Спецификация зародышевых клеток в противовес судьбам соматических клеток имеет первостепенное значение у всех видов и происходит в раннем эмбриональном развитии (1). У модельных организмов два разных метода спецификации и поддержания зародышевых клеток очевидны (1-3). У не млекопитающих видов судьба зародышевых клеток детерминируется с помощью наследования зародышевой плазмы, микроскопической отличающейся цитоплазмы ооцитов, богатой РНК и РНК-связывающими белками, которые сегрегируют с клетками, предназначенными стать зародышевыми клетками (1-3). Напротив, у видов млекопитающих зародышевые клетки специфицируются независимо от зародышевой плазмы посредством индуктивных сигналов (4-10). Исследования по картированию судеб преимплантационного мышиного эпибласта показали, что зародышевые клетки специфицируются в проксимальной части эпибласта в ответ на сигналы, такие как bone morphogenetic protein 4 (Bmp4), от соседней внеэмбриональной эктодермы (7,11). Теперь стало ясно, что проксимальная часть эпибласта не предетерминирована к судьбе зародышевых клеток, поскольку трансплантации дистальной части эпибласта, чтобы они контактировали с внеэмбриональной эктодермой, также ведут к формированию зародышевых клеток (7). Зародышевые клетки с определенностью распознаются на ~7.2 день после соития в виде внеэмбрионального кластера клеток, которые экспрессируют тканевую неспецифическую щелочную фосфатазу, Oct4 и Stella, в основании аллантоиса (12-15).
Семейство генов NANOS необходимо для развития зародышевых клеток у разных модельных организмов, хотя процессы, которые, которые регулируются, варьируют среди видов и между разными гомологами. У Drosophila, единственный гомолог nanos участвует в миграции зародышевых клеток, супрессии судеб соматических клеток в зародышевой линии и в поддержании самообновления зародышевых стволовых клеток (16-18), помимо участия в в формирования соматического паттерна (19). В целом, Nanos рекрутируется на чувствительные к Nanos элементы мишеней мРНК с помощью своего кофактора Pumilio, где Nanos белок действует, чтобы репрессировать трансляцию (20,21). У Caenorhabditis elegans, существуют три гомолога, при этом Nos-1 и Nos-2 участвуют, прежде всего, в развитии зародышевых клеток, в поддержании жизнеспособности зародышевых клеток и включении их в гонады (22).
Мышиные модели Nanos1 не выявляют четко различимой функции в зародышевых клетках для этого гомолога (23). Напротив, самцы Nanos2-/- мышей имеют семенники уменьшенных размеров и бесплодие из-за потери зародышевых клеток после инкорпорации primordial germ cell (PGC) в гонады, тогда как мыши самки, по-видимому, нормально развиваются и фертильны (24). Характеристика Nanos3 нокаутных мышей выявила снижение размера гонад и бесплодие как у самцов, так и у самок мыши. Подобно Nanos2-/- мышам, спецификация PGC происходит и у Nanos3-/- мышей, хотя PGCs не поддерживаются во время миграции (24). Более поздние исследования выявили участие Nanos3 в поддержании PGCs во время миграции посредством супрессии апоптоза (25). Отметим, что фенотипы Nanos2 и Nanos3 указывают на независимые, неперекрывающиеся роли этих гомологов (26).
Т.к. последние годы засвидетельствовали удивительный прогресс в понимании развития зародышевых клеток в модельных системах, трудно переносить информацию непосредственно на систему человека. Эта трудность обусловлена по большей части несколькими факторами. Во-первых, многие гены, необходимые для репродукции, эволюционируют столь быстро, что даже один и тот же гомолог у ближайших эволюционных соседей существенно отличается по последовательности или функции (27,28). Во-вторых, гены, которые располагаются на половых хромосомах, могут экспрессироваться в разных дозах в зависимости от вида организма или в более крайних случаях, напр., в случае гена Deleted in Azoospermia (DAZ) может отсутствовать в геноме, даже у тесно родственных млекопитающих (29). В-третьих, в противовес др. видам, люди обнаруживают удивительно много ошибок в аспекте развития зародышевых клеток, который обычно рассматривается как очень консервативный. Напр., неправильное расхождение мейотических хромосом происходит у дрожжей ~1/10 000 клеток. У мух неправильное расхождение происходит от 1/1000 до 1/2000 клеток , а у мышей менее 1/100 cells. У человека неправильная мейотическая сегрегация происходит в 5-20% клеток в зависимости от пола и возраста(30).
Мы исследовали функцию NANOS гомологов в формировании и/или дифференцировке зародышевых клеток человека, сконцентрировавшись на NANOS3. Используя ранее описанную систему дифференцировки, в которой эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) дифференцируются в адгезивный монослой в присутствии BMP4, 7 и 8b (31), мы использовали различные технологии нокаута генов, чтобы специфически сфокусироваться на функции одного гомолога, NANOS3, который продемонстрировал интригующую экспрессию мРНК и локализацию белка в ходе всего развития зародышевых клеток.
DISCUSSION
Странностью в формировании и дифференцировке зародышевых клеток у видов является консервация генов, которые кодируют компоненты зародышевой плазмы у разных видов независимо от способа спецификации зародышевых клеток. Напр., у Drosophila, разрушение генов, таких как Oskar, Vasa, Tudor, Germ cell-less и Aubergine приводит к отсутствию зародышевой линии (35). Функция этих генов связана со сборкой зародышевой плазмы, которая содержит высоко консервативные, взаимодействующие РНК-связывающие белки, такие как Pumilio и Nanos , которые, как полагают, действуют, чтобы репрессировать трансляцию и косвенно транскрипцию молчащих генов в формирующихся зародышевых клетках (35-38). У Pumilio и Nanos мутантов возникающие зародышевые клетки могут делиться преждевременно, мигрировать аномально и затем погибать во время раннего эмбрионального развития (35). Несколько лет тому назад гомологи некоторых компонентов зародышевой плазмы были идентифицированы в зародышевых клетках млекопитающих, включая таковые и у человека (24,39-44). При скрининге на белки, которые взаимодействуют с DAZ и DAZL, Moore et al. идентифицировали ряд генов, которые включали PUMILIO гомологов, PUM1 и PUM2 (39). В др. исследованиях было показано, что гомологи NANOS человека взаимодействуют с гомологами PUMILIO и экспрессируются в зародышевых клетках также (24,44). Эти взаимодействия интригующие, учитывая, что у человека делеции и варианты гомологов DAZ ассоциируют с продукцией очень немногих зародышевых клеток или с отсутствией продукции их совсем, у разнообразных модельных организмов эти гены необходимы исключительно в развитии линии зародышевых клеток (24,29,44-51). Поэтому было предположено, что белковый комплекс, содержащий гомологи DAZ, PUMILIO и NANOS у человека функционирует сходным образом в формировании и/или дифференцировке зародышевых клеток, регулируя локализацию РНК, транскрипцию, трансляцию или стабильность (39,44,52-56). Ранее было невозможно непосредственно протестировать эту гипотезу у человека. В самом деле, развитие зародышевых клеток человека остается недостаточно понятным, несмотря на тот факт, что дефекты в развитии зародышевых клеток вносят вклад в большую часть бесплодия в популяции человека (57).
Здесь мы сообщаем о нашем анализе семейства высоко консервативных белков, которые участвуют в развитии зародышевых клеток у разных видов (22,24,58). Было показано, что в ткани яичников и семенников человека NANOS3 экспрессируется в зародышевых клетках человека, при этом белок локализуется в ядре зародышевых клеток. Локализация в ядре белка NANOS3 и ко-экспрессия с известными белками зародышевых клеток BLIMP1, VASA и STELLA наблюдается также в зародышевых клетках, происходящих из hESC. Более того, мы установили, что в отсутствие NANOS3 молекулярная программа(ы), которая управляет развитием зародышевых клеток человека, нарушается, причем изменяется экспрессия генов и количественно снижается общее число зародышевых клеток активно делящихся. Все эти находки подтверждают, что NANOS3 функционирует во время развития зародышевых клеток человека клеточно-автономным способом и предоставляет первое экспериментальное прямое доказательство, что NANOS3 участвует в развитии зародышевых клеток человека. Т.о., NANOS3 является одним из только двух генов, которые, как было установлено, непосредственно участвуют в развити зародышевых клеток от мух и червей до мышей и человека (др. ген, это BOULE, член семейства DAZ генов).
Пониженные уровни мРНК NANOS3 в последующие 7 дней дифференцировки оказались неожиданными до некоторой степени, принимая во внимание, что MOs д. влиять только на уровни белка. Возможно, однако, что существует петля негативной обратной связи, так что уровни мРНК NANOS3 регулируются, исходя из уровней белка NANOS3. Альтернативно, NANOS3 мРНК может быть преобразована в белок вследствие понижения эффективности MOs после 7 дней. Учитывая, что мало известно относительно механизма регуляции экспрессии NANOS3, то это является областью будущих исследований.
Благодаря отсутствию внутренней репортерной системы, когда используются MOs, мы неспособны отследить каждую клетку, в которой уровни экспрессии NANOS3 снижены. Несмотря на эту неспособность отслеживать индивидуальные клетки в такой гетерогенной клеточной популяции, мы оказались способны количественно оценить, что меньшие количества hESCs дифференцируются в зародышевые клетки в культуре, когда экспрессия NANOS3 снижена.
Базируясь а наших данных, мы предложили модель экспрессии
NANOS3 в зародышевых клетках человека, происходящих из hESC (Fig. 6). Внутренняя клеточная масса (ICM) бластоциста человека может быть экстрагирована и одновременно с потерей позитивных и/или негативных сигналов, будет давать hESCs, которые могут поддерживаться
in vitro. ES клетки, экспрессирующие DAZL, способны дифференцироваться как в зародышевые, так и соматические клеточные клоны. При добавлении внеклеточных сигналов, PGCs могут возникать
in vitro из hESCs. PGCs экспрессируют многочисленные факторы, необходимые для развития зародышевых клеток, включая (но не ограничиваясь) VASA, STELLA и BLIMP1, и дают исключительно клон зародышевых клеток. В данном исследовании мы показали, что PGCs экспрессируют также высоко консервативный фактор зародышевых клеток NANOS3. Базируясь на наших наблюдениях, мы предположили, что подавление NANOS3 ведет к снижению экспрессии генов, необходимых для некоторых процессов, которые , в свою очередь, необходимы для развития зародышевых клеток человека, включая (i) пониженную экспрессию генов зародышевых клеток, (ii) пониженную экспрессию генов, необходимых для поддержания плюрипотентности и (iii) пониженные уровни белка DAZL. Возникающий в результате молекулярный профиль подавления зародышевых клеток в конечном итоге нарушает процесс развития зародышевых клеток человека.
Figure 6
Proposed model.
Поскольку механизм регуляции зародышевых клеток всё ещё неизвестен, то базируясь на результатах, представленных здесь, очень возможно, что NANOS3 модулирует важные аспекты развития зародышевых клеток человека вообще-то во время клеточного цикла. Более того, мы представили новое открытие, что NANOS3 локализуется в ядрах зародышевых клеток человека и может регулировать развитие зародышевых клеток человека как на уровне РНК, так и ДНК в противоположность исключительной регуляции уровня мРНК, которая описывалась ранее (32,59-61). Дальнейшие исследования специфического механизма и специфических мишеней для NANOS3 без сомнения улучшат наше знание развития зародышевых клеток человека и смогут предоставить информацию по улучшению исследований плодовитости человека, а также её лечения.
Сайт создан в системе
uCoz