C. elegans обычно проходят через простой жизненный цикл: от яйца через 4 личиночные стадии к репродуктивному взрослому. Однако при неблагоприятных условиях эти черви вступают в альтернативную третью личиночную стадию, наз. dauer. По сравнению с нормальной личиночной стадией dauer личинки имеют совершенно отличный метаболизм и физиологию и отличающиеся морфологию и поведение [1], это обеспечивает сильное увеличение резистентности к стрессам и облегчает дисперсию. Когда окружающие условия улучшаются, то C. elegans выходит из состояния dauer и возобновляет репродуктивное развитие. Стадия dauer обычно рассматривается как "non-aging," поскольку dauers могут персистировать месяцы прежде, чем вернуться к развитию в репродуктивных взрослых особей, которые живут обычный срок жизни в несколько недель. Не удивительно, что недавние находки показали, что повторная активация некоторых молекулярных сигнатур у dauer позднее вносит в жизнь удлинение продолжительности у C. elegans [2].

The Dauer Pheromone

Основные средовые сигналы, которые регулируют формирование dauer личинок, включают питание, температуру и передачу сигналов малых молекул, постоянно продуцируемых червями: dauer феромоны [3],[4]. Повышение уровня феромонов вызывает, напр., перенаселенность, вызывающая вступление на ст. dauer. Обширные исследования последнего времени выявили сложную сеть сигнальных путей, которые регулируют решение о переходе к репродуктивному созреванию или к dauer диапаузе. Ранее проведенный скрининг выявили большое количество мутантов. которые вступают или выходят из dauer несоответственно, обычно обозначаемые как "daf" (dauer formation) мутанты, многие из которых открывают компоненты высоко консервативных сигнальных путей. Внешнесредовые сигналы воспринимаются рядом сенсорных нейронов [5],[6], которые связаны с двумя нейроэндокринными сигнальными путями: daf-2 insulin/insulin-like growth factor signaling (IIS) путь и daf-7 TGF-β сигнальный путь [7]-[9].

Activation of Nuclear Hormone Receptor DAF-12 Serves as a Key Developmental Switch

Генетические доказательства выявили, что daf-12, рецептор ядерного гормона, гомологичный рецептору витамина D млекопитающих и LXR, является основным переключателем, с помощью которого некоторые вышестоящие dauer сигнальные пути конвергируют. daf-12 действует как лиганд-зависимый транскрипционный фактор, который закрепляет финальное решение развития по репродуктивному или dauer пути [5],[8],[10]. Кроме того, P450 daf-9, как было установлено, действует выше daf-12, противодействуя вступлению в dauer [11],[12]. Базируясь на большом количестве доказательств, был сделан вывод (1) что активность DAF-12 контролируется с помощью steroidal лиганда, чей биосинтез базируется частично на daf-9 и (2) что эти steroidal DAF-12 лиганды управляют репродуктивным развитием, тогда как не сцепленный с лигандом DAF-12 способствует вступлению в ст. dauer [12],[13]. Более ранние исследования установили, что экспрессия DAF-9 в паре нейрон-подобных XXX клетках, предполагается, что XXX означают фокусы, в которых вышестоящие передачи сигналов DAF-2 и DAF-7 интегрируются биосинтезом DAF-12 лиганда(ов) [12]-[14].

Вплоть до недавнего времени удивительно мало было известно о роли малых молекул в этих путях. Вплоть до 2005, более чем 20 лет спустя после первоначального открытия Golden и Riddle, когда был идентифицирован первый компонент dauer феромона. В последние годы стало очевидным, что "dauer pheromone" фактически представляет собой многокомпонентную смесь, состоящую из, по крайней мере, частично из 10 различных, но химически и биосинтетических сходных соединений. Все компоненты dauer феромона представляют собой dideoxysugar ascarylose и включают различные, происходящие из жирных кислот боковые цепочки и иногда несут др. составляющие (напр., ascr#2 и ascr#3 in Figure 1) [15]-[19]. Частично идентификация dauer феромона была задержана из-за его сложного состава, что делало выделение dauer-индуцирующих компонентов из чрезвычайно сложных экстрактов метаболитов C. elegans очень трудным. Последующие исследования показали, что многие компоненты dauer феромона также влияют на поведение C. elegans, часто в концентрациях ниже тех, что вызывают dauer [18],[19].

Figure 1. Dafachronic acid biosynthesis controls the decision between dauer and reproductive development. Insulin signaling and TGF-Я signaling promote DA biosynthesis, driving development to reproductive adults, whereas dauer pheromone (ascarosides) abolish DA biosynthesis, resulting in unliganded DAF-12 and dauer formation.

В соответствии с более ранними исследованиями подчеркивалось, что сенсорные нейроны ответственны для детекцию внешнесредовых сигналов, недавний прогресс идентифицировал специфические сенсорные нейроны и G-protein-coupled рецепторы, участвующие в перцепции ascaroside [20],[21]. Однако механизмы, с помощью которых ascarosides воздействуют на всеобщие организменные изменения, которые ассоциируют с отказом от репродуктивного развития и вступлением в dauer диапаузу, поняты лишь частично.

Dafachronic Acids Are Ligands of DAF-12

Как показано выше, DAF-12 действует как центральный переключатель, управляющий выбором решения между репродуктивным развитием и dauer. Как в случае dauer феромона, идентификация низкомолекулярных лигандов DAF-12 стала очевидной только спустя длительное время после характеристики основных генетических компонентов dauer сигнальной сети. В 2006, Motola et al. [22] описали два соединения, подобные желчной кислоте, наз. dafachronic acids (DA), в качестве эндогенных лигандов для DAF-12. Две dafachronic кислоты, обладающие двойными мостиками или в позиции 4 или 7 стероидного скелета (Δ⁴- and Δ⁷-dafachronic кислоты, Figure 1), как было установлено, активируютDAF-12 in vitro и, как ожидается, способствуют репродуктивному развитию [22]. Последующие исследования показали, что DAs также регулируют продолжительность жизни взрослых C. elegans и что передача сигналов DA законсервирована широко среди нематод, включая паразитических нематод, чья инфекционная личиночная стадия соответствует C. elegans dauer личинкам [23],[24].

C. elegans онтогенетическая судьба и продолжительность жизни т.о., в конечном итоге зависят от пути биосинтеза DA. Следовательно, вычленение этого пути и его регуляции имеет центральное значение для для понимания механизмов, с помощью которых феромон и др. внешнесредовые сигналы управляют историей жизни C. elegans. Известно, что холестерол необходим для жизнеспособности нематод главным образом потому, что он служит в качестве стартового материала для биосинтеза DA, но только две ступени биосинтеза DA были установлены: на первой ступени биосинтеза DA biosynthesis Rieske-подобная оксидаза DAF-36 превращает холестерол в 7-dehydrocholesterol [25], тогда как на последней ступени биосинтеза DA P450 DAF-9 добавляет карбоновую кислоту к концу боковой цепочки [22] (Figure 1). В частности, происхождение характерной 3-keto группы, которая важна для активности DA, остается неясным. Предыдущая работа подтвердила, что HSD-1, предполагаемый гомолог 3-β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD), может вносить 3-keto группу, хотя точная роль этого энзима в биосинтезе DA не установлено[26],[27].

Elucidation of Dafachronic Acid Biosynthesis

В этом номере PLoS Biology, Wollam et al. осуществили геномный RNAi скрининг для обнаружения энхансеров слабого dauer фенотипа у daf-36 мутантных червей. Эти мутантные черви обнаруживают пониженные уровни DA почти достаточные для нормального репродуктивного развития и поэтому RNAi нокдаун любого дополнительного компонента пути биосинтеза DA д. приводить к dauer фенотипу. Скрининг выявил, что short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) dhs-16 выступает в качестве энхансера daf-36 dauer фенотипа. Эксперименты по генетическому эпистазу показали, что dhs-16 действует ниже insulin/IGF-1 и TGF-β сигнальных путей, но выше DAF-12, указывая тем самым, что DHS-16 участвует в биосинтезе DA. Чтобы определить точную роль DHS-16 в биосинтезе DA, Wollam et al. провели серию экспериментов по скармливанию стеролов, которые показали, что 3-keto стероиды устраняют dhs-16 фенотип, тогда как соотв. 3-hydroxy стероиды не оказывали эффекта. Эти результаты показывают, что DHS-16 обладает 3β-dehydrogenase активностью, превращая lathosterol и вообще др. 3-hydroxy стеролов в соотв. 3-keto производные (Figure 1).

Идентификация DHS-16 как 3β-HSD, вносящего характерную 3-keto функциональность закрывает большой пробел пути в биосинтезе DA. Хотя DHS-16 не является ортологом известного3β-HSDs млекопитающих, который, по-видимому, базируется на др. химическом механизме для введения 3-keto функциональности, существует несколько коротко-цепочечных дегидрогеназ у млекопитающих, напр., экспрессируемый в печени SDR-O/SDR9C7, которые являются близкими гомологами. Находки, что DHS-16 обладает 3β-HSD активностью и участвует в биосинтезе молекул, подобных желчным кислотам, которые контролируют развитие и продолжительность жизни C. elegans, поэтому можно предположить, что его гомологи у млекопитающих выполняют аналогичные роли в метаболизме жирных кислот. Если подтвердится такая тесная гомология, то можно будет предположить интригующую возможность, что стероиды, подобные желчным кислотам регулируют продолжительность жизни и млекопитающих, что, кстати, не было исследовано вразумительно.

Detecting Dauer-Inducing Environmental Signals

Т.к. вырисовывается четкая картина биосинтеза DA, то становятся доступными инструменты, чтобы выяснить наиболее интересный аспект в принятии решений: как координируются онтогенетические изменения на уровне всего организма? Решение между вступлением в dauer диапаузу и репродуктивное развитие д. базироваться на мощных механизмах временной и пространственной координации, чтобы избежать частичных фенотипов. Чтобы открыть такие механизмы, Schaedel et al. впервые исследовали временные точки, при которых развивающиеся личинки C. elegans интегрируют внешнесредовые сигналы перед тем как детерминироваться к dauer или репродуктивному развитию. Используя dauer феромон и DA как противоположные стимулы, Schaedel et al. установили, что на решение может повлиять DA и феромон, но только в во время строго определенного промежутка времени перед окончательным определением судьбы жизненного цикла. Более того, становится очевидным, что dauer феромон и DA являются непосредственно конкурирующими стимулами: высокие концентрации dauer феромона необходимы при высоких уровнях DA, чтобы предотвратить детерминацию вступления в dauer. Неожиданно, daf-9 нулевые мутанты, которые неспособны продуцировать DA, отвечают по другому, чем черви дикого типа на условия, которые близки к порогу индукции dauer: в то время как когорты личинок дикого типа, испытывающие воздействие умеренных концентраций dauer феромона, развиваются в смесь dauer личинок и полностью развитых взрослых, daf-9 мутанты, подвергшиеся действию низких концентраций добавленной DA развиваются в животных, обнаруживающих ряд промежуточных фенотипов, включая червей, которые прошли dauer стадию, но всё ещё обладают аномальным фенотипом. Такие промежуточные фенотипы появляются почти исключительно у daf-9 червей, подтверждая, что детерминация, распространяющаяся на весь организм в dauer или репродуктивное развитие использует прямую регуляцию со стороны daf-9.

Используя трансгенных daf-9 нулевых червей, экспрессирующих GFP под контролем промотора daf-9, Schaedel et al. показали, что в отсутствие DA, транскрипция daf-9 осуществляется только в XXX клетках, тогда как промежуточные концентрации DA приводят к драматическому увеличению в его экспрессии в гиподермальных клетках во время временного промежутка, когда личинки д. сделать выбор между dauer и репродуктивным развитием (Figure 2). Отчасти в противовес интуиции, даже высокие концентрации извне добавленной DA вызывают снижение транскрипции daf-9 в гиподерме. Находка, что daf-9 экспрессируется постоянно в XXX клетках, тогда как экспрессия daf-9 в гиподерме, регулируемая с помощью DA, подтверждает, что DA, продуцируемая с помощью XXX, может способствовать экспрессии daf-9 в гиподермальных клетках. Чтобы проверить эту гипотезу, Schaedel et al. на личинках, у которых лазером устранены XXX клетки, экспрессировали белок DAF-9, нагруженный GFP. Они наблюдали, что что почти все черви с устраненными XXX вступают в dauer стадию, вместо развития в нормальных взрослых, и у них отсутствует экспрессия DAF-9 в гиподермальных клетках. Образование dauer у этих червей может быть полностью устранено добавлением DA, без образования какого-либо промежуточного фенотипа, наблюдаемого у daf-9 нулевых мутантов с DA. Итак, эти результаты показывают, что XXX клетки действуют как источник DA, который запускает сильный дополнительный биосинтез DA в гиподерме, перекрывая на уровне всего организма выбор развития к репродуктивным взрослым особям. В ответ на благоприятные условия эта петля обратной связи поддерживает уровни DA достаточно высокие. чтобы продолжать репродуктивное развитие, тогда как неблагоприятные условия, по-видимому, запускают пониженную продукцию DA в XXX клеток, приводя к полному выключению биосинтеза DA, чтобы гарантировать на уровне всего организма инициацию перехода к dauer.

Figure 2. Dafachronic acid feedback directs organism-wide commitment to specific developmental fates. (A) Under favorable conditions, XXX-produced DA is amplified via daf-9 expression in hypodermal cells (green). (B) Under marginal conditions, increased hypodermal daf-9 expression maintains sufficient DA levels to prevent intermediate phenotypes. (C) Under unfavorable conditions, low dafachronic acid production in the XXX cells is insufficient to turn on hypodermal DA production. The unliganded DAF-12 then recruits the corepressor DIN-1, promoting dauer development.

Longer Term Considerations and Longevity Top

Изучение биосинтеза DA и его регуляции выявило саморегулирующуюся петлю, приводящую к бинарным решениям dauer или репродуктивное развитие. Однако некоторые аспекты этой регуляторной петли остаются нерешенными. Механистически неясно, как при благоприятных условиях, когда уровни DA высокие, гиподерма daf-9 удерживается на промежуточном уровне, тогда как при маргинальных условиях, когда уровни DA промежуточные, гиподерма daf-9 сильно увеличивает свою активность (Figure 2). Чтобы решить этот вопрос, было необходимо измерить действительные уровни DA у червей в разные временные точки при разных условиях, т.к. DAF-9 является только одним из нескольких энзимов пути биосинтеза DA. Кроме того, необходимо проверить возможность, что разные DAs выполняют разные функции.

Schaedel et al. далее показали, что феромон и DA действуют как конкурирующие сигналы. Предполагается, что высокие уровни феромонов модулируют стоящую выше передачу сигналов DAF-2 и DAF-7, это в конечном счете влияет на экспрессию генов биосинтеза DA. Сходным образом, необходимо прояснить молекулярные механизмы того, как происходящие от пищи сигналы и определение температуры вносят вклад в принятие решения о вступлении в dauer. Скорее всего, что эти факторы представляют собой внешнесредовые сигналы, которые воспринимаются с помощью вышестоящей передачи сигналов, но также возможно, что пищевые сигналы предоставляют собой метаболические импульсы. которые влияют на принятие решения стать dauer путем усиления активности передачи сигналов DAF-2/insulin.

Наконец, путь биосинтеза DA всё ещё далек от полного понимания. Wollam et al. показали. что HSD-1 не участвует в биосинтезе ?7-DA как это предполагалось ранее. Тем не менее, hsd-1 dauer фенотип [26],[27] строго указывает на то, что ген вносит вклад в биосинтез DA каким-то способом. Геном C. elegans содержит множество дополнительных HSD, DHS и CYP450, некоторые из которых, скорее всего, участвуют в биосинтезе DA. Если существуют дополнительные компоненты DA, тогда возможна тканевая специфичность их биосинтеза и действия.

Необходимо отметить, что путь биосинтеза DA выполняет ключевую роль в детерминации продолжительности жизни у C. elegans, в частности, в ответ на сигналы от зародышевой линии. Более того, пути, чувствительные к феромону, DAF-2 и DAF-7 оба являются ключевыми медиаторами продолжительности жизни [28],[29]. Следовательно, очевидно, что феромон и DA не только регулируют выбор судьбы во время развития, но и продолжают моделировать физиологию во всем взрослом периоде и оказывают существенное влияние на продолжительность. В этой связи, IIS и TGFβ у млекопитающих с уверенностью рассматриваются как важные для стерения и зависимых от возраста патологий. Принимая во внимание высоко консервативную природу обоих биосинтетических генов и химическую природу DAs как желчных кислот, начатые на C. elegans могут открыть новые аспекты функции желчных кислот у млекопитающих, в старении и связанных с возрастом патологий.

Steroids as Central Regulators of Organismal Development and Lifespan Siu Sylvia Lee, Frank C. Schroeder PLoS Biol. (2012), 10(4): e1001307. doi:10.1371/journal.pbio.1001307

Steroids as Central Regulators of Organismal Development and Lifespan
Siu Sylvia Lee, Frank C. Schroeder
PLoS Biol. (2012), 10(4): e1001307. doi:10.1371/journal.pbio.1001307