell et al. 2009), а активность FGF повышает щелевыми соединениями обеспечиваемое связывание краски эпителиальными клетками хрусталика (Le & Musil 2001b).

Роль расположения хрусталика по соседству с сетчаткой была исследована в экспериментах по устранению и рекомбинации эксплантов. Эмбрионы, у которых устранены клетки нервного гребня формируют эктопические хрусталики вдали от сетчатки, а экспланты проспективных хрусталиков, культивируемые вместе с клетками нервного гребня, неспособны активировать δ-crystallin (Grocott et al. 2011). Эти результаты указывают на то, что клетки нервного гребня являются источником сигналов, ингибирующих хрусталик. Активность Wnt, как было установлено, ингибирует развитие клеток хрусталика в ростральной части головной эктодермы и индуцирует клетки нервного гребня (Patthey et al. 2008), а передача сигналов Wnt необходима для репрессии хрусталика в экспериментах по рекомбинации проспективного хрусталика и нервного гребня (Grocott et al. 2011). Т.о., Wnt активность является одним из потенциальных сигналов, критических для позиционирования хрусталика рядом с сетчаткой.

The trigeminal placodes

Плакоды тройничного нерва включают офталмическую (opV; также наз. profundal) и maxillomandibular (mmV; также наз. gasserian или trigeminal) плакоды, которые дают сенсорные нейроны тройничного ганглия. Плакоды opV и mmV формируют дистальные части пятого краниального (тройничного) нерва, которые обеспечивают тактильные, болевые и температурные ощущения кожи лица, челюстей и зубов. Проспективные тройничные плакоды расположены на уровние границы между средним и задним мозгом (Fig. 3C), но в отличие от др. плакод тройничные плакоды морфологически трудно отличимы от соседней эктодермы на ранних стадиях развития.

Начиная со ст. 8 транскрипционный фактор Pax3 предопределяет opV плакоду, и Pax3-позитивные opV плакодные клетки специфицируются приблизительно на ст. 9 и детерминируются вскоре после этого (Baker et al. 1999). Более поздними маркерами opV плакоды являются FGFR4 (FREK) и Ngn2, тогда как Ngn1 экспрессируется в mmV плакоде (Stark et al. 1997; Begbie et al. 2002). Эксперименты с DiI окрашиванием показали, что POU-доменовый транскрипционный фактор Brn3 является ранним маркером происходящего из тройничной плакоды сенсорного нейрального клона (Artinger et al. 1998). Детальное исследование роли Pax3 было проведено с помощью электропортации конструкции, ингибирующей Pax3, на ст. 8/9 (Dude et al. 2009). Полученные результаты показали. что Pax3 необходим для экспрессии как FGFR4, Ngn2, так и для экспрессии самого Pax3 в opV плакоде (Dude et al. 2009). Более того, гены мишени для Pax3 необходимы для нейрональной дифференцировки - определяемой с помощью Isl1, который экспрессируется во всех тройничных нейронах (Begbie et al. 2002; Dude et al. 2009), и для отслоения opV плакодных клеток в мезенхиму (Dude et al. 2009). Эктопическая активация Pax3 в не плакодной головной эктодерме или проспективной отической и эпибранхиальной плакодной эктодерме индуцирует FGFR4 и Ngn2 и подавляет экспрессию Pax2 в проспективных отической и эпибранхиальной плакодах (Dude et al. 2009). Недавнее исследование подтвердило взаимную репрессию между Pax3 и Pax6 во время процессов позиционирования opV плакоды (Wakamatsu 2011). Эктопически экспрессируемый Pax6 подавляет экспрессию Pax3, FGFR4 и Brn3a без индукции эктопических маркеров, определяющих обонятельный (Raldh3) или хрусталиковый (L-Maf; d-crystallin) плакодный тип клеток (Wakamatsu 2011). Итак, эти данные подтверждают, что Pax3 играет важную роль в инициальной спецификации opV тройничной плакоды.

Какие сигналы важны для развития тройничной плакоды и из какой ткани исходят сигналы? Внесение барьеров между нервной трубкой и головной эктодермой на уровне проспективной тройничной плакоды на ст. 7-9 у эмбрионов приводи к уменьшению или полному исчезновению экспрессии Pax3 в поверхностной эктодерме (Stark et al. 1997). Напротив, экспрессия Pax3 наблюдалась в эктодерме после внесения барьера с порами, указывая на диффундируемые сигналы, исходящие от нервной трубки, необходимые для индукции и/или поддержания тройничной плакоды (Stark et al. 1997). С др. стороны, предшественники нервного гребня, по-видимому, безразличны для инициации развития тройничных плакод, поскольку Pax3 позитивные тройничные клетки развиваются даже после устранения нервных складок на ст. 9 эмбрионов (Stark et al. 1997).

Два кандидата сигнальных путей, FGF и Wnt, как известно, активны в области перешейка (isthmic region) нервной трубки (Olander et al. 2006; Canning et al. 2007). Супрессия передачи сигналов Wnt в головной эктодерме проспективного тройничного плакодного домена или в нейроэпителии всего эмбриона на ранней сомитной стадии показывают, что передача сигналов Wnt необходима для спецификации Pax3-позитивных opV плакодных клеток (Lassiter et al. 2007; Canning et al. 2008). Два сходных, но не идентичных эксперимента осуществлены для выяснения потребности в передаче сигналов Wnt для поддержания экспрессии Pax3 в opV плакоде, они дали разные результаты (Lassiter et al. 2007; Canning et al. 2008). Ингибирование активности Wnt в поверхностной эктодерме на ст. 10/11 путем внесения доминант негативного Tcf4, который не может соединяться с β-catenin, супрессирует тем самым передачу сигналов Wnt, это привело к экспрессии Pax3 в opV плакоде (Lassiter et al. 2007). Напротив, не обнаружено изменений в генерации Pax3 позитивных opV плакодных клеток после электропортации доминантно негативной Wnt1 конструкции в нервную трубку примерно на ст. 10 (Canning et al. 2008). Это расхождение между экспериментами Lassiters' и Cannings' может быть объяснено техническими отличиями экспериментов. В работе Lassiter et al. (2007), каноническая передача сигналов Wnt супрессировалась в головной эктодерме и определялась экспрессия белка Pax3. Canning с коллегами ингибировали активность Wnt1 в нервной трубке, что сопровождалось обнаружением экспрессии мРНК Pax3 (Canning et al. 2008). Поэтому возможно, что активность Wnt1, исходящая из нервной трубки необходима до стадии 10 для генерации Pax3 позитивных opV плакодных клеток, тогда как после стадии 10 передача сигналов Wnt иных, чем Wnt1 в нервной трубке, достаточна для поддержания Pax3 opV плакодной экспрессии. Др. возможность заключается в том. что после ст. 10 только локальная активность Wnt в opV в самом плакодном домене, но не из нервной трубки происходящих Wnt сигналов, необходима для поддержания Pax3 позитивных клеток. Более того, активность Wnt, как полагают, необходима для отслоения и дифференцировки opV клеток (Lassiter et al. 2007). Недавнее исследование показало, что heparin sulfate proteoglycans Glypican-1 (GPC1) клеточной поверхности, экспрессируется в тройничных плакодах со ст. 12, регулируя каноническую передачу сигналов Wnt (Shiau et al. 2010). Избыточная экспрессия GPC1 вызывает потерю opV плакодных нейронов, сходную с таковой при ингибировании Wnt, а повышение активности Wnt ведет к эффектам гиперактивации GPC1 (Shiau et al. 2010).

Клетки, высвобождаемые тройничными плакодами дифференцируются во время миграции и вносят вклад в краниальные ганглии в виде постмитотических нейронов (Blentic et al. 2011), тогда как нейрональные клетки, покидающие др. плакоды в целом остаются митотически активными (Begbie et al. 2002). Исследование экспрессии Brn3 показало, что нейроны из opV начинают дифференцироваться приблизительно на ст. 10, а нейроны, происходящие из mmV плакод, обнаруживаются на ст. 16 (Begbie et al. 2002). Не удивительно, что снижение передачи сигналов Notch увеличивает, а избыточная экспрессия Notch снижает сенсорный нейрогенез в opV эктодерме (Lassiter et al. 2010). Использование эксплантов показало, что белок Wnt3A, но не FGF8b индуцирует экспрессию Pax3 (Canning et al. 2008). Однако, Wnt3A индукция экспрессии Pax3, также как и плакодная opV дифференцировка в Brn3a нейронах, зависит от FGF (Canning et al. 2008), указывая, что передачи сигналов Wnt и FGF кооперируют, чтобы генерировать opV плакодные сенсорные нейроны.

Было показано, что FGF сигналы действуют посредством MAPK пути, чтобы дифференцировать Pax3-позитивные opV плакодные клетки в Isl1-позитивные нейроны (Canning et al. 2008). Соотв., ингибирование FGFR4 в краниальной эктодерме на ст. 9 у эмбрионов вызывает потерю Pax3-позитивных клеток, уменьшение отслоившихся opV клеток и уменьшение или потерю дифференцировки Isl1 нейронов (Lassiter et al. 2009). Избыточная активация Wnt сигналов на ст. 7-10 эктодермы головы и туловища (Lassiter et al. 2007) или избыточная экспрессия FGF8 на ст. 9 в головной эктодерме (Lassiter et al. 2009), недостаточны для индукции экспрессии Pax3, далее было установлено, что передача сигналов Wnt и FGF д. действовать вместе, чтобы инициировать opV плакодное развитие. Интересно, что Wnt сигналы необходимы для поддержания нормальной экспрессии Fgf8 в isthmic регионе (Canning et al. 2007), а избыточная экспрессия Wnt1 в нейроэпителии приводит к расширению экспрессии Fgf8 в истмической территории и к увеличению экспрессии Isl1 в opV и mmV ветвях (Canning et al. 2008). Итак, блокирование передачи сигналов или Wnt или FGF супрессирует развитие тройничных плакод. Однако блокирование передачи сигналов Wnt или FGF не усиливает активности маркеров др. плакод (Lassiter et al. 2007, 2009), а в отсутствие активности Wnt проспективные opV плакодные клетки теряют способность экспрессировать общий плакодный маркер, Eya2 (Lassiter et al. 2007). Т.о., всё ещё остается неясным, что обеспечивает качественные особенности клеток тройничных плакод в отсутствие сигналов Wnt или FGF.

Platelet-derived growth factor (PDGF), испускаемый нервными складками среднего мозга, как полагают, необходимый для индукции opV плакоды, определяется с помощью Pax3 и экспрессии позднего плакодного маркера CD151, а также нейрональной дифференцировки (McCabe & Bronner-Fraser 2008). Более того, потеря CD151, с использованием morpholinos, уменьшает количества Pax3-позитивных плакодных клеток, а затем и opV нейронов, указывая, что CD151 необходим для поддержания качественных особенностей opV плакодных клеток (McCabe & Bronner 2011).

The otic placode

Отическая плакода развивается по соседству с задним мозгом на уровне ромбомеров 4-6 как раз ростральнее первого сомита. Отическая плакода дает внутреннее ухо и 8-й краниальный (cochleovestibular) нерв. Внутреннее ухо ответственно за восприятие звуков и баланс, тогда как 8-ой краниальный нерв трансдуцирует сенсорную информацию в слуховую часть заднего мозга. На ст. 11/12, картирование судеб края отического бокала показало, что весь дорсальный край отического бокала становится эндолимфатическим протоком, тогда как постеро-вентральная часть ободка становится латеральной стенкой отоциста (Brigande et al. 2000). После закрытия отического бокала образуется отический пузырёк и затем он отщепляется как отоцист, некоторые клетки отического эпителия отслаиваются и формируют нейробласты кохлео-вестибулярного ганглия. В ростральной области отического бокала расположен нейрогенный сенсорный домен, который дает сенсорный орган внутреннего уха. С др. стороны, задний отический эпителий формирует в основном не сенсорные ткани.

На стадии нервных складок Pax2-позитивный домен поверхностной эктодермы по соседству с задней частью заднего мозга включает клетки предшественники отической и эпибранхиальной плакод (Fig. 3B) (Groves & Bronner-Fraser 2000; Streit 2002). Этот Pax2-позитивный домен обозначен как posterior placodal area (PPA) (Ladher et al. 2010), otic-epibranchial progenitor domain (OEPD) (Freter et al. 2008) и пре-отическое поле (Ohyama et al. 2007). Изучение эксплантов показало, что пре-отические Pax2-позитивные клетки специфицируются на ст. 8/9, тогда как окончательные отические плакодные клетки, маркированные Bmp7, Soho1 и hair-cell antigen (HCA), специфицируются на ст. 9 (Groves & Bronner-Fraser 2000; Freter et al. 2008). Вскоре после этого на ст. 10, отические плакодные клетки приобретают Pax2 стабильную качественную особенность (Groves & Bronner-Fraser 2000). Важная роль Pax2 для отического развития подкреплена исследованиями с использованием morpholinos для супрессии Pax2 в отической территории на ст. 6-8, на которой маркеры Gata3 и Eya1 экспрессируются в ранней отической плакоде, которая значительно уменьшалась (Christophorou et al. 2010). Эктопическая экспрессия ^Pax2 в поверхностной эктодерме головы и туловища индуцировала экспрессию Gata3, но не Eya1 или какие-либо эктопические похожие на плакоды структуры (Christophorou et al. 2010). Может ли Pax2 индуцировать определенные отические плакодные маркеры, не было исследовано.

Несколько членов семейства FGF экспрессируется в виде разных временных и пространственных паттернов в ткани, соседствующей с и в развивающейся отической плакоде (reviewed in Schimmang 2007). На ранних сомитных стадиях, Fgf19 и Fgf3 экспрессируются в мезодерме лежащей под проспективной областью отической плакоды (Ladher et al. 2000; Kil et al. 2005), и они также вместе с Fgf8, экспрессируются в энтодерме (Ladher et al. 2000; Karabagli et al. 2002; Kil et al. 2005). Приблизительно на ст. 8, экспрессия Fgf3 и временная Fgf19 обнаруживаются в заднем мозге, а на ст. нервной трубки отическая плакода сама экспрессирует Fgf10 и Fgf8 (Adamska et al. 2001; Karabagli et al. 2002). Очевидно, что эти члены FGF регулируют паттерн экспрессии др. др. в и около отической плакоды (Ladher et al. 2000, 2005). Это указывает, что передача сигналов FGF играет важную роль в индукции отических плакод, эмбрионы кур. лишенные параксиальной мезодермы, неспособны индуцировать отические плакоды (Kil et al. 2005). Более того, электропортация Fgf8 silencing RNA (siRNA) в преотическую область на ст. 4 , сопровождаемая культивированием экспланта из этой области, приводит к уменьшению размера или потере отической плакоды и экспрессии Pax2 (Ladher et al. 2000). Перед ст. 8, ингибирование активности FGF в культурах ткани заднего мозга супрессировало экспрессию Pax2 , а также Eph4a, др. маркера отических плакод (Martin & Groves 2006). Напротив на ст. 6/7 экспланты проспективных тройничных плакод, подвергнутые воздействию FGF2, эктопически экспрессировали маркеры отических плакод Pax2, Dlx3 и EphA4 (Martin & Groves 2006), а FGF2 или FGF8 кусочки, трансплантированные вблизи отической плакоды индуцировали эктопическую экспрессию Pax2, Nkx5.1 и SOHo1 позади отического пузырька (Adamska et al. 2001). Избыточная экспрессия Fgf3 вблизи отической плакодной области давала эктопические пузырек-подобные структуры, экспрессирующие отические маркеры (Vendrell et al. 2000). Недавнее исследование предоставило информацию, что набор транскрипционных факторов; Pea3, нижестоящего эффектора активности FGF, Sox8 и cMyb, необходим для начала экспрессии Sox10 в отической плакоде (Betancur et al. 2011). Более того, на стадии нервных складок, избыточная экспрессия Sox10 по соседству с отическим плакодным доменом индуцирует эктопические пузырьки, которые экспрессируют отические маркеры (Barembaum & Bronner-Fraser 2007). Т.о., доказано, что активность FGF является критической для раннего развития отической плакоды.

Несколько Wnt лигандов экспрессируются в каудальной части заднего мозга по соседству с проспективной отической областью, а также в отическом зачатке (Hollyday et al. 1995; Sienknecht & Fekete 2009). Было показано, что активность FGF достаточна, чтобы индуцировать экспрессию Wnt8c и Wnt8a в каудальной части заднего мозга (Ladher et al. 2000; Urness et al. 2010), и что комбинация Wnt и FGF сигналов индуцирует некоторые отические плакодные маркеры в ростральных эктодермальных эксплантах (Ladher et al. 2000). Интересно, что последовательное действие FGF и Wnt сигналов, как было установлено, важно для индивидуального развития отических характеристик и для исключения эпибранхиальных характеристик (Freter et al. 2008). После формирования FGF индуцированного Pax2-позитивного домена otic-epibranchial предшественников, передача сигналов Wnt вместе с подавлением FGF активности необходима для гарантии своевременного отического развития частично за счет репрессии эпибранхиальных характеристик (Freter et al. 2008). Т.о., проще говоря, внутри FGF индуцированного Pax2-позитивного домена активность Wnt способствует приобретению отических характеристик, в то ж время негативно влияет на эпибранхиальные характеристики.

Регионализация отических плакод частично регулируется с помощью сигналов Notch, при этом Notch активно способствует образованию пронейрального домена путем индукции и/или поддержания экспрессии транскрипционного фактора Sox2 за счет не нейрональной области (Abello et al. 2007; Neves et al. 2011). Более того, Sox2 достаточен, чтобы активировать Atoh1 энхансер и эктопически индуцировать нейральные качественные особенности и специфицировать волосковые клетки не нейральной отической области (Neves et al. 2011, 2012). Кроме того, передача сигналов FGF способствует образованию нейрогенного домена из отического эпителия посредством Sox3, тогда как активность BMP регулирует не нейрогенный регион (Abello et al. 2010; Kamaid et al. 2010). Соотв., BMP активность ингибирует экспрессию Atoh1 посредством Id3 и тем самым предупреждает дифференцировку волосковых клеток (Kamaid et al. 2010). Эндогенный BMP антагонист, Dan, экспрессируется в дорсо-медиальной области отической плакоды на ст. 13-24 (Yamanishi et al. 2007). Повышение активности BMP или благодаря электропортации siRNA против Dan или постоянно активного (ca) Alk6 рецептора (BMP receptor 1b) ведет к эктопической активации Msx1 и Nkx5.1 в нейрогенном регионе отического пузырька (Yamanishi et al. 2007). Итак, Notch и FGF сигналы способствуют образованию нейрогенного отического домена, тогда как активность BMP необходима для формирования не нейрогенной области.

Ретиноевая кислота является др. внешним сигналом, который может, скорее всего, влиять на развитие отических плакод, поскольку энзимы, продуцирующие RA, Raldh2, преимущественно экспрессируемый в мезодерме позади отической плакоды, и некоторые Cyp26s (RA деградирующие энзимы) экспрессируются в эктодерме ростральнее отической плакоды (Blentic et al. 2003; Reijntjes et al. 2004; Bok et al. 2011). В соответствии с этим паттерном экспрессии, кусочки, смоченные Raldh ингибитором citral и имплантированные позади отического бокала, подавляли задние отические гены (Tbx1 и SOHo1), тогда как экспрессия ростральных отических генов (Lfng и NeuroD1) распространялась на задний компартмент (Bok et al. 2011). Т.о. , по-видимому, возможно, что RA регулирует ростро-каудальную организацию области отических плакод. Однако индукция отических плакод, по-видимому, не зависит от передачи сигналов RA, поскольку vitamin-A-deficient (VAD) эмбрионы перепела, которые лишены эндогенной RA, формируют отический пузырек, позитивный по Pax2, Bmp7 и GATA3 (Kil et al. 2005).

The epibranchial placodes

Эпибранхиальные плакоды расположены вентральнее отических плакод и дорсо-каудальнее области расщепления между фарингеальными дугами. Эпибранхиальные плакоды состоят из geniculate, petrosal и nodose плакод, которые дают сенсорные части 7-го (лицевого), 9-го (glossopharyngeal) и 10-го (блуждающего) краниальных нервов, соотв. Лицевой нерв передает ощущения вкуса и сенсорную информацию от долек ушной раковины, а также иннервирует гланды. Языкоглоточный нерв иннервирует язык, каротидный синус - определяя и регулируя кровяное давление, и каротидное тельце - определяя уровни кислорода в крови, pH и температуру. Блуждающий нерв передает сенсорную информацию от почти всех органов внутри тела.

Как упоминалось выше, предшественники эпибранхиальных и отических плакод возникают из общего FGF индуцированного Pax2-позитивного домена на поверхности эктодермы по соседству с задней частью заднего мозга (Fig. 3B) (Groves & Bronner-Fraser 2000; Streit 2002; Freter et al. 2008). Затем развитие клеток эпибранхиальных плакод нуждается в непрерывной передаче сигналов FGF вместе с ингибированием активности Wnt (Freter et al. 2008). Напротив, передача сигналов Wnt, связанная с ослаблением сигналов FGF супрессируют генерацию клеток эпибранхиальных плакод и способствуют приобретению отических характеристик (Freter et al. 2008). Кроме того, передача сигналов BMP играет роль во время эпибранхиального нейрогенеза (Begbie et al. 1999; Kriebitz et al. 2009). Bmp4 экспрессируется в самиъ эпибранхиальных плакодах, тогда как Bmp7 и BMP антагонист Protein Related to Dan and Cereberus (PRDC) экспрессируются в соседней фарингеальной энтодерме (Begbie et al. 1999; Kriebitz et al. 2009). Эктопические BMP сигналы способствуют генерации эпибранхиальных плакодных нейронов и напротив ингибирование активности BMP супрессирует индукцию нейрональных клеток эпибранхиальных плакод (Begbie et al. 1999). Др. исследование продемонстрировало, что PRDC модулирует активность BMP в эпибранхиальных плакодах, в которые активация PRDC блокирует экспрессию Bmp4 и тем самым ингибирует эпибранхиальный нейрогенез внутри эпибранхиальных плакод, а потеря функции PRDC индуцирует эктопический Bmp4 и расширение плакодного нейрогенеза (Kriebitz et al. 2009). Т.о., нейрональная дифференцировка обеспечивается с помощью активности BMP в эпибранхиальных и также в обонятельных плакодах (Kriebitz et al. 2009; Maier et al. 2011).

Транскрипционный фактор Sox3 первоначально экспрессируется в виде динамического паттерна в домене более крупном, чем эпибранхиальные плакоды, прежде чем быть ограниченным эпибранхиальными плакодами (Abu-Elmagd et al. 2001; Ishii et al. 2001; Tripathi et al. 2009). Экспрессия Sox3 поддерживается в эпибранхиальных плакодах до тех пор, пока клетки не покинут плакоды, т.к. она инициирует нейрогенез (Abu-Elmagd et al. 2001). Во время начала нейрогенеза экспрессия Sox3 подавляется и активируются последовательно нейрогенные маркеры, такие как Ngn1, NeuroD, NeuroM и Phox2a (Abu-Elmagd et al. 2001). Блокирование экспрессии Sox3 ингибирует эпибранхиальные нейрогенез (Abu-Elmagd et al. 2001; Tripathi et al. 2009), подтверждая, что функция Sox3 необходима для инициации нейрогенеза в эпибранхиальных плакодах. Тогда как способствует ли передача сигналов FGF образованию нейрогенного домена эпибранхиальных плакод посредством Sox3, как это наблюдается в отическом эпителии (Abello et al. 2010), отсается определить.

Транскрипционный фактор Hoxa3 экспрессируется в проспективных эпибранхиальных плакодах, заднем мозге, спинном мозге и клетках нервного гребня (Watari-Goshima & Chisaka 2011). В недавнем исследовании изучали роль Hoxa3 в миграции эпибранхиальных нейробластов путем блокирования функции Hoxa3, используя электропортированные morpholinos или в эктодермальных регионах эпибранхиальных плакод или нервной трубке по всему заднему мозгу у эмбрионов на ст. 9-11 (Watari-Goshima & Chisaka 2011). Результаты показали, что Hoxa3 клеточно-автономно регулирует миграцию всех эпибранхиальных нейробластов, тогда как активность Hoxa3 в нервной трубке и/или в клетках нервного гребня необходима для миграции клеток, происходящих из плакод лицевого и блуждаюещего нервов, но не из языкоглоточного нерва.

Placodal invagination

4 краниальные плакоды, гипофизарная, обонятельная, хрусталиковая и отическая подвергаются морфологическим процессам, наз. инвагинацией, при которой эпителий прогибается внутрь, формируя бокало-образную структуру. Ранние инвагинированные плакоды, т. наз. мелкоямчатые структуры, из которых гипофизарная ямка обозначается как карман Ратке. Этот процесс начинается на разных стадиях для разных плакод, стартуя с отической плакоды приблизительно на ст. 10/11, гипофизарной на ст. 14, хрусталиковой на ст. 14/15 и, наконец, обонятельной, на ст. 17 (Fig. 4). Обонятельная, хрусталиковая и отическая ямки и карман Ратке углубляются в процессе формирования зрелых структур. На этих ранних стадиях развития морфологические движения хрусталикового эпителия несколько отличны от др. плакод. После углубления хрусталиковой ямки хрусталиковый эпителий сливается сам с собой и соединение с лежащей поверх поверхностной эктодермой, проспективной роговицей, устраняется. Это приводит к образованию хрусталикового пузырька в качестве обособленного образования (Fig. 4D). Отический бокал также отсоединяется, чтобы сформировать отоцист, но на более поздних стадиях развития.

Figure 4. Placodal invagination of otic, lens, hypophyseal and olfactory placodes. (A-D) Cryo-sections of the developing chick otic, lens, hypophyseal and olfactory placodes indicating the morphological movements during placodal invagination. Nuclei are detected with 4'6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) staining. Arrowheads in first row indicate the presumptive placodal ectoderm. The panels A-D indicate different morphological events at different time points of development. All images are photographed at 40Ч except the image indicated with *, which is photographed at 20Ч.

Базируясь на изучении индивидуальных инвагинаций плакод, были суммированы общие известные механизмы, контролирующие этот процесс. Разнообразие механизмов указывает на вклад в инициальную инвагинацию плакод клеточной гибели, клеточной пролиферации, тканевых взаимодействий, апикальных сужений, базальных расширений и роста давления, производимого латеральным ростом не плакодной эктодермы (Schook 1980; Wakely 1984; Hendrix et al. 1993; Sai & Ladher 2008; Plageman et al. 2010). Механические силы, вызываемые активными перестройками межклеточных контактов и цитоскелета, модифицируют форму клеток и клеточную подвижность, чтобы трансформировать плоский слой клеточной эктодермы в структуру с тремя измерениями. Некоторые сигнальные пути, транскрипционные факторы и молекулы клеточной адгезии ассоциированы с регуляцией инвагинации плакод (reviewed in Hogan 1999; Jamora & Fuchs 2002), и сходные регуляторные механизмы, как полагают, контролируют изгиб нейроэктодермы во время закрытия нервной трубки (rev. Suzuki et al. 2012).

До инвагинации клетки внутри плакоды удлиняются вдоль своей апико-базальной оси и одновременно изменяют форму клеток с цилиндрической на коническую или клинообразную форму в результате уменьшения апикальной поверхности клеток и расширения базальной поверхности клеток (Sai & Ladher 2008; Christophorou et al. 2010; Plageman et al. 2010, 2011; Borges et al. 2011). Такое изменение формы обычно известно как апикальное сужение, по крайней мере, частично обусловлено апикально расположенным акто-миозиновым цитоскелетом (Sai & Ladher 2008; Christophorou et al. 2010; Plageman et al. 2010, 2011; Borges et al. 2011). Кроме того, изменения, ассоциированные с клеточным циклом, подобно интеркинетической миграции ядер во время S-фазы (миграция ядра между апикальной и базальной сторонами) , как полагают, также играют роль в апикальном сужении (Alvarez & Navascues 1990).

И апикальное сужение и инвагинация плакод, как известно, обеспечиваются апикальными сетями F-actin, которые контрактируют в результате взаимодействия с Myosin II. По сравнению с общей экспрессией миозина фосфорилированный (p)Myosin накапливается на базальной стороне эктодермы перед инвагинацией (Sai & Ladher 2008; Borges et al. 2011), где он необходим для истощения F-actin (Sai & Ladher 2008). В дальнейшем F-actin накапливается на апикальной стороне во время формирования плакод (Sai & Ladher 2008; Borges et al. 2011). Как in vitro, так и in vivo эксперименты показали, что блокирование Myosin II или полимеризации F-actin приводят к неспособности плакод к инвагинации. Более того, накопление pMyosin и апикальные сужения нуждаются в апикальной локализации из Rho семейства GTPase RhoA (Borges et al. 2011; Plageman et al. 2011). RhoA формирует комплекс вместе с Trio, Shroom3 и Rock1/2, которые контролируют апикальное сужение (Plageman et al. 2010, 2011). Trio является guanine nucleotide exchange фактором, который активирует RhoA, Shroom3 является актин-связывающими цитоскелетным белком и ROCK1/2 является Rho-ассоциированной киназой, которая активирует контрактильную actin-myosin сеть (Plageman et al. 2010, 2011). Кроме того, Myosin непосредственно фосфорилируется с помощью ROCK (Amano et al. 1996), а ингибирование активности или RhoA, ROCK или Shroom3 нарушает инвагинацию плакод (Borges et al. 2011; Plageman et al. 2011).

Молекулы клеточной адгезии, подобные кадгеринам и N-CAM, которые экспрессируются в плакодах и нервной пластинке, как известно, частично участвуют в изменении формы клеток и тканевых перемещениях. E-Cadherin экспрессируется в эктодермальных клетках до инвагинации хрусталиковой плакоды, тогда как N-Cadherin активируется, когда плакода начинает инвагинировать (Reza et al. 2007). Juxtamembrane domain (JMD) N-cadherin является важной регуляторной областью для адгезивного свойства белка и для обеспечения цитоскелетных перестроек. Используя культуры клеток, было показано, что инъекции растворимого JMD из N-cadherin активирует RhoA и ROCK, чтобы обеспечить изменения в актомиозиновом цитоскелете (Piccoli et al. 2004). Др. исследование с использованием morpholinos против Pax2, N-cadherin и N-CAM в пре-отическом домене у эмбрионов ст. 6/7 показало. что Pax2 необходим для элонгации клеток и для создания характерной столбчатой формы плакодных клеток (Christophorou et al. 2010). Очевидно, что Pax2 регулирует эти морфологические изменения посредством N-cadherin и N-CAM, и обе молекулы необходимы независимо для элонгации клеток (Christophorou et al. 2010). Играют ли роль др. Pax-гены, такие как Pax6, экспрессирующийся в гипофизарной, обонятельной и хрусталиковой плакодах (Bhattacharyya & Bronner-Fraser 2008; Sjodal & Gunhaga 2008; Plageman et al. 2010; Pandit et al. 2011) сходную роль, что и Pax2 в отической плакоде, пока неизвестно. Хотя эктопический Pax2 в поверхностной эктодерме головы и туловища индуцирует N-cadherin и N-CAM, но этого недостаточно, чтобы вызывать элонгацию клеток или сформировать какую-либо похожую на плакоду структуру (Christophorou et al. 2010). Напротив, эктопическая экспрессия Group B1 Sox (Sox1-3) генов в головной эктодерме вызывает экспрессию N-Cadherin и вызывает эктопическое развитие плакодных структур (Abu-Elmagd et al. 2001; Matsumata et al. 2005). Однако эктопическая экспрессия Sox2 вместе с ингибитором Pax2 недостаточна, чтобы индуцировать N-cadherin (Christophorou et al. 2010), указывая тем самым, что эти два фактора действуют синергично, чтобы активировать N-cadherin.

Иные чем связывающие актин белки, zinc finger транскрипционный фактор Spalt4 (также известный как Sall4) четко экспрессируется в обонятельной, отической и слабо экспрессируется в хрусталиковой плакоде (Barembaum & Bronner-Fraser 2007). Электропортация Spalt4 на ст. 8-13 в не плакодную головную эктдерму приводила к эктопической инвагинации соотв. эктодермы (Barembaum & Bronner-Fraser 2007). FGF покрытые кусочки имплантированные в область opaca индуцировали экспрессию Spalt4 (Barembaum & Bronner-Fraser 2007). Более того, Pea3, нижестоящий эффектор для передачи сигналов FGF, и транскрипционный фактор Pax2 непосредственно активируют транскрипцию Spalt4 в отической плакоде (Barembaum & Bronner-Fraser 2010). Необходимы дальнейшие исследования по выяснению регуляции и нижестоящих эффектов Spalt4 во время формирования и инвагинации плакод.

Что известно об инвагинации плакод и сигнальных путях? Используя культуры отической ткани, было показано, что передача сигналов FGF важна для прямой активации myosin II и реорганизации F-actin и искривления плакод (Sai & Ladher 2008). Кроме того, нокдаун экспрессии FGF3 с использованием silencing (si) RNA ведет к частично инвагинированным плакодам или неспособности сформировать отический пузырек (Zelarayan et al. 2007). С помощью вирусной инфекции, эктопически экспрессируемый FGF3, по-видимому, индуцирует плакоду, а также запускает внутренне присущую экспрессию генетической программы, которая необходима для инициального развития внутреннего уха (Vendrell et al. 2000). Когда кусочки FGF8 помещали вблизи развивающейся отической плакоды, то она увеличивала экспрессию отических маркерных генов, тогда как FGF2 индуцировал не только отические характеристики, но и также приводил к формированию эктопических структур (Adamska et al. 2001). Более того, исследования по электропортации в обонятельную плакоду предоставили доказательства, что активность FGF необходима для инвагинации носового эпителия (Maier et al. 2010). Становится ясным, что активность FGF играет важную роль в инвагинации плакод. Вдали от сигналов FGF было установлено, что BMP сигналы необходимы для раннего образования и инвагинации хрусталиковой и обонятельной плакод (Maier et al. 2010; Pandit et al. 2011). Итак, большинство вопросов остается без ответа из-за сложного молекулярного аппарата, контролирующего инвагинацию плакод (Fig. 5).

Figure 5. Model of the pathways regulating apical restriction and epithelial bending.

Concluding remarks

Our understanding of the specification, differentiation and morphological movements of cranial placodal cells during early development has increased during the last decades. Specification of individual placodal cells occurs at early stages, from gastrula to neural fold stage, time points when the border region lies close to the prospective neuroectoderm. One might speculate that the specification of placodal cells correlates with the specification of different neural cell types along the rostro-caudal axis, which later will build up functional neural networks controlling sensory input. Thus, it would be interesting to understand how the development of the placodes is coordinated in space and time with the development of cells and tissues in the central nervous system (CNS). Another unresolved issue is to know what triggers a restricted domain of the head ectoderm to develop into a specific cranial placode. Or, should we look at this phenomenon the other way around, what inhibits certain regions of the head ectoderm to develop into placodal structures? The various developmental events described for cranial placodes are regulated by the interactions of several signaling pathways and transcription factors. Some processes, like the invagination of placodal epithelium and neuronal differentiation within the placodes, appears to be regulated by common molecular machineries, whereas the specification and differentiation of individual placodal cells are controlled by unique molecular codes. It is obvious that further research has to be performed to clarify in detail the seemingly common molecular regulations of the early development of the cranial placodes. Moreover, we need a better understanding of the intra-cellular mechanisms responsible for the distinct actions of the different signaling pathways involved during individual placodal specification. Many additional questions remain to be answered, some of which are mentioned in the above sections of this article, and all of them can be addressed using chick as a model system.

Development of cranial placodes: Insights from studies in chickVijay K. Jidigam, Lena Gunhaga Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 79–95, January 2013

Development of cranial placodes: Insights from studies in chick
Vijay K. Jidigam, Lena Gunhaga
Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 79–95, January 2013