У пациентов, страдающих end-stage liver disease (ESLD), трансплантация печени является главным способом лечения. Однако серьезная нехватка донорских органов. хирургические осложнения, отторжение и высокая цена процедуры подогревают огромный интерес к исследованиям по поиску новых способов лечения этой болезни. Накапливаются доказательства участия стволовых клеток и клеток предшественников в регенерации печени, включая овальные клетки (Hasuike et al. 2005; Darwiche et al. 2011), эмбриональные стволовые клетки (ESCs) (Yamada et al. 2002; Yamamoto et al. 2003; Haque et al. 2011), гематопоэтический костный мозг и mesenchymal stem cells (MSCs) (Lagasse et al. 2000; Schwartz et al. 2002), fetal liver stem/progenitor cells (FLSPCs) (Oertel et al. 2006), adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT-MSCs) (Saulnier et al. 2010) и induced pluripotent stem (iPS) cells (Enns & Millan 2008; Iwamuro et al. 2010). Среди этих стволовых клеток и клеток предшественников FLSPCs, как полагают, являются клетками с наибольшим терапевтическим потенциалом, поскольку они легко обогащаются и могут восполнить как гепатоциты, так и холангиоциты.
Во время ранних стадий развития печени, печень плода содержит значительные количества FLSPCs. Однако существуют определенные трудности в успешной изоляции и очистке популяции FLSPCs из печени плода (Alpini et al. 1994; Rajvanshi et al. 1996). Используя эффективную систему мы успешно решили эту проблему (Liu et al. 2011). Др. задача заключается в том, как заставить FLSPCs пунктуально дифференцироваться в функциональные гепатоциты in vitro. Дифференцировка этих клеток, по-видимому, следует общему сигнальному пути; однако этот общий путь всё ещё недостаточно понятен и нуждается в прояснении. Собрано большое количество доказательств, подтверждающих, что эти общие сигнальные пути состоят из нескольких широко известных членов, таких как Wnt и Notch. Notch был впервые идентифицирован у Drosophila. Идентифицировано несколько Notch рецепторов у млекопитающих, такие как Notch1-4,и лиганды, такие как delta-like ligand (Dll)1, Dll3, Dll4 и Jagged1-2. Рецепторы являются трансмембранными белками и представлены следующими доменами: extracellular Notch (ECN), transmembrane domain (TM) и Notch intracellular domain (NICD). После соединения с лигандами отщепляется NICD от рецептора посредством γ-secretase и затем транслоцируется в ядро и вызывает экспрессию нижестоящего гена hairy enhancer of split 1 (Hes1). DAPT (N-[N-(3, 5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) является GSI, который может ингибировать все 4 рецептора. Предшествующие исследования показали, что Notch детерминирует самообновление клеток, пролиферацию и дифференцировку (Leong & Karsan 2006; Huang et al. 2010). Однако во время процесса дифференцировки из FLSPCs в зрелые гепатоциты вклад Notch, особенно какой Notch рецептор в первую очередь ответственен, не было известно. Чтобы прояснить роль Notch в дифференцировке FLSPCs мы предприняли это исследование.
Первой ступенью этого исследования было наблюдение экспрессии Notch в ткани печени на разных стадиях развития органа, используя quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) и иммуногистохимию. Затем сравнивали клеточную экспрессию Notch между очищенными FLSPCs и зрелыми гепатоцитами BRL. Наконец, мы оценивали может ли ингибирование Notch посредством DAPT индуцировать дифференцировку FLSPCs. Исходя из этих исследований мы установили, что Notch играет важную роль в дифференцировке FLSPCs в гепатоциты; следовательно, Notch3 может быть потенциальным маркером стволовых клеток и соответствующей молекулой мишенью для использования FLSPCs для лечения ESLD.
Discussion
Растут доказательства, демонстрирующие, что Notch предопределяет самообновление, пролиферацию и дифференцировку клеток (Leong & Karsan 2006; Huang et al. 2010). Во время дифференцировки стволовых клеток Notch дифференциально экспрессируется в стволовых клетках/клетках предшественниках и зрелых клетках (Zhao et al. 2009; Wang et al. 2010). Ингибирование Notch может нарушать "стволовость" стволовых клеток (Felszeghy et al. 2010). Роль Notch в дифференцировке стволовых клеток зависит от источника ткани. В мезодерме, как было установлено, активация Notch в гематопоэтических стволовых клетках (HSCs) вызывает самообновление (Varnum-Finney et al. 2000, 2003); в эктодерме судьба дифференцировки или оставаться нейральными стволовыми клетками (NSC) или становиться клетками нейральных предшественников (NPC) сбалансирована с помощью Notch и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (Aguirre et al. 2010), а свойства и количество NSC поддерживается с помощью активации Notch (Androutsellis-Theotokis et al. 2006). В ESCs скорее всего, что с высоким содержанием Hes1 ESCs склонны дифференцироваться в мезодермальный клон, а с низким содержанием Hes1 ESCs склонны развиваться по пути нейрального клона (Crawford & Roelink 2007; Kobayashi et al. 2009).
Хотя Notch играет ключевую роль в др. типа стволовых клетках, всё ещё неясно какой Notch рецептор в первую очередь ответственен за дифференцировку в гепатоциты и является ли Notch индуктором или ингибитором дифференцировки FLSPCs в гепатоциты. Первостепенное значение выяснение вышеуказанных деталей имеет для разработки специфической терапии, эффективно нацеленной на ESLD. Как на тканевом, так и на клеточном уровне мы установили, что Hes1 и Notch3 (единственный рецептор) экспрессируются на высоком уровне в ткани печени на ст. ED 14 и в FLSPCs, по сравнению со взрослой печенью и BRL, соотв. Скоординированная экспрессия Notch3 и Hes1 указывает на то, что Notch3 рецептор может играть ключевую роль в Notch активации и Notch3 может быть новым потенциальным маркером стволовых клеток в FLSPCs. Чтобы доказать эту гипотезу, мы наблюдали совместную экспрессию и изменения уровней экспрессии Notch3 и CD133. По ходу дифференцировки совпадение экспрессии Notch3 и CD133 теряется. Предшествующая литература о взаимоотношениях сигнального пути Notch и стволовых клеток показала, что Dll1 прежде рассматривался как лицевой антиген гепатобластов и обнаруживал корреляцию с дифференцировкой в гепатоциты (Tanimizu et al. 2004; Jelnes et al. 2007); Notch3 и Jagged1 были идентифицированы как стволовые маркеры MSCs (Kaltz et al. 2010). Все эти исследования касались печеночных стволовых клеток взрослых. Благодаря нашему подходу мы продемонстрировали, что Notch3 может быть потенциальным маркером стволовых клеток в FLSPCs.
Для дальнейшего установления роли Notch в дифференцировке в FLSPCsи для избегания компенсации со стороны др. Notch рецепторов (Kitamoto et al. 2005), мы оценивали, может ли ингибирование Notch индуцировать дифференцировку FLSPC в гепатоциты при использовании DAPT. Морфологически ингибирование Notch посредством DAPT заставляло FLSPCs формировать гепацито-подобные формы и печеночно-подобные клоны со структурами, подобными печеночным пластинкам (Yamamoto et al. 2003). Дифференцированные клетки обнаруживают позитивную регуляцию печеночных маркеров и подавление холангиоцитарных маркеров. Функциональный метод, такой как ICG uptake assay и PAS окрашивание, продемонстрировали, что DAPT способствует дифференцировке FLSPCs в функциональные гепатоциты. В целом уровень дифференцировки клеток, индуцируемый с помощью HGF, был сходен с таковым, индуцированным с помощью DAPT на 8-й день. В исследованиях дифференцировки гепатоцитов HGF широко используется в качестве индуктора дифференцировки (Limaye et al. 2008). В данном исследовании мы выявили сходную эффективность дифференцировки между HGF и DAPT. Это демонстрирует, что Notch играет ключевую роль в дифференцировке FLSPCs.
Однако детальные механизмы всё ещё неизвестны. Согласно одной теории судьба клеток детерминируется благодаря неравному распределению связанных со стволовыми клетками факторов после деления (Bray 2006). Мы полагаем, что в печени плода д. существовать баланс между дифференцировкой FLSPCs в гепатоциты и холангиоциты. Две клетки потомки, происходящие из одной FLSPC, становятся отличными благодаря неравному делению. Вследствие каждого деления одна клетка потомок будет получать больше маркеров стволовых клеток, тогда как др. будет получать меньше таких маркеров. Благодаря этим различиям изменяются клеточные судьбы. Показано, что химическое ингибирование Notch усиливает печеночную спецификацию (Darwiche et al. 2011; Han et al. 2011). Между тем, экспрессия HNF-3β коррелирует с активацией Notch3 в HepaRG клетках (Cerec et al. 2007), а HNF-3β, как известно, является ключевым фактором для овальных гепатоцитов, чтобы дифференцироваться в холангиоциты (Flynn et al. 2004). Это означает, что при небольшом количестве Notch3 рецепторов обнаруживается большая склонность к дифференцировке в гепатоциты.
В данном исследовании мы распознали, что имеются некоторые ограничения. Notch3 не специфически ингибируется, из-за отсутствия специфического ингибитора этого рецептора. Также исследования цикла с помощью нашего метода не достаточно для наблюдения долговременных эффектов дифференцировки. Идентификация нижестоящего гена, затрагиваемого Notch3 станет ключом к систематическим исследованиям дифференцировки FLSPCs.
Это первое исследование, выявившее вклад Notch в дифференцировку FLSPCs. Важно, что Notch3 может играть ключевые роли в генерации гепатоцитов из FLSPCs, он может служить в качестве нового маркера для FLSPCs. Итак, данное исследование частично выявило механизм дифференцировки FLSPCs в гепатоциты и предоставило информацию, которая будет способствовать использованию FLSPCs для лечения ESLD.
