Setting boundaries

Воспроизводимая форма и пространственная организация органов зависит от существования детерминистических правил, управляющих сборкой сложных биологических структур. Форма органа зависит от клеточной архитектуры, которая поддерживается цитоскелетными сетями. Образование определенных и геометрически контролируемых внутриклеточных структур базируется на свойствах самоорганизации цитоскелета. Вклад самоорганизации в клеточную биологию огромен и хорошо документирован [1]. Самоорганизация цитоскелета это процесс, в котором потребление (как говорят физики dissipation) энергии выводит цитоскелет прочь из термодинамического равновесия (т.e., из беспорядочной смеси филамент со слабой динамикой) в направлении определенного воспроизводимого устойчивого состояния. Это отличается от процесса самосборки, при котором компоненты сборки спонтанно - без внешнего источника энергии - формируют структуру, соответствующую термодинамическому равновесию. В зависимости от правил, регулирующих взаимодействие цитоскелетных компонентов, сложные структуры могут самоорганизовываться надежным способом.

Самоорганизация цитоскелета частично регулируется за счет действия белков, модулирующих биохимические правила роста и взаимодействий филамент. Комбинация простых биохимических правил может приводить к формированию сложных структур [2]. Крепкие паттерны могут возникать из ориентированных смещений цитоскелетных филамент с помощью молекулярных моторов в отсутствии внешнего наведения^3-5. Однако эти автономные самоорганизующиеся процессы чрезвычайно чувствительны к присутствию autonomous self-organization processes are extremely sensitive to the presence of spatial boundary conditions (SBCs). SBC является внешним геометрическим сигналом внутри или по периферии сети, который может локально вызывать самоорганизацию сети. Для тканей SBC может быть границей с внешней жидкостью или контактировать с костью, мышцей или др. органом. Для клетки SBC может быть соседней клеткой или extracellular matrix (ECM). Для внутриклеточных цитоскелетных сетей SBC может быть клеточной адгезией для актиновой сети, центросомой для сети microtubule (MT) или границей, такой как плазматическая мембрана или внутриклеточная органелла.

Как SBC могут управлять автономным процессом самоорганизации? Мы опишем недавние успехи в понимании роли SBCs в самоорганизации актиновых сетей и MT построений, как эти процессы интегрированы во внутреннюю организацию клетки и как это, в свою очередь, влияет на архитектуру ткани. В формировании цитоскелетных сетей SBC могут обнаруживать склонность к диффузии и тем самым к процессам сборки ([6] and references therein).

Actin network self-organization

Актин является асимметричным белком, который может само-собираться, чтобы сформировать поляризованные актиновые филаменты [7]. Этот спонтанный процесс может быть ускорен или регулироваться во времени с помощью энергии, высвобождаемой из соотв. фосфатной группы из нуклеотида трифосфата, связанного с актином [8]. Актиновые филаменты могут взаимодействовать, чтобы формировать актиновые сети. Актиновые сети могут самоорганизовываться в некоторые типы структур в клетках: пучки представлены выравненными длинными филаментами и сетчатыми структурами, состоящими из разветвленных и перемешанных коротких филамент. Пучки и сетчатые структуры формируют такой комплекс замысловатых сетей в клетках [9] , для которых трудно идентифицировать принципы их самоорганизации.

Биохимики разработали альтернативные методы для анализа самоорганизации в контролируемых условиях in vitro путем смешивания в определенных пропорциях индивидуальных компонентов (или очищенных из тканей или из рекомбинантных бактерий или дрожжей). Кинетические параметры полимеризации актина, измеренные in vitro, и как эти параметры варьируют в ответ на присутствие ассоциирующих с актином белков, предоставляют ключевую информацию о регуляции динамики сборки актина [10]. Однако правила, ведущие к пространственной организации сети могут быть идентифицированы только при использовании контролируемых геометрических пограничных условий.

Symmetry break

Механические ограничения в актиновой сети могут вызывать разрыв симметрии (т.e., внезапное возникновение сингулярной оси в изотропных условиях, при которых все направления прежде были эквивалентными). Такое пристрастие к нарушению симметрии в актиновых сетях было выявлено с использованием сферических бусинок, покрытых факторами нуклеации актина в качестве простых SBC^11,12. Нуклеация актина индуцируется бусинкой и присутствием capping белков, которые блокируют элонгацию филамент на их быстро растущем конце, гарантируют, что актиновые филаменты будут короткими и будут формировать плотные разветвленные сетевые структуры. Поскольку актиновые филаменты растут по поверхности бусины, материал накапливается и стресс возрастает в сети до критического значения, вызывающего её разрыв [13]. разрыв создает асимметрию в давлении, прикладываемом к бусинке так что бусинка смещается (Figure 1a). Повторение этой последовательности событий вызывает скачкообразное продвижение вперед бусинки^14,15.

Figure 1. Actin network self-organization. (a) Actin meshwork polymerization around beads leads to symmetry breaking, meshwork rupture, and bead propulsion. (b) Bead size regulates the period and size of meshwork rupture. (c) Bead asymmetry orients meshwork growth. (d) Bar length affects network coherence. (e) Long filaments self-align to form bundles, which become oriented along the long axis of the container. (f) Inward flow of filaments nucleated at the vesicle periphery leads to the formation of a ring, the size of which is in proportion with the vesicle diameter. (g) Filament nucleation and growth of micropatterned branched meshworks. The filament interaction angle modulates the probability of association in either parallel (blue filaments) or antiparallel (red filaments) configurations. (h) Myosins induce the specific contraction and disassembly of antiparallel bundles and branched meshworks while leaving parallel bundles unaffected. (i) Asymmetric distribution of the ratio between branched and antiparallel networks leads to asymmetric contraction.

В этой экспериментальной системе можно легко манипулировать с SBC путем изменения её размерных параметров. Напр., более крупные бусинки, меньший изгиб поверхности бусинки, приводят к увеличению критических значений толщины сети пред разрывом^16,17 и периодичности скачкообразных толчков (Figure 1b). Асимметричность SBC может быть создана с использование эллиптических бусинок. Различия в изгибе поверхности бусинок обнаруживают склонность к локализации разрыва сети, которые преимущественно осуществляются в соответствии с ходом или ортогонально по отношению длинной оси бусинки [18] (Figure 1c). Более высокие соотношения длины к ширине получаются при нуклеации актина на небольших стеклянных палочках, это ещё больше увеличивает пространственный скос, а разветвленность роста сети ограничивается существующей ортогональностью к длинной оси палочки [15]. По мере увеличения длины палочки могут сформироваться несколько независимых сетей, указывая на существование критической длины для взаимных соединений подсетей (Figure 1d). Интересно, что симметрия разрыва и асимметрия продукции сил не ограничивается разветвленными сетевыми структурами актина, но может быть также индуцирована за счет образования пучков и укладки индивидуальных филамент, полимеризующихся на поверхности бусин[19].

Filament alignment

Некоторые процессы самоорганизации могут индуцировать выстраивание актиновых филамент в ответ на SBC. Филаменты могут становиться упорядоченными за счет стерических взаимодействий. Когда две длинные филаменты приходят в соприкосновение, то они предупреждают проникновение коротких филамент между ними. Длинные филаменты затем понуждают располагаться за счет стерических взаимодействий короткие филаменты вокруг себя. Стерические взаимодействия между пучкам из длинных филамент затем осуществляют свою ориентацию вдоль длинной оси объема, которым они ограничены [20] (Figure 1e). Стерические взаимодействия филамент свободно перемещаются по слою молекулярных моторов, могут также вызывать свое расположение вдоль др. др.[4] и вдоль SBC [21]. Филаменты оказываются расположенными за счет натяжения мембраны. Две филаменты подталкиваются ортогонально, чтобы могли соединиться со способной к деформации мембраной и располагаться так, чтобы снизить эластическую энергию мембраны [22]. Предварительно собранные филаменты могут становиться расположенными путем определения позиции прикрепления в регулярные построения из кусочков или micropillars и добавления filamin к поперечно связанным филаментам^23,24.

Филаменты могут оказаться уложенными в параллельные или антипараллельные конфигурации за счет контроля ориентации своего роста. Формирование поверхностного микропаттерна может быть использовано, чтобы в точности манипулировать с геометрическими пограничными условиями роста и ориентации филамент [25]. Избирательная адсорбция факторов, способствующих нуклеации актина, на регионах формирования микропаттернов индуцирует локальное образование разветвленных сетевых структур. Лишь не разветвленные филаменты вырастают наружу из микропаттерна, при этом своими колючими концами всегда ориентированы наружу. Сила стерических взаимодействий растущих филамент необходима для расположения их параллельно др. др., ортогонально региону нуклеации (Figure 1g). Вдали от региона нуклеации две филаменты, растущие относительно др. др. почти в противоположных направлениях, стремятся сформировать антипараллельны пучки; тогда как две филаменты, растущие в направлении др. др., но под косым углом стремятся сформировать параллельный пучок (Figure 1g). Однако, эти тенденции могут обнаруживать смещения, поскольку соседние филаменты стерически влияют др. на др. Изменение ориентации филамент во время образования пучков заставляют соседние филаменты также выстраиваться параллельно пучкам (Figure 1g). Формирование пучков является т.о., комбинацией локальных вероятностных событий, управляемых за счет гибкости филамент и распространения конфигурации расположения на соседние филаменты за счет стерических взаимодействий [25].

В экстрактах яиц биохимические условия менее определённы, но близки к внутриклеточным условиям. Энкапсуляция яйцевых экстрактов в мембранных пузырьках показывает, что филаменты, возникшие на периферии перемещаются внутрь и выстраиваются, чтобы сформировать центральное кольцо. Интересно, что кольцо может сформироваться только, когда нуклеация ограничена периферией пузырька и не распределяется случайно по всему объему. Закон подобия, по-видимому, регулирует размер кольца в пропорции с диаметром пузырька [26] (Figure 1f).

Network contraction

Миозины являются ориентированными моторами, перемещающимися в направлении определенного конца актиновых филамент. Т.о., они обладают специфическими действиями в заисимости от архитектуры актиновой сети. Они путешествуют вдоль параллельных филамент, тогда как они скользят вдоль антипараллельных филамент в противоположных направлениях относительно относительно др. др. и тем самым сокращают сеть [27] (Figure 1i). Миозины могут также индуцировать контракции разветвленной сетевой структуры, поскольку эти сети также содержат антипараллельные филаменты. Однако, скорость контракции снижена из-за противостояния, связанного с веточками и прикреплениями сети к регионам нуклеации [27]. Было показано, что актомиозиновые пучки, связанные с бусинками, имеют скорость контракции, пропорциональную длине пучков [28]. В более сложных структурах, представленных разными типами сетей, скорость контракции предопределяется локальной пропорцией параллельных и антипараллельных пучков и разветвленных сетевых структур [27]. Изменчивость этих пропорций в данной архитектуре будет вызывать анизотропные контракции, хотя миозины присутствуют во всей сети (Figure 1i). Следовательно, SBC может предопределять тип архитектуры сети, который с свою очередь может определять её паттерн контракций.

MT network self-organization

Подобно образованию актиновых филамент в результате самосборки из актиновых мономеров, тубулины формируют асимметричные димеры, которые могут сами собираться в MTs. Однако, высвобождение связанного с тубулином нуклеотид трифосфата необходимо для ускорения процесса [29]. По сравнению с актиновыми филаментами, MTs более ригидные и почти прямые в измерениях одиночной клетки. MTs могут выдерживать более высокие сдавливающие силы, чем актиновые филаменты. Они могут формировать пучки, но они не могут формировать разветвленные сети. MTs не столь многочисленны как актиновые филаменты в клеточном цитоскелете. Рост MT характеризуется более продолжительной фазой роста в противовес короткому периоду быстрого укорочения. 'Плюс-конец' у MT значительно более динамичен, чем 'минус-конец', который может быть закреплен на MT-organizing center (MTOC). В большинстве клеток животных MT сеть формируется как звездочка, из которой исходят MTs из MTOC. Когда клетки делятся, то MTOC дуплицируется и сеть формирует бипоялрное веретено.

Centering

Наиболее прямой путь исследования позиционирования MT звездочки в ответ на SBC это очистка MTOCs из клеток и помещение их в камеры в виде микроформ определенных размеров [30]. В этом случае границы камеры могут служить в качестве внешних SBC. Т.к. плюс-концы MT растут и наталкиваются на края прямоугольной камеры, то MTs становятся предметом компрессионных сил, которые толкают звездочку в направлении геометрического центра камеры [30] (Figure 2a). Если флюктуации приводят к тому, что MTOC оказывается вне центра в определенном направлении, то искривление и давление MT увеличивается в том направлении и толкает MTOC обратно в центр. Т.о., изотропные построения MTs наталкиваются на периферические барьеры и оказываются достаточными для поддержания звездочки в центре объема, в который они заключены. Однако, скольжение MTs вдоль периферии может влиять на стабильность этого механизма центрирования путем переориентировки MTs. В таких условиях, как толкающие, так и тянущие силы с помощью нацеленных на минус концы моторов, закрепленных на периферии, необходимы для гарантии эффективной стабилизации MT звездочки в геометрическом центре SBC [31] (Figure 2a).

Figure 2. Microtubule (MT) network self-organization. (a) Aster off-centering with short MTs in a large container (left). Aster centering by MT sliding and pushing on the container corners (middle). Highly efficient aster centering by pushing and pulling forces (right). (b) MT length-dependent aster formation and centering. Short MT 'plus-end' coalescence by motors (left). Aster centering by a few MT 'minus-ends' reaching and pushing on container edges (middle). Aster fragmentation and vortex formation by pushing forces exerted by long MTs on container edges (right). (c) MT length-dependent aster off-centering. Aster centering by few MT plus-ends reaching and pushing on container edges (left). Symmetry break and aster off-centering by a few, sliding MTs pushing on container edges (middle). Cortical alignment of MTs and peripheral localization of MT-organizing center (MTOC) due to numerous MTs sliding and pushing on container edges (right). (d) DNA cluster size regulates spindle size and pole formation. (e) DNA cluster asymmetry regulates spindle orientation. (f) DNA cluster width regulates spindle symmetry.

Напротив, звездочки с противоположной полярностью (т.e., с MT плюс-концами в центре звездочки) не могут принимать такое же устойчивое состояние. Пока MTs, контактирующие с периферией достаточно короткие, чтобы высвободить свою эластическую энергию путем выпрямления, они мягко толкают звездочку к центру. Как только они становятся длиннее, то компрессионные силы в изогнутых MTs возрастают. Образование кластеров из динамичных плюс-концов с помощью kinesins в центре звездочки недостаточно сильное, чтобы противостоять этим силам, так что звездочка фрагментируется. MT сеть затем переключается на чрезвычайно крепкие завиток-образные структуры [32] (Figure 2b).

Symmetry break

Когда звездочка, заловленная в водную каплю, энкапсулируется в масле, то MTs не могут закрепиться на периферии. Сферический раздел вода-масло обладает минимальной тангенциальной резистентностью и является эффективным SBC, вдоль которого MT могут легко скользить. В этих условиях могут появиться симметричные разрывы в конфигурации звездочки [33] (Figure 2c).В относительно крупном сферическом объеме немногие MTs достигают границы и звездочка стабилизируется вблизи геометрического центра. Когда размер сферического объема уменьшается, то, MTs стремятся стать длиннее, чем радиус контейнера. Чтобы минимизировать из изгиб и ослабить их эластическую энергию , MTs скользя вдоль краев и выстраиваются в линию с SBC^33,34. Это продуцирует асимметричное перераспределение MTs, которые толкают MTOC к периферии капли [33] (Figure 2c). Интересно, что когда ригидность SBC снижена, что собранные в пучок MTs толкают и деформируют его в такой степени, что могут сформироваться тубулярные выпячивания^{33, 35,36}.

Воспроизводимая форма и пространственная организация органов зависит от существования детерминистических правли, управляющих сборкой сложных биологических структур. Форма органа зависит от клеточной архитектуры, которая поддерживаетя цитоскелетными сетями. Образование определенных и геометрически контролируемых внутриклеточных структур базируется на свойствах самоорганизации цитоскелета. Вклад самоорганизации в клеточную биологию огроме и хорошо документирован [1]. Самоорганизация цитоскелета это процесс в котором потребление (как говорят физики dissipation) энергии выводит цитоскелет прочь из термодинамического равновесия (т.e., из беспорядоченной смеси филамент со слабой динамикой) в направлении определенного воспроизводимого устойчивого состояния. Это отличается от процесса самосборки, при котором компоненты сборки спонтанно - без внешнего истояника энергии - формируют структуру, соответствующую термодинамическому равновесию. В зависимости от правил, регулирующих взаимодействие цитоскелетных компонентов, сложные структуры могут самоорганизовываться надежным способом.

Самоорганизация цитоскелета частично регулируется за счет действия белков, модулирующх биохимические правила роста и взаимодействий филамент. Комбинация простых биохимических правил может приводить к формированию сложных структур [2]. Крепкие паттерны могут возникать из ориентированных смещений цитоскелетных филамент с помощью молекулярных моторов в отсутствии внешнего наведения^3-5. Однако эти автономные саморганизующиеся процессы чрезвычайно чувствительны к присутствию autonomous self-organization processes are extremely sensitive to the presence of spatial boundary conditions (SBCs). SBC является внешним геометрическим сигналом внутри или по периферии сети, который может локально вызывать саморганизацию сети. Для тканей SBC может быть границей с внешней жидкостью или контактивровать с костью, мышцей или др. органом. Для клетки SBC может быть соседней клеткой или extracellular matrix (ECM). Для внутриклеточных цитоскелетных сетей SBC может быть клеточной адгезией для актиновой сети, центросомой для сети microtubule (MT) или границей, такой как плазматическая мембрана или внутриклеточная органелла.

Actin network self-organization

Актин является асимметричным белокм, который может самособираться, чтобы сформировать поляризованнрые актиновые филаменты [7]. Этот спонтанный процесс может быть ускорен или регулироваться во времени с помощью энергии, высвобождаемой из соотв. фосфатной группы из нуклеотида трифосфата, связанного с актином [8]. Активновые филаменты могут взаимодействовать, чтобы формировать актиновые сети. Актиновые сети могут самоорганизовываться в некоторые типы структур в клетках: пучки представлены выравненными длинными филаментами и сетчатыми структурами, состоящими из разветвленных и перемешанных коротких филамент. Пучки и сетчатые структуры формируют такой комплекс замысловатых сетей в клетках [9] , для которых трудно идентифицировать принципы их самоорганизации.

Symmetry break

Механические ограничения в актиновой сети могут вызывать разрыв симметрии (т.e., внезапное возникновение сингулярной оси в изотропных условиях, при которых все направления прежде были эквивалентными). Такое пристратие к нарушению симметрии в актиновых сетях было выявлено с использованием сферических бусинок, покрытых факторами нуклеации актина в качестве прострых SBC^11,12. Нуклеация актина индуцируется бусинкой и присутствием capping белков, которые блокируют элонгацию филамент на их быстро растущем конце, гарантируют, что актиновые филаменты будут короткими и будут формирвоать плотные разветвленные сетевые структуры. Поскольку актиновые филаменты растут по поверхности бусины, материал накапливается и стресс возрастает в сети до критического значения, вызывающего её разрыв [13]. разрыв создает асимметрию в давлении, прикладываемом к бусинке так что бусинка смещается (Figure 1a). Повторение этой последовательности событий вызывает скачкообразние прдвижение вперед бусинки^14,15.

В этой экспериментальной системе можно легкло манипулировать с SBC путем изменения её размерных параметров. Напр., более крупные бусинки, меньший изгиб поверхности бусинки, приводят к увеличению критических значений толщины сети пред разрывом^16,17 и периодичности скачкообразных толчков (Figure 1b). Асимметричность SBC может быть создана с использование эллиптических бусинок. Различия в изгибе поверхности бусинок обнаруживают склонность к локализации разрыва сети, которые преимущественно осуществляются в соответствии с ходом или ортогонально по отношению длинной оси бусинки [18] (Figure 1c). Более высокие соотношения длины к ширине получаются при нуклеации актина на небольших стеклянных палочках, это ещё больше увеличивает пространственный скос, а разветвленность роста сети ограничивается существующей ортогональностью к длинной оси палочки [15]. По мере увеличения длины палочки могут сформироваться несколько независимых сетей, указывая на существование критической длины для взаимных соединений подсетей (Figure 1d). Интерсно, что симметрия разрыва и асимметрия продукции сил не ограничивается разветвленными сетевыми структурами актина, но может быть также индуцирована за счет образования пучков и укладки индивидуальных филамент, полимеризующихся на поверхности бусин[19].

Filament alignment

Некоторые процессы самоорганизации могут индуцировать выстраивание актиновых филамент в ответ на SBC. Филаменты могут становитться упорядоченными за счет стерических взаимодействий. Когда две длинные филаменты приходят в соприкосновение, то они предупреждают проникновение короких филамент между ними. Длинные филаменты затем понуждают располагаться за счет стерических взаимодействий короткие филаменты вокруг себя. Стерические взаимодействия между пучкам из длинных филамент затем осуществляют свою ориентацию вдоль длинной оси объема, которым они ограничены [20] (Figure 1e). Стерические взаимодействия филамент свободно перемещаются по слою молекулярных моторов, могут также вызывать свое расположение вдоль др. др.[4] и вдоль SBC [21]. Филаменты оказываются расположенными за счет натяжения мембраны. Две филаменты подталкиваются ортогонально, чтобы могли соединиться со способная к деформации мембранй и располагаться так, чтобы снизить эластическую энергию мембраны [22]. Предварительно собранные филаменты могут становиться расположенными путем определения позиции прикрепления в регулятрные построения из кусочков или micropillars и добавления filamin к поперечно связанным филаментам^23,24.

Филаменты могут оказаться уложенными в параллельные или антипараллельные конфигурации за счет контроля ориентации своего роста. Формирование поверхностного микропаттерна может быть использовано, чтобы в точности манипулировать с геометрическими пограничными условиями роста и ориентации филамент [25]. Избирательная адсорбция факторов, способствующих нуклеации актина, на регионах формирования микропаттернов индуцирует локальное образование разветвленных сетевых структур. Лишь не разветвленные филаменты выростают наружу из микропаттерна, при этом своими колючими концами всегда ориентированы наружу. Сила стерических взаимодействий растущих филамент необходима для расположения их параллельно др. др., ортогонально региону нуклеации (Figure 1g). Вдали от региона нуклеации две филаменты, растущие относительно др. др. почти в противопложных направлениях, стремятся сформировать антипараллельны пучки; тогда как две филаменты, растущие в направлении др. др., но под косым углом стремятся сформировать параллельный пучок (Figure 1g). Однако, эти тенденции могут обнаруживать смещения, поскольку соседние филаменты стерически влияют др. на др. Изменение ориентации филамент во время образования пучков заставлеют соседние филаменты также выстраиваться параллельно пучкам (Figure 1g). Формирование пучков является т.о., комбинацией локальных вероятностных событий, управляемых за счет гибкости филамент и распространения конфигурации расположения на соседниме филаменты за счет стерических взаимодействий [25].

В экстратах яиц биохимические условия менен определны, но близки к внутриклеточным условиям. Энкапсуляция яйцевых экстрактов в мембранных пузырьках показывает, что филаменты, возникшие на периферии перемещаются внутрь и выстраиваются, чтобы сформировать центральное кольцо. Интерсно, что кольцо может сформироваться только, когда нуклеация ограничена периферией пузырька и не распределяется случайно по всему объему. Закон подобия, по-видимому, регулирует размер кольца в пропорции с диаметром пузырька [26] (Figure 1f).

Network contraction

Мсиозины являются ориентированными моторами, перемещающимися в направлении определенного конца актиновых филамент. Т.о., они обладают специфическими действиями в заисимости от архитектуры актиновой сети. Они путешествуют вдоль параллельных филамент, тогда как они скользят вдоль антипараллельных филамент в противоположных направлениях относительно относительно др. др. и тем самым сокращают сеть [27] (Figure 1i). Миозины могут также индуцировать контракции разветвленной сетевой структуры, поскольку эти сети также содержаи антипараллельные филаменты. Однако, скорость контракции снижена из-за противостояния, связанного с веточками и прекрепляениями сети к регионам нуклеации [27]. Было показано, что актомиозиновые пучки, связанные с бусинками, имеют скорость контракци, пропорциональную длине пучков [28]. В более сложных структурах, представленных разными типами сетей, скорость контракции предопределяется локальной пропорцией параллельных и антипараллельных пучков и разветвленных сетевых структур [27]. Изменчивость этих пропорций в данной архитектуре будет вызывать анизотропные контракции, хотя миозины присутствуют во всей сети (Figure 1i). Следовательно, SBC может предопределять тип архитектуры сети, который с свою очередь может определять её паттерн контракций.

MT network self-organization

Подобно образованию актиновых филамент в результате самосборки из актиновых мономеров, тубулины формируют асимметричные димеры, которые могут самособираться в MTs. Однако, высвобождение связанного с тубулином нуклеотид трифосфата необходимо для ускорения процесса [29]. По сравнению с актиновыми филаментами, MTs более ригидны и почти прямые в измерениях одиночной клетки. MTs могут выдерживать более высокие сдавливающие силы, чем актиновые филаменты. Они могут формировать пучки, но они не могут формировать разветвленные сети. MTs не столь многочисленны как актиновые филаменты в клеточном цитоскелете. Рост MT характеризуется более продолжительной фазой роста в противовес короткому периоду быстрого укорочения. 'Плюс-конец' у MT значительно более динамичен, чем 'минус-конец', который может быть закреплен на MT-organizing center (MTOC). В большинстве клеток животных MT сеть формируется как звездочка, из которой исходят MTs из MTOC. Когда клетки делятся, то MTOC дуплицируется и сеть формирует бипоялрное веретено.

Centering

Наиболее прямой путь исследования позиционирования MT звездочки в ответ на SBC это очистка MTOCs из клеток и помещение их в камеры в виде микроформ определенных размеров [30]. В этом случае границы камеры могут служить в качестве внешних SBC. Т.к.плюс-концы MT растут и наталкиваются на края прямоугольной камеры, то MTs становятся предметом комрессионных сил, которые толкают звездочку в направлении геометрического центра камеры [30] (Figure 2a). Если флюктуации приводят к тому, что MTOC оказывается вне центра в определенном направлении, то искривление и давление MT увеличивается в том направлении и толкает MTOC обратно в центр. Т.о., изотропные построения MTs наталкиваются на периферические барьеры и оказываются достаточными для поддержания звездочки в центре объема, в которы они заключены. Однако, скольжение MTs вдоль периферии может влиять на стабильность этого механизма центрирования путем переориентировки MTs. В таких условиях, как толкающие, так и тянущие силы с помощью нацеленных на минус концы моторов, закрепленных на периферии, необходимы для гарантии эффективной стабилизации MT звездочки в геометрическом центре SBC [31] (Figure 2a).

Напротив, звездочки с противопложной полярностью (т.e., с MT плюс-концами в центре звездочки) не могут принимать такое же устойчивое состояние. Пока MTs, контактирующие с периферией достаточно короткие, чтобы высвободить свою эластическую энергию путем выпрямления, они мягко толкают звездочку к центру. Как только они становятся длиннее, то компрессионные силы в изогнутых MTs возрастают. Образование кластеров из динамичных плюс-концов с помощью kinesins в центре звездочки недостатоноч сильное, чтобы противостоять этим силам, так что звездочка фрагментируется. MT сеть затем перключается на чрезвычайно крепкие завиток-образные структуры [32] (Figure 2b).

Symmetry break

Alignment and spindle formation

Образование биполярных митотических веретен также зависит от геометрических пограничных условий, определяемых с помощью ДНК и клеточной формы. Два механизма вносят вклад в сборку митотического веретена вблизи ДНК : фокусирование минус-концов MTs, которые ассоциируют с крупными кластерами ДНК , чтобы сформировать полюса веретена, и антипараллельное расположение плюс-концов MTs, которые закреплены на двух MTOCs, так что звездочки из MTs перекрываются [37].

Мультимерные на минус-концы направленные моторы, такие как dyneins, индуцируют образование полючов веретена. ДНК предоставляет сигналы наведения для первоначальноего расположения MT и т.о., склоняет к образованию биполярного веретена^38,39. MTs стремятся расположиться параллельно к поверхности бусинки, покрытой ДНК. Прирожденный молекулярный аппарат, поддерживающий фокусировку полюсов веретена и пространственнную организацию митотического веретена, является сильным и первночально кажется нечувствительным к конфигурации ДНК комплекса [40]. Однако, пространные манипуляции с количеством ДНК и её пространственным расположением, с использованием принтинга микроконтактов, выявило направляющую роль ДНК в сборке веретена [41]. Увеличение размера агрегатов ДНК вызывают удлинение веретена (Figure 2d). Выше критического размера, крупные агрегаты ДНК могут индуцировать образование множественных веретен [41] (Figure 2d). Умеренного асимметричного распределения ДНК достаточно, чтобы ориентировать формирование веретена^40,41 (Figure 2e). Длинные кусочки, покрытые ДНК приводят к образованию множественных повторов из веретен вдоль всей длины бруска и тем самым подтверждают существование внутренне присущей толщины веретена (Figure 2f). Эта прирожденная толщина веретена, по-видимому, определяется балансом между моторами, понуждающими к фокусированию MT концы, и эластической реакивной силой, обусловленной изгибом MT. В определенном диапазоне параметров, определяемых соотношением между толщиной агрегируемой ДНК и длиной MT, симметричность нарушается и все MTs спадаются на одной стороне ДНК, приводя в результате к асимметричной конфигурации веретена в отношении длинной оси бруска [41] (Figure 2f). Ниже этого критического диапазона антипараллельные MTs от противоположных полюсов (with the bar in between) взаимодействуют, чтобы стабилизировать образование симметичного биполярного веретена; выше этого диапазона две конфигурации веретена на противоположных сторонах бруска ДНК оказываются независимыми и обе формируют независимые монополярные веретена.

Cellular self-organization

В клетках организующие принципы, описаные выше, приложимы, но более трудны для выявления и исследования. Как актиновая, так и MT сети регулируются сотнями разных типов связывающих белков. Кроме того, сборка актиновых филамент и MTs влияют др. на др. посредством физических и биохимических взаимодействий. Сборка цитоскелетной сети регулируется на клеточной шкале и не зависит более от локальных биохимических и геометрических условий. Воздействие биохимических сигналов заставляет систему нарушать симметрию и определять ось полярности. Хотя сборка актиновой и MT сети более сложна в клеточном контексте, чем in vitro, некоторые самоорганизующие принцыпы выявляются.

В простейших условиях могут быть достигнуты почти клеточные условия в экспериментах in vitro, сходные самоорганизующиеся структуры. Цитоскелетные сети в клетках из лимфатических линий или др. клетках или клеточных фрагментах на неадгезивном субстрате не ограничиваются др. геометрическими ограничениями, чем плазматическая мембрана. В отсутствие MT сетей, актиновая сеть контрактирует и нарушает симметрию после появления локального разрыва в сети. С разрывом симметрии избыточно сократившийся регион распространяется по сети^42-44. Процесс разрыва сходен с тем, что происходит в разветвленной сетчатой структуре вокруг бусинки [12], за исключением появления разрыва в результате контрактильных сил, генерируемых миозинами скорее, чем толкающими силами, связанными с полимеризацией актина. В отсутствие актиновых сетей, MTs, толкающие способную к деформации мембрану, соединяются, выстраиваются и нарушают симметрию путем формирования длинных трубчатых выпячиваний^42,43, напоминая такое их поведение в пузырьках^33,35,36. Однако в условиях клетки актиновые и MT сети взаимодействуют, а SBCs более сложны, представлены свободно флюктуирующей плазматической мембраной. ECM и клетки соседи могут представлять собой SBCs. Следовательно, точный контроль и манипуляции с клеточными адгезивными соединениями, которые являются клеточными структурами, которые взаимодействуют с клеточным структурными микроокружением, показывают, как эти SBCs могут управлять внутренне присущими свойствами самоорганизации цитоскелета.

Directed shape

Распространение клеток по определенному регулярному массиву адгезивных точек показывает, что размер и пространство между точками являются критическими регуляторами клеточной формы. Клетки, нуждающиеся с минимальном размере точек, чтобы собирать фокальные адгезии, не могут распространяться на максимальные дистанции между этими точками^45-48. Форма клеток, по-видимому, является результатом конкуренции между силами адгезией индуцируемого распластывания и реакционными силами клеточной эластичности др. внутренними сжимающими силами [49]. Однако некоторые клетки, такие как фибробласты, обладают прирожденным механизмом регулировать длину свой длинной оси независимо от их толщины, это, по-видимому, приложимо к тесному взаимодействия между актиновой и MT сетью^50,51.

Хотя элонгация клеточной формы, расположение цитоскелета и внутренняя клеточная полярность обычно скоррелированы, клеточная форма не детерминирует организацию актина и MT. Модификация актиновой сети с помощью тока жидкости, при этом сохраняла постоянной форму переориентированной MT сети [52]. Сходным образом, модификация MT сети независимо от клеточной формы переориентировала актиновую сеть [53]. Скорее всего имеется прирожденная связь между актиновой и MT сетями, которая затрагивает их соответ. пространственную организацию иполярность клеточной оси.

Directed actin network architecture

Клеточная актиновая сеть организована с помощью баланса между ансамблем контрактильной сети из упорядоченных филамент и полимеризацией неконтрактильной разветвленной сетевой структуры. Этот баланс, по-видимому, тонко регулируется степенью клеточной адгезии [54].

Разветвленные сетевые структуры собираются на периферии клетки. Они преимущественно собираются вдоль выпуклого скорее, чем вогнутого края клетки [55]; т.о., они способствуют формированию крупных деформаций мембраны на верхушке клетки [56] (Figure 3a), размер которых увеличивается, когда угол верхушки уменьшается [57].

Figure 3. Cellular self-organization. (a) Branched meshwork polymerization in acute-angled regions of the cell periphery. (b) Inward treadmilling (arrows) in peripheral actin bundles and absence of treadmilling of internal bundles may reveal differences in filament polarities. (c) Alignment of myofibrils in response to cell shape elongation. (d) Formation of conspicuous actin bundles along non-adhesive edges and thin actin bundles along adhesive edges. (e) Longer peripheral bundles are also thicker. (f) Microtubules (MTs) adapt their growth to local actin structures. The centrosome maintains its central position in symmetric (left) and asymmetric environments (right). (g) Centrosome positioned above the nucleus, close to branched actin meshwork, in spatially confined cells (top). Centrosome positioned below the nucleus, close to actin bundles, in spread cells (bottom). (h) Cells move toward confined spaces above a certain threshold (top) and toward open spaces below that threshold (bottom). (i) Spread cells move with the centrosome toward the front (top), whereas confined cells move with the centrosome toward the back (bottom).

Контрактильные пучки антипараллельных филамент присутсвуют по всей цитоплазме, Периферические пучки и более внутренние пучки имеют разную динамику и контрактильные свойства. Компоненты периферических пучков движутся в направлении центра пучка, тогда как компоненты внутренних пучков остаются статичными в отношении организаци пучков [58] (Figure 3b). Это, по-видимому, составляет ключевой отличие в полярности филамент и тем самым в специфических контрактильных совойствах этих двух типов пучков. По мере распластывания клетки или увеличения коэффициента формы клетки контракция клетки увеличивается^59-61. Увеличение коэффициента формы клетки вызывает выстраивание контрактильных пучков, которые формируют структуры, такие как стрессовые волокан или миофибриллы (Figure 3c). Выровненные стрессовые волокна и ассоциированные анизотропные контракции вдоль клеточной базальной поверхности связаны со сборкой сходных структур и распределением сил вдоль клеточной апикальной поверхности^62,63. Выровненные по одной оси миофибриллы обнаруживают тендецию организовывать свои паттерны исчерченности периодически (in register) [64].

Асимметричные SBCs, определяемые в культуре клеток по микропаттерну сайтов адгезии, могут приводит к развитию асимметричных актиновых сетей. Пучки накапливаются преимущественно вдоль вогнутого скорее, чем выпуклого края клетки [65]. По мере распластывания клетки поверх адгезивной области формируются бросающиеся в глаза контрактильные пучки, которые соединяют этот регион с др. адгезивными регионами, разделенными с помощью неадгизивных регионов^47,66,67, выявляя образование крупных сил тяги [67] (Figure 3d). Относительно крупные расстояния между местами слипчивости ведут к уменьшению изгиба края и утолщению пучков и тем самы, по-видимому, отражают более крупные силы между этими сайтами^66,68 (Figure 3e).

Directed MT network

MT сеть приспосабливает свою динамику к разным конфигурациям актиновой сети. MTs изгибаются и растут вдоль актиновых контрактильных пучков, но останавливают рост как только достигнут разветвленной актиновой сетевой структуры [69]. Интересно, что хотя асимметричная актиновая сеть д. приводить к асимметричной организации MTs, MTOC остается в своей центральной локализации (Figure 3f). Позиционирование центросом, по-видимому, зависит от генерации сил с помощью dyneins на MTs^70,71, но также от сил, генерируемых с помощью менее охарактеризованных соединений с актомиозиновой сетью^71,72. Позиционирование центросом в центре является даже более удивительным, учитывая, что большая часть цитоплазмы занимается ядром, на которое MTs также могут оказывать толкающие и притягивающие воздействия. Сильный механизм, с помощью которого центросомы оказываются позиционированы в геометрическом центре контура, что предписывает форму клетки, гда актиновая сеть асимметрична, а ядро занимает большую часть объяма цитоплазмы, ещё предстоит выявить.

Расположение ядра в клетке в культуре смещено от центра и дистальнее от структуры клеточной адгезии с ECM и актиновой разветвленной сетевой структуры, но проксимальнее контрактильных пучков [69]. Следовательно, внутренняя полярность, как показывает вектор ядро-центросома, ориентирован в отношении асимметрии ECM и актиновой сети^55,69. Биохимическое нарушение актомиозиновой сети, могут вызывать пертурбации ориентации полярности MT сети или соединений ядро-цитоскелет относительно клетка-ECM SBCs^71,73,75.

Центросома и ядро часто описываются как находящиеся в плоскости распределения клеток в культуре, но они могут быть позиционированы на оси, ортогональной к ней. Более того, их относительные позиции могут быть сдвинуты по этой оси в зависимости от степени заточения, наложенного с помощью доступной области распластывания. В самом деле, центросома, позиционированная в отношении апикальной искривленной поверхности, выше ядра, в иммобилизованных клетках и ниже ядра в клетках, которые активно распространяются [76] (Figure 3g).

Directed migration

Асимметричная организация цитоскелета в ответ на асимметричные SBC может повлиять на направление перемещения клетки. Взаимоотношение между наружной асимметрией и ориентированной подвижностью не является прямолинейным, поскольку оно, по-видимому, зависит от типа клетки и степени асимметрии. Линейные трек повторяющихся микропаттернов в форме равнобедреного треугольника может привести клетки к перемещению в направлении острого угла верхушки такого треугольника^77,78. Напротив, удлиненный равнобедренный треугольник с очень острым углом (всего в несколькоо градусов) может вести клетки прочь от острого угла верхушки [79] (Figure 3h).

Без внешней склонности, такой как та, что создается асимметричным SBC, направление движения ограничивается механизмами внутренней клеточной поляризации и может наблюдаться в подвижных клетках на адгезивных микропоаттернах в форме бруска. Однако толщина бруска влияет на организацию актиновой сети. Вариации в сборке актиновой сети в ответ на толщину бруска являются клеточно-специфичными, поскольку кератиноциты нуждаются в более значительном поперечном распластывании, чтобы двигаться относительно быстро [80], тогда как скорость фибробластов выше, когда толщина бруска уже [81]. Интересно, что ориентация внутренней клеточной полярности, выявленная за счет позиции центросомы в отношении ядра, также зависит от ширины адгезивного микропаттерна. Клетка мигрирует по широкому бруску с центросомой ближе к ведущему краю, тогда как на более узком бруске, центросома ближе к подтягиваемому краю [82] (Figure 3i). Как такое позиционирование центросом связано с разными типами организации актина остается неизвестным.

Скорость миграции клеток и сохранение их в движении в данном направлении нарушаются в клетках, чья внутренняя полярная ориентация нарушена [75]. Методичные соединения между аппаратом актиновой сети усиливает клеточную миграцию и степень стабильности пространственной организации внутренней клеточной полярности, это в дальнешем было подтверждено наблюдением на сотнях разных типов клеток корреляции между скоростью клеток и сохранением клетками своей направленной миграции [83].

Directed cell division

Адаптация архитектуры сети MT к аритектуре актиновой сети и к клеточной форме проявляется во время ктодчного деления. Натяжения в астральных MTs, исходящих из полюсов веретена в направлении клеточного кортекса, вызывают вращательный момент на веретено и управляют его ориентацией. Натяжение этих астральных MTs регулируется присутствием кортикальных сигналов, ассоциированных с актиновой сетью, которая ориентирует ось клеточного деления в отношении клеточных адгезивных сигналов и архитектуры актиновой сети^84-87. Натяжение может также вызываться с помощью цитоплазмы и поэтому д. быть пропорциональным длине астральных MT; различия в длине астральных MT могут отличаться в соответствии с элонгацией клеточной формы и эти вариации могут управлять ориентацией соотв. оси деления^88,89.

Tissue self-organization

На уровне тканевой организации сложность системы увелдичивается с увеличением числа компонент. Несмотря на это, точные манипуляции в геометрией SBCs оказываются пригодными для идентификации соотв. правил самоорганизации.

Directed cell positioning

Самоорганизация клеток в данном пространстве зависит от баланса механических сил между клетками и окружающим матриксом. Две клетки в контакте составляют минимальную многоклеточную структуру, где клетки могут формировать cell-matrix adhesions (CMAs) и cell-cell adhesions (CCAs). Если ограничиться гомогенным микропаттерном (т.e., когда клеточная базальная поверхность контактирует с непрерывным слоем ECM), то эндотелиальные клетки, формирующие CCAs, перемещаются регулярно относительно др. др. в плоскости чашки для культивирования, тогда как фибробласты, которе не могут формировать CCAs, нет [90]. Следовательно, образование CCAs, по-видимому, модулирует способность двух клеток достигать механического баланса. Две адгезивные системы - CCA и CMA - действительно могут влиять на их соотв. расположение [91]. Две клетки данного эпителиального клеточного типа, ограниченные микропаттерном ECM внутри определеной области могут перемещаться и принимать стационарную позицию в ответ на незначительные изменения в геометрии ECM [92] (Figure 4a). В самом деле, продукция сил натяжения на CCA зависит от пространственной организации ECM. Межклеточные силы выше, когда CCA ближе к ECM. Это направляет CCA прочь от ECM и стабилизирует позицию клеток в этой конфигурации, которая соответствует глобальной минимизации общей контрактильной энергии [92] (Figure 4a). Напротив, образование CCA предупреждает формирование проксимальных CMAs^74,93. Взаимное исключение двух адгезивных систем ведет к их простраственному разделению и управляет позиционированием клеток [91].

Figure 4. Tissue self-organization. (a) Two cells move regularly around each other (black arrows) when extracellular matrix (ECM) is present all along the periphery (left), whereas they stop moving when the extremities of their ECM contact plane reach a region without ECM (right). The presence and absence of ECM regulate intra- and intercellular forces in opposite ways. (b) Intercellular forces propagate from the front to the center of a migrating cell group. (c) A large multicellular group on a disk of ECM displays no geometrical bias (left), whereas on a torus, symmetry is broken and cells bias their orientation and move (black arrows) in a coherent fashion (right). (d) Two adherent cells orient their internal polarity away from their contact plane. (e) Speculation on coherent tissue polarity establishment. Symmetry break first occurs in the actin network, followed by microtubule (MT) rerouting and internal polarity reorientation. The asymmetric distribution of internal forces associated with these changes is counterbalanced by asymmetric intercellular forces, which further affect polarity in adjacent cells and propagate asymmetric orientation cues.

Directed collective motion

Коллективное перемещени крупных многоклеточных групп зависит от продукции межклеточных сил, пространственное распределение которых управляет миграцией клеток относительно их соседей. Внезапное удаление SBCs, позволяет до этого ограниченной группе клеток мигрировать, демонстрируя, что межклеточные силы умножаются от фронта миграции к тылу группы клеток [94] (Figure 4b). Межклеточные силы, по-видимому, не тянут клетки вперед, а скорее ориентируют поле тянущих сил, которое они формируют на ECM, чтобы мигрироать.

Недавно было установлено, что глобальная сцепленность может проявляться в пространственной организации и коллективном перемещении крупных групп клеток [95]. Клетки, сплоченные в многоклеточные группы на чашках с микропаттерном, не обнаруживают какого-либо когерентного глобального перемещения или специфической клеточной ориентации. Однако на торус-подобном микропаттерне обнаруживается четкая асимметрия в клеточной ориентации, так что длинные оси клеток наклонены под сходным углом в отношении центра торуса (Figure 4c). Это, по-видимому, отражается в направлении клеток, принимаемом, когда перемещаются по торусу. Угловое направление клеточной подвижности на периферии края торуса (с позитивным изгибом) стремится быть противоположным тому, что на внутреннем краю торуса (с негативным изгибом) (Figure 4c). Следовательно, очевидно, что нарушение симметрии, накладываемое на торус, возникает из этого направляющего своства клеточного перемещения по краям торуса, которое распространяется на всю руппу клеток. Неожиданно, угловой наклон ориентации эндотелиальныхы клеток наблюдается по часовой стрелке, тогда как в случае миобластов он против часовой стрелки. Т.о., вариации во внутриклеточных параметрах, по-видимому, могут проявлятся в виде специфических асимметрий у разных типов клеток. Однако пока отсутствует объяснение этой геометрически простой организации, возникающей в результате, по-видимому, довольно сложного механизма. Одной из областей, где этот механизм может быть идентифицирован это регуляция клеточной полярности и её взаимоотношение с ориентированной подвижностью клеток.

Directed cell polarity

Взаимоотношение между расположением CCAs и CMAs влияет на ориентацию оси ядро-центросома. Центросома относительно ядра стремится занять более дистальную позицию относительно CCAs и более проксимальную позицию к CMAs ^73,74,96 (Figure 4d). Т.о., асимметричное расположение CCAs и CMAs достаточно, чтобы изменить ось ядро-центросома^73,74. CCAs, по-видимому, регулируют позиционирование центросом^73,96, тогда как CMAs, по-видимому, регулируют смещение ядра из центра^69,73. Как актиновые филаменты [96], так и MTs [73], как было установлено, участвуют в регуляции позиционирования центросом как можно дальше от CCAs. Следовательно, механизмы, с помощью которых цитоскелет влияет на позиционирование центросомы и ядра, остается неясным. Кроме того, ориентация клеточной полярности не только зависит от расположения CCAs, но и также от ориентации полей межклеточных сил [97].

Принимая во внимание, что самоорганизация сетей актиновых филамент и MT очень чувствительна к SBCs и к распределению механических ограничений и что оба типа сетей обладающие прирожденной способностью нарушать симметрию, то склонность к коллективному направленному перемещению [95] возникает в результате нарушения симметрии во внутриклеточной актиновой сети и как следствие асимметричной ориентации внутренней клеточной организации [98] (Figure 4e). Однако, как эти поляризованные сигналы распространяются на соседние клетки и приводят к коллективному ориентированному перемещению, остается неясным. В частности, роль внутренней механики и передачи межклеточных сил, могут быть ключевыми элементами, поддерживающими внутриклеточную интеграцию пространственных сигналов и становление когеретной клеточной полярности в динамичных многоклеточных структурах.

Alignment and spindle formation

Образование биполярных митотических веретен также зависит от геометрических пограничных условий, определяемых с помощью ДНК и клеточной формы. Два механизма вносят вклад в сборку митотического веретена вблизи ДНК : фокусирование минус-концов MTs, которые ассоциируют с крупными кластерами ДНК, чтобы сформировать полюса веретена, и антипараллельное расположение плюс-концов MTs, которые закреплены на двух MTOCs, так что звездочки из MTs перекрываются [37].

Мультимерные на минус-концы направленные моторы, такие как dyneins, индуцируют образование полюсов веретена. ДНК предоставляет сигналы наведения для первоначального расположения MT и т.о., склоняет к образованию биполярного веретена^38,39. MTs стремятся расположиться параллельно к поверхности бусинки, покрытой ДНК. Прирожденный молекулярный аппарат, поддерживающий фокусировку полюсов веретена и пространственную организацию митотического веретена, является сильным и первоначально кажется нечувствительным к конфигурации ДНК комплекса [40]. Однако, пространные манипуляции с количеством ДНК и её пространственным расположением, с использованием принтинга микроконтактов, выявило направляющую роль ДНК в сборке веретена [41]. Увеличение размера агрегатов ДНК вызывают удлинение веретена (Figure 2d). Выше критического размера, крупные агрегаты ДНК могут индуцировать образование множественных веретен [41] (Figure 2d). Умеренного асимметричного распределения ДНК достаточно, чтобы ориентировать формирование веретена^40,41 (Figure 2e). Длинные кусочки, покрытые ДНК приводят к образованию множественных повторов из веретен вдоль всей длины бруска и тем самым подтверждают существование внутренне присущей толщины веретена (Figure 2f). Эта прирожденная толщина веретена, по-видимому, определяется балансом между моторами, понуждающими к фокусированию MT концы, и эластической реактивной силой, обусловленной изгибом MT. В определенном диапазоне параметров, определяемых соотношением между толщиной агрегируемой ДНК и длиной MT, симметричность нарушается и все MTs спадаются на одной стороне ДНК, приводя в результате к асимметричной конфигурации веретена в отношении длинной оси бруска [41] (Figure 2f). Ниже этого критического диапазона антипараллельные MTs от противоположных полюсов (with the bar in between) взаимодействуют, чтобы стабилизировать образование симметричного биполярного веретена; выше этого диапазона две конфигурации веретена на противоположных сторонах бруска ДНК оказываются независимыми и обе формируют независимые монополярные веретена.

Cellular self-organization

В клетках организующие принципы, описанные выше, приложимы, но более трудны для выявления и исследования. Как актиновая, так и MT сети регулируются сотнями разных типов связывающих белков. Кроме того, сборка актиновых филамент и MTs влияют др. на др. посредством физических и биохимических взаимодействий. Сборка цитоскелетной сети регулируется на клеточной шкале и не зависит более от локальных биохимических и геометрических условий. Воздействие биохимических сигналов заставляет систему нарушать симметрию и определять ось полярности. Хотя сборка актиновой и MT сети более сложна в клеточном контексте, чем in vitro, некоторые самоорганизующие принципы выявляются.

В простейших условиях могут быть достигнуты почти клеточные условия в экспериментах in vitro, сходные самоорганизующиеся структуры. Цитоскелетные сети в клетках из лимфатических линий или др. клетках или клеточных фрагментах на неадгезивном субстрате не ограничиваются др. геометрическими ограничениями, чем плазматическая мембрана. В отсутствие MT сетей, актиновая сеть контактирует и нарушает симметрию после появления локального разрыва в сети. С разрывом симметрии избыточно сократившийся регион распространяется по сети^42-44. Процесс разрыва сходен с тем, что происходит в разветвленной сетчатой структуре вокруг бусинки [12], за исключением появления разрыва в результате контрактильных сил, генерируемых миозинами скорее, чем толкающими силами, связанными с полимеризацией актина. В отсутствие актиновых сетей, MTs, толкающие способную к деформации мембрану, соединяются, выстраиваются и нарушают симметрию путем формирования длинных трубчатых выпячиваний^42,43, напоминая такое их поведение в пузырьках^33,35,36. Однако в условиях клетки актиновые и MT сети взаимодействуют, а SBCs более сложны, представлены свободно флюктуирующей плазматической мембраной. ECM и клетки соседи могут представлять собой SBCs. Следовательно, точный контроль и манипуляции с клеточными адгезивными соединениями, которые являются клеточными структурами, которые взаимодействуют с клеточным структурными микроокружением, показывают, как эти SBCs могут управлять внутренне присущими свойствами самоорганизации цитоскелета.

Directed shape

Хотя элонгация клеточной формы, расположение цитоскелета и внутренняя клеточная полярность обычно скоррелированы, клеточная форма не детерминирует организацию актина и MT. Модификация актиновой сети с помощью тока жидкости, при этом сохраняла постоянной форму переориентированной MT сети [52]. Сходным образом, модификация MT сети независимо от клеточной формы переориентировала актиновую сеть [53]. Скорее всего имеется прирожденная связь между актиновой и MT сетями, которая затрагивает их соотв. пространственную организацию и полярность клеточной оси.

Directed actin network architecture

Контрактильные пучки антипараллельных филамент присутствуют по всей цитоплазме, Периферические пучки и более внутренние пучки имеют разную динамику и контрактильные свойства. Компоненты периферических пучков движутся в направлении центра пучка, тогда как компоненты внутренних пучков остаются статичными в отношении организации пучков [58] (Figure 3b). Это, по-видимому, составляет ключевой отличие в полярности филамент и тем самым в специфических контрактильных совойствах этих двух типов пучков. По мере распластывания клетки или увеличения коэффициента формы клетки контракция клетки увеличивается^59-61. Увеличение коэффициента формы клетки вызывает выстраивание контрактильных пучков, которые формируют структуры, такие как стрессовые волокон или миофибриллы (Figure 3c). Выровненные стрессовые волокна и ассоциированные анизотропные контракции вдоль клеточной базальной поверхности связаны со сборкой сходных структур и распределением сил вдоль клеточной апикальной поверхности^62,63. Выровненные по одной оси миофибриллы обнаруживают тенденцию организовывать свои паттерны исчерченности периодически (in register) [64].

Асимметричные SBCs, определяемые в культуре клеток по микропаттерну сайтов адгезии, могут приводит к развитию асимметричных актиновых сетей. Пучки накапливаются преимущественно вдоль вогнутого скорее, чем выпуклого края клетки [65]. По мере распластывания клетки поверх адгезивной области формируются бросающиеся в глаза контрактильные пучки, которые соединяют этот регион с др. адгезивными регионами, разделенными с помощью неадгезивных регионов^47,66,67, выявляя образование крупных сил тяги [67] (Figure 3d). Относительно крупные расстояния между местами слипчивости ведут к уменьшению изгиба края и утолщению пучков и тем самым, по-видимому, отражают более крупные силы между этими сайтами^66,68 (Figure 3e).

Directed MT network

MT сеть приспосабливает свою динамику к разным конфигурациям актиновой сети. MTs изгибаются и растут вдоль актиновых контрактильных пучков, но останавливают рост как только достигнут разветвленной актиновой сетевой структуры [69]. Интересно, что хотя асимметричная актиновая сеть д. приводить к асимметричной организации MTs, MTOC остается в своей центральной локализации (Figure 3f). Позиционирование центросом, по-видимому, зависит от генерации сил с помощью dyneins на MTs^70,71, но также от сил, генерируемых с помощью менее охарактеризованных соединений с актомиозиновой сетью^71,72. Позиционирование центросом в центре является даже более удивительным, учитывая, что большая часть цитоплазмы занимается ядром, на которое MTs также могут оказывать толкающие и притягивающие воздействия. Сильный механизм, с помощью которого центросомы оказываются позиционированы в геометрическом центре контура, что предписывает форму клетки, гда актиновая сеть асимметрична, а ядро занимает большую часть объёма цитоплазмы, ещё предстоит выявить.

Расположение ядра в клетке в культуре смещено от центра и располагается дистально от структуры клеточной адгезии с ECM и актиновой разветвленной сетевой структуры, но проксимальнее контрактильных пучков [69]. Следовательно, внутренняя полярность, как показывает вектор ядро-центросома, ориентирован в отношении асимметрии ECM и актиновой сети^55,69. Биохимическое нарушение актомиозиновой сети, могут вызывать пертурбации ориентации полярности MT сети или соединений ядро-цитоскелет относительно клетка-ECM SBCs^71,73,75.

Directed migration

Асимметричная организация цитоскелета в ответ на асимметричные SBC может повлиять на направление перемещения клетки. Взаимоотношение между наружной асимметрией и ориентированной подвижностью не является прямолинейным, поскольку оно, по-видимому, зависит от типа клетки и степени асимметрии. Линейные трек повторяющихся микропаттернов в форме равнобедренного треугольника может привести клетки к перемещению в направлении острого угла верхушки такого треугольника^77,78. Напротив, удлиненный равнобедренный треугольник с очень острым углом (всего в несколько градусов) может вести клетки прочь от острого угла верхушки [79] (Figure 3h).

Directed cell division

Адаптация архитектуры сети MT к архитектуре актиновой сети и к клеточной форме проявляется во время клеточного деления. Натяжения в астральных MTs, исходящих из полюсов веретена в направлении клеточного кортекса, вызывают вращательный момент на веретено и управляют его ориентацией. Натяжение этих астральных MTs регулируется присутствием кортикальных сигналов, ассоциированных с актиновой сетью, которая ориентирует ось клеточного деления в отношении клеточных адгезивных сигналов и архитектуры актиновой сети^84-87. Натяжение может также вызываться с помощью цитоплазмы и поэтому д. быть пропорциональным длине астральных MT; различия в длине астральных MT могут отличаться в соответствии с элонгацией клеточной формы и эти вариации могут управлять ориентацией соотв. оси деления^88,89.

Tissue self-organization

На уровне тканевой организации сложность системы увеличивается с увеличением числа компонент. Несмотря на это, точные манипуляции в геометрией SBCs оказываются пригодными для идентификации соотв. правил самоорганизации.

Directed cell positioning

Самоорганизация клеток в данном пространстве зависит от баланса механических сил между клетками и окружающим матриксом. Две клетки в контакте составляют минимальную многоклеточную структуру, где клетки могут формировать cell-matrix adhesions (CMAs) и cell-cell adhesions (CCAs). Если ограничиться гомогенным микропаттерном (т.e., когда клеточная базальная поверхность контактирует с непрерывным слоем ECM), то эндотелиальные клетки, формирующие CCAs, перемещаются регулярно относительно др. др. в плоскости чашки для культивирования, тогда как фибробласты, которые не могут формировать CCAs, нет [90]. Следовательно, образование CCAs, по-видимому, модулирует способность двух клеток достигать механического баланса. Две адгезивные системы - CCA и CMA - действительно могут влиять на их соотв. расположение [91]. Две клетки данного эпителиального клеточного типа, ограниченные микропаттерном ECM внутри определенной области могут перемещаться и принимать стационарную позицию в ответ на незначительные изменения в геометрии ECM [92] (Figure 4a). В самом деле, продукция сил натяжения на CCA зависит от пространственной организации ECM. Межклеточные силы выше, когда CCA ближе к ECM. Это направляет CCA прочь от ECM и стабилизирует позицию клеток в этой конфигурации, которая соответствует глобальной минимизации общей контрактильной энергии [92] (Figure 4a). Напротив, образование CCA предупреждает формирование проксимальных CMAs^74,93. Взаимное исключение двух адгезивных систем ведет к их пространственному разделению и управляет позиционированием клеток [91].

Directed collective motion

Коллективное перемещение крупных многоклеточных групп зависит от продукции межклеточных сил, пространственное распределение которых управляет миграцией клеток относительно их соседей. Внезапное удаление SBCs, позволяет до этого ограниченной группе клеток мигрировать, демонстрируя, что межклеточные силы умножаются от фронта миграции к тылу группы клеток [94] (Figure 4b). Межклеточные силы, по-видимому, не тянут клетки вперед, а скорее ориентируют поле тянущих сил, которое они формируют на ECM, чтобы мигрировать.

Недавно было установлено, что глобальная сцепленность может проявляться в пространственной организации и коллективном перемещении крупных групп клеток [95]. Клетки, сплоченные в многоклеточные группы на чашках с микропаттерном, не обнаруживают какого-либо когерентного глобального перемещения или специфической клеточной ориентации. Однако на торус-подобном микропаттерне обнаруживается четкая асимметрия в клеточной ориентации, так что длинные оси клеток наклонены под сходным углом в отношении центра торуса (Figure 4c). Это, по-видимому, отражается в направлении клеток, принимаемом, когда перемещаются по торусу. Угловое направление клеточной подвижности на периферии края торуса (с позитивным изгибом) стремится быть противоположным тому, что на внутреннем краю торуса (с негативным изгибом) (Figure 4c). Следовательно, очевидно, что нарушение симметрии, накладываемое на торус, возникает из этого направляющего свойства клеточного перемещения по краям торуса, которое распространяется на всю группу клеток. Неожиданно, угловой наклон ориентации эндотелиальных клеток наблюдается по часовой стрелке, тогда как в случае миобластов он против часовой стрелки. Т.о., вариации во внутриклеточных параметрах, по-видимому, могут проявляться в виде специфических асимметрий у разных типов клеток. Однако пока отсутствует объяснение этой геометрически простой организации, возникающей в результате, по-видимому, довольно сложного механизма. Одной из областей, где этот механизм может быть идентифицирован это регуляция клеточной полярности и её взаимоотношение с ориентированной подвижностью клеток.

Directed cell polarity

Принимая во внимание, что самоорганизация сетей актиновых филамент и MT очень чувствительна к SBCs и к распределению механических ограничений и что оба типа сетей, обладающих прирожденной способностью нарушать симметрию, то склонность к коллективному направленному перемещению [95] возникает в результате нарушения симметрии во внутриклеточной актиновой сети и как следствие асимметричной ориентации внутренней клеточной организации [98] (Figure 4e). Однако, как эти поляризованные сигналы распространяются на соседние клетки и приводят к коллективному ориентированному перемещению, остается неясным. В частности, роль внутренней механики и передачи межклеточных сил, могут быть ключевыми элементами, поддерживающими внутриклеточную интеграцию пространственных сигналов и становление когерентной клеточной полярности в динамичных многоклеточных структурах.

Concluding remarks

SBCs play a major role in directing intrinsic cytoskeleton self-organization properties, from the architecture of macromolecular structures to the distribution of cells in tissues. Investigations at each scale – on isolated cytoskeleton components, more complex cell extracts, or entire cells – provide complementary information. All contribute to the establishment of a working framework, which should ultimately allow us to formulate the exact rules of cytoskeleton self-organization during morphogenesis. However, our understanding of the self-organization of minimal molecular systems in vitro is not sufficient to account for genuine cellular architectures and dynamics. Additional efforts need to be initiated to connect in vitro and in vivo self-organized cytoskeleton networks and fully to benefit from the former in understanding the latter.

There is currently a gap between the few self-organized structures that have been characterized in vitro and the myriad different structures observed in cells. Efforts should be made to reconstitute all of these structures in vitro. This will become possible by: (i) using more complex protein mixtures in vitro to recapitulate their effects on cytoskeleton networks observed in cells; (ii) identifying ways to engineer controlled SBCs mimicking actual biological membrane; and (iii) modulating biochemical signaling.

The regulation of network disassembly is as important as the regulation of assembly in network dynamics. There is a critical need to further understand how this network disassembly is modulated by SBCs. Progress in this direction should allow the reconstitution of dynamic steady states in which manipulation of SBCs and network assembly–disassembly could lead to conditions in which the network persistently self-renews, with its overall structure remaining unaffected. Technological developments are also required to modulate SBCs in real time [47], especially for analyzing dynamic systems and cytoskeleton adaptation to external changes. However, the considerable efforts made to understand the regulation of the self-organization properties of actin filament or MT networks will not be sufficient to understand their self-organization in a cellular context, because the two networks are not independent of each other. Instead, the two networks are physically and biochemically coupled. It is necessary to design new, controlled in vitro biochemical assays in which the two networks can interact and regulate each other. Such assays should offer the possibility to manipulate the geometry of network interactions as well as the spatial distribution of crosslinking proteins and regulating enzymes such as Rho-GTPases. Physical SBCs need to be completed by biochemical SBCs comprising surface-grafted, but also soluble and diffusible, cues.

Notably, understanding of the basic laws governing cytoskeleton assembly can not only provide insights into cell and tissue morphogenesis, but may also have technological applications in the development of microdevices requiring complex and dynamic architectures. A structure whose precise architecture is regulated by deterministic assembly rules, that can grow and self-repair because it self-renews, has advantages over a fixed structure that would have to be repaired or replaced by a prefabricated static component. This new sort of manufacturing would be a useful way to prepare novel biomaterials and should find promising applications in microelectronics and robotics.

Directed cytoskeleton self-organizationTimothйe Vignaud, Laurent Blanchoin, Manuel Thery Trends in Cell Biol. Volume 22, Issue 12, December 2012, Pages 671–682 http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2012.08.012,

Directed cytoskeleton self-organization
Timothйe Vignaud, Laurent Blanchoin, Manuel Thery
Trends in Cell Biol. Volume 22, Issue 12, December 2012, Pages 671–682 http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2012.08.012,