Клетки караниального нервного гребня являются мультипотентной популяцией клеток, которая происходит из дорсальнойчасти нервной трубки и мигрирует , чтобы сформировать множественные производные, включая череепно-лицевой скелет, нейроны и глию периферической рнервной системы и меланоциты (LaBonne and Bronner-Fraser, 1998; Le Douarin, 1982). Популяция скелетогенных клеток нервного гребня мигрирует кпереди вокруг глаз и вентрально в фарингеальные дуги, чтобы дать хрящи и кости лица (Graham, 2003; Le Douarin, 1982; Raible et al., 1992; Schilling and Kimmel, 1994; Trainor and Krumlauf, 2001). Клетки краниального нервного гребня, которые мигрируют вентро-латерально из задней части chtloytuj мозга движутся тремя самостоятельными потоками в фарингеальные дуги. Прибыв клетки краниального нервного гребня взаимодействуют с др. тканевыми слоями дуг, включая эктодерму, энтодерму и мезодерму, чтобы сформировать у рыбок данио лицевую- и мозговую часть черепа. Лицевая часть черепа состоит из хрящей, которые вносят вклад в челюсти и жабры, включая Меккелев хрящ, происходящих из первой фарингеальной дуги, ceratohyal и hyosymplectic из второй дуги и ceratobranchial хрящи из наиболее задних дуг с третьей по седьмую (Couly et al., 1993; Fraser, 1990; Horstadius, 1946; Le Douarin, 1982; Le Douarin et al., 1993; Le Lievre, 1978; Lumsden et al., 1991; Osumi-Yamashita et al., 1994; Schilling and Kimmel, 1994). Самый передний поток миграции NCCs из переднего мозга и передней части среднего мозга вносит вклад в переднюю часть наиболее дорсальной части нейрокраниума, хрящи, которые поддеживают головной мозг и слуховую капсулу (Kimmel and Eberhart, 2008; Wada et al., 2005). Самая передняя часть нейрокраниума, пластинка решетчатой кости, также представляет у рыбок данио нёбо и соединена с наиболее задней частью нейрокраниума c помощью трабекулярных хрящей. Недавнее исследование по картированию судеб показало, что медиальная часть решетчатой пластинки происходит из мигрирующих кпереди клеток нервного гребня, тогда как трабекулы взникают из более кзади мигрирующих клеток из максиллярной порции первой дуги (Swartz et al., 2011; Wada et al., 2005). Поскольку несколько генов было идентифицировано, участвующих в формировании паттерна черепно-лицевого скелета, всё ещё существует дефицит в нашем знании относительно транскрипционного контроля этого процесса.

PRDM белки контролируют несколько критических аспектов развития, включая дифференцировку, клеточный рост и апоптоз и поэтому рассматриваются как важные регуляторы клеточнцых судеб (Turner et al., 1994; Deng and Huang et al., 2004; Fog et al., 2012; He et al., 1998; Hohenauer and Moore, 2012; Yan et al., 2007). PRDMs являются частью крупного эволюционно законсервированного семейства Zn-Finger транскрипционных факторов, которые различаются по количеству Zn-Finger повторов, которые обеспечивают связывание ДНК. Кроме того, они содержат на N-конце PR домен, которые сходен с SET доменом белков, обнаруженных в классе гистоновых метилтрансфераз, которые обеспечивают присоединение гистон-модифицирующих энзимов. Благодаря этому функция PRDM в основном ассоциирована с репрессией транскрипции. Существует 5 подсемейств, которые включают 17 разных генов, которые были идентифицированы у человека и 15 у рыб Fugu rubripes . Филогенетические взаимомотношения между PRDM генами указывают на то, что имеются сходства и различия между всеми членами семейства, могут быть идентифицированы подсемейства на базе сходных последовательностей генов и структуре белка и числу Zn-finger повторов: PRDM 2, 3, 5 и 16 принадлежат к одному и тому же подсемейству, а PRDM1 обнаруживает общность с PRDM 4, 10, 15 (Fumasoni et al., 2007).

Членом основателем PRDM семейства является Prdm1, также наз. Blimp1 у млекопитающих. Предыдущие исследования в разных лаб. показали, что Prdm1 необходим для развития B клеток и требуется для дифференцировки В клеток в плазматические клетки (Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Turner et al., 1994), и кроме того он участвуе в развитии черепно-лицевых структур, конечностей и зародышевых клеток у мышей (Ohinata et al., 2005; Vincent et al., 2005). У рыбок данио, prdm1a мутантные эмбрионы снижают спецификацию клеток нервного гребня и Rohon-Beard сенсорных нейронов (Artinger et al., 1999; Roy and Ng, 2004, Hernandez-Lagunas et al., 2005), вызывают отсутствие медленно сокращающихся мышечных клеток (Beermann et al., 2010) и дефекты в прехордальной пластинке и развития плавников (Mercader et al., 2006; Wilm and Solnica-Krezel, 2005). В частности в черепно-лицевом развитии, prdm1a экспрессируется в крупном домене, покрывающем задние фарингеальные дуги, которые дают заднюю часть висцерокраниума и глоточные зубы (Birkholz et al., 2009; Sun et al., 2008). Как у мышей, так и у рыбок данио, prdm1 необходим для образования задней части черепно-лицевых структур и желез, таких как тимус, скорее всего, посредством регуляции пролиферации (Birkholz et al., 2009; Robertson et al., 2007; Wilm and Solnica-Krezel, 2005).

Довольно много известно о PRDM1, занчительно менее известно о др. PRDM белках во время развития, хотя наибольший интерес возникает именно к ним (Fog et al., 2012; Hohenauer and Moore, 2012; Swartz et al., 2012). PRDM3, также известен как EVI-1, он ассоциирует с ролью в раковцых опхолях у человека, включая острую миелогенную лейкемию (Buonamici et al., 2003; Morishita et al., 1988; Russell et al., 1994; Senyuk et al., 2011) и некоторые солидные опухоли (Brooks et al., 1996; Sunde et al., 2006). Xenopus prdm3 и мышиный Prdm3/Evi1 экспрессируются в головных складках и в первой и второй фарингеальных дугах на поздней стадии хвостовой почки и на ст. E8.5–10.5, соотв. (Hoyt et al., 1997; Mead et al., 2005). Мыши с целенаправленным разрушением Prdm3/Evi1 погибают на ст.. E10.5 от сердечно-сосудистых и/или плацентных дефектов. Эти эмбрионы обнаруживают также изменения в структурах, происходящих из нервного гребня, включая потерю ганглиев дорсальных корешков и краниальных ганглиев, и гипоплазию фарингеальных дуг (Hoyt et al., 1997). PRDM5 инактивирован в разного типа опухолях, подтверждая, что он действует как опухолевый супрессор (Cheng et al., 2010; Duan et al., 2007; Watanabe et al., 2007). У рыбок данио prdm5 экспрессируется повсеместно с ранних стадий дробления, а нокдаун ведет к циклопическому фенотипу с дефектами формирования головы (Meani et al., 2009). У человека PRDM16 ассоциирует с различными болезненными состояниями, включая миелоидную лейкемию и взрослую Т-клеточную лейкемию (Mochizuki et al., 2000; Nishikata et al., 2003), и контролирует выбор клеточных судеб между коричневым жиром и скелено-мышечными клетками (Kajimura et al., 2008, 2009; Seale et al., 2007, 2008). В черепно-лицевом развитии мышей Prdm16 экспрессируется в тканях, происходящих из нервного гребня, подобно Prdm3, а также в фарингеальных дугах и области формирующегося нёба и Меккелева хряща на ст. E11.5. С помощью ENU полученные мутанты Prdm16 у мышей обнаруживают аномалии развития, которые включают гипопластическую нижнюю челюсть и расщепление нёба (Bjork et al., 2006, 2010a, b; Horn et al., 2011).

Базируясь на фенотипе черепно-лицевого скелета у мутантов prdm1a и экспрессии выше упомянутых prdms, мы попытались определить функцию др. членов семейства prdm во время развития черепно-лицевого скелета рыбок данио, концентрируясь на prdm3, 5 и 16. Используя анализ экспрессии и Morpholino нокдаун, мы установили эффект нокдауна индивидуальных и в комбинации Prdm факторов. Наши данные подтвердили, что белки Prdm необходимы для формирования паттерна нейрокраниума и в меньшей степени для общего формирования паттерна лицевой части черепа.

DISCUSSION

В данном исследовании мы установили, что prdm3, prdm5 и prdm16 играют роль в черепно-лицевом развитии у рыбок данио. Мы показали, что prdms экспрессируются в специфические временные точки развития во многих тканях и что целенаправленный нокдаун по одиночке или в комбинации ведет к дефектам хрящей в мозговой части черепа и в передней части лицевой части черепа. С тех пор как некоторых др. исследованиях была продемонстирована роль белков PRDM в иммунной системе и опухолях, немногие исследования обратились к выявлению их роли во время развития. Это первое систематическое исследование роли разных членов семейства генов prdm в черепно-лицевом развтии рыбок данио.

Prdm Proteins Play a Redundant Role in Neurocranium Development

Мозговая часть черепа является структурой, состоящей из передней решетчатой (ethmoid) пластинки и задних трабекул, а также из заднего парахорального хряща (Cubbage and Mabee, 1996). Нейрокраниум происходит как нервного гребня, так и мезодермы и состоит из передних, происходящих из нервного гребня структу, включая ethmoid пластинку и трабекулы и заднего парахордального хряща из мезодермы. Картирование судеб переднего потока миграции, который продвигается вокруг глаз, дает медиальный хрящ ethmoid пластинки, тогда как клетки, которые мигрируют более сзади в дорсальную часть дуги 1, вносят вклад в трабекулы (Kimmel and Eberhart, 2008; Wada et al., 2005). Эти популяции нуждаются в передаче сигналов shh: мутации членов этого пути или воздействие cyclopamine, чтобы ингибировать передачу сигналов shh, вызывают дефекты в ethmoid пластинке и трабекулах (Wada et al., 2005). Наши результаты с prdm3 и prdm16 двойными морфантами подтверждают, что они могут действовать ниже пути передачи сигналов shh. Пока неизвестно, вносят ли вклад клетки нервного гребня и/или мезодермы в переднюю basicapsular комиссуру. Эти структуры, по-видимому, чувствительны к дозе prdm и располагаются на основании головного мозга под пластинкой. Передние хрящи нейрокраниума создают основание для головного мозга у рыбок данио и поэтому отсутствует настоящаяя носовая полость у рыб, передняя часть нейрокраниума считается у рыбок данио эквивалентом вторичной нёбной пластинки млекопитающих (Eberhart et al., 2008; Swartz et al., 2011). Т.о., понимание развития этих структур может помочь пониманию формирования нормальной нёбной пластинки, а также этиологии расщепления губ без расщепления нёба, которое возникает в результате дефектов морфогенеза нёба. Фенотипы, наблюдаемые нами при нокдауне одиночных prdm, включают общую гипоплазию нейрокраниума. Однако у двойных нокдаунов ethmoid пластинка не такая широкая на своем конце, а трабекуля укорочены. Кроме того, передние basicapsular комиссуры отсутствуют. Интересно, что мы не наблюдали ни уменьшения числа клеток и/или отсутствие хондрогенеза в медиальной части ethmoid пластинки, часто приводящих к расщеплению, это может указывать на то, что затрагиваются специфически мигрирующая передняя популяция клеток нервного гребня. Чтобы выяснить это, мы попытались обеспечить некоторым эмбрионам возможность дожить до ст. 6–7 дней после оплодотворения (dpf), однако многие были сильно дефектными в этот момент времени. Как было указано выше, эти фенотипы нейрокраниума сходны с теми, которые обнаруживаются вследствие воздействия cyclopamine на поздних стадиях, 36–48 hpf, вообще-то это подтвердило, что prdm3 и prdm16 могут быть функциональными ниже сигнального пути shh в этот специфический момент развития (Wada et al., 2005). Дальнейшие эксперименты позволят понять, модулируются ли prdms c помощью Shh, но имеющиеся данные подтверждают, что гены prdm выполняют перекрывающиеся роли в развитии нейрокраниума.

Prdm's Proteins Have a Moderate Role in Viscerocranium Development

Мы показали, что prdm morphant личинки, по-видимому,обладают слабым фенотипическим отклонением в лицевой части черепа, при этом наблюдается укорочение Меккелева хряща и гипоплазия palatoquadrate. Во-вторых, структуры дуг также обнаруживают слабые дефекты, при этом hyosymplectic образуется нормально, тогда как ceratohyals часто сдавлен и угол между обоими ceratohyals больше, чем в норме. Дуги 3–7 , по крайней мере, затронуты у prdm морфантов, за исключением prdm1a, который является критическим для собственно формирования задних хрящей (Birkholz et al., 2009). Мы наблюдали более сущесмтвенно измененный Меккелев хрящ с увеличением дозы prdm1a Morpholino, это указывает на то, что общие уровни белков Prdm могут быть важны (Hernandez-Lagunas and Artinger, неопубл. наблюдение). У мышей эмбриональная мутация в Prdm1 вызывает гипоплазию задних дуг, это согласуется с её ролью в развитии черепно-лицевого скелета, хотя это не было проверено напрямую. Поскольку роли Prdm3 и 5 не были специфически изучены у мышей приметнительно к черепно-лицевому развитию, Prdm16 ENU аллель, вызывающий сдвиг рамки считывания и преждевременное окончание, вызывает расщепление нёба (Bjork et al., 2010b). Prdm16 экспрессия начинается на ст. E9.5 в регионе фарингеальных дуг и экспрессируется в половинках нёба на E13.5–E14.5 и может играть роль в хондрогенезе и формировании кости (Horn et al., 2011). Наши находки у рыбок данио, что нокдаун prdm16 в комбинации с др. prdms вызывает дефекты нейрокраниума, согласуется с предыдцщим сообщением на мышах.

Evolutionary Conservation of prdm Expression and Function

В терминах последовательностей обнаруживается высокая консервация между всеми prdm паралогами среди позвоночных. Отличия обнаруживаются только количеству и положению доменов, связывающих zinc finger ДНК. Паралоги prdm имеют сходные, но иногда несколько отличающиеся паттерны экспрессии и функции. Напр., экспрессия prdm1 у позвоночных очень консервативна, он экспрессируется в сомитах, задних фарингеальных дугах, зачатках конечностей и сетчатке среди проанализированных видов (Chang et al., 2002; Wilm and Solnica-Krezel, 2005). В этом контексте паттерн экспрессии указывает на то, что PRDM1 необходим для разнообразных онтогенетических процессов. В самом деле, исследования ка на мышах, так и рыбках данио показывают его важность в развитии В клеток (Messika et al., 1998; Turner et al., 1994), зародышевых клеток (Ohinata et al., 2005; Vincent et al., 2005), клеток нервного гребня (Bikoff et al., 2009; Hernandez-Lagunas et al., 2005; Olesnicky et al., 2010; Roy, 2004) и мышеных клеток (Baxendale et al., 2004). Недавнее исследование на миногах показало, что prdm1 экспрессируется на границе нервной пластинки и жаберных дугах, подтверждая, что он экспрессируется подобно своим ортологам у gnathostome (Nikitina et al., 2011). Однако два близких паралога prdm1a у рыбок данио и prdm1b и prdm1c, частично потеряли некоторые prdm1a домены экспрессии. Ген prdm1b, подобно prdm1a, на выском уровне экспрессируется в сомитах и сетчатке, но prdm1c обнаруживает более распространенный паттерн экспрессии (Sun et al., 2008) и не один не экспрессируется в развивающихся лицевых структурах. Гены prdm4, 10 и 15 также являются членами этого семейства и в большинстве своем экспрессируются повсеметно у рыбок данио (Fumasoni et al., 2007; Sun et al., 2008).

Подсемейство, которое содержит prdm3, 5 и 16 обладает некоторым сходством в экспрессии, но обладет также и некоторыми отличиями. Наши результаты показали, что экспрессия prdm3 и prdm16 у рыбок данио частично перекрывается, экспрессируясь в заднем мозге, телэнцефалоне, фарингеальных дугах, зачатках грудных плавников и нейрокраниуме. Только prdm16 экспрессируется в обонятельной плакоде. В зачатках плавников экспрессия prdm3 слабаяна ст. 30 hpf, тогда как prdm16 уже экспрессируется на высоком уровне на ст. 30 hpf, указываятем самым, что экспрессия prdm16 начинается раньше, чем prdm3 в этом домене. И prdm3 и prdm16 экспрессируются в пронефрических ппротоках, а prdm16 экспрессируется также в обонятельных плакодах (Fig. 1 and data not shown). Сходства и различия в экспрессии prdm3 и prdm16 указывает, что они могут функционально перекрываться в доменах, где экспрессируются оба, напр., в развивающемся головном мозге, фарингеальных дугах и зачатках грудных плавников, но выполняют независимые функции в др. доменах. Внутри одного и того же кластера экспрессия prdm5 специфически локализуется в фарингеальных дугах и нейрокраниуме. Meani et al. (2009) продемонстрировали, что prdm5 повсеместно экспрессируется во время стадий дробления с наивысшими уровнями экспрессии в ЦНС во время сомитогеназа и в целом на более низких уровнях в остальной части эмбриона. Наши результаты подтверждают, что имеется определенная функциональная перекрываемость между prdm паралогами, но что существует и определенная дивергенция в генной экспрессии и функции внутри семейства генов prdm.

Redundant roles of PRDM family members in zebrafish craniofacial developmentHai-Lei Ding, David E. Clouthier, Kristin B. Artinger Developmental Dynamics Volume 242, Issue 1, pages 67–79, January 2013

Redundant roles of PRDM family members in zebrafish craniofacial development
Hai-Lei Ding, David E. Clouthier, Kristin B. Artinger
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 1, pages 67–79, January 2013