Drosophila melanogaster Glial cell missing/Glial cell deficient transcription factor (Gcm/Glide, обозначаемый в тексте как Gcm) экспрессируется временно и является ключом при выборе cудьбs глии или нейронов из мультипотентных нейральных предшественников [1]-[6]. Пороговые уровни Gcm необходимы и достаточны, чтобы индуцировать глиогенез, а тонкая регуляция его экспрессии предупреждает дефектный и избыточный глиогенез [7]-[11]. Эти свойства делают Gcm идеальным инструментом для изучения клеточной дифференцировки и пластичности.

Два основных класса белков, которые модифицируют структуру хроматина и состояние конденсации, Polycomb group (PcG) и Trithorax group (TrxG), известны как критические регуляторы HOX транскрипционных факторов, действующие как молекулярные переключатели, которые поддерживают в молчащем или активном состоянии [12]. Белки PcG и TrxG действуют в виде крупных мультимерных комплексов, которые соединяются со специфическими регионами ДНК, наз. Polycomb (or Trithorax) response elements (соотв. PREs и TREs) [13]. PcG и TrxG комплексы запускают посттрансляционные модификации хвостов гистонов, которые оказывают противоположные эффекты на активность генов, в основном метилирование H3K27, индуцируемое с помощью PcG комплексов (негативная регуляция) и метилирование H3K4, H3K36, а также ацетилирование H3K27 с помощью TrxG комплексов (позитивная регуляция) ([12], [14]). PcG белки участвуют в двух основных консервативных комплексах, наз. Polycomb Repressive Complex 1 и 2 (PRC1 and PRC2). Последний формируется с помощью четырех основных компонентов, включая у мух Enhancer of zeste (E(z)), и катализирует реакцию, которая ведет к ди- и триметилированию H3K27. Эта эпигенетическая метка распознается с помощью Polycomb (Pc), который принадлежит к PRC1 комплексу.

Исследования иммунопреципитации хроматина показали, что связывание PcG и TrxG также ассоциирует с динамическим состоянием транскрипции, модулирующим разные процессы, включая митогенные пути и прогрессию от мультипотентности к дифференцировке ([12], [15]-[19] ). Понимание способа действия белков PcG и TrxG в динамическом процессе, однако, нуждаеся в анализе на уровне идентифицированных клеток и времени. Это особенно важно для онтогенетических генов, которые экспрессируются временно и в специфических популяциях клеток. Анализировали роль Pc в глиогенезе мух.

Чтобы идентифицировать компоненты и регуляторы пути Gcm, был проведен скрининг генетических модификаторов доминантного фенотипа, обусловленного эктопической экспрессией gcm и были идентифицированы белки PcG и TrxG. Важно. что мутации в компонентах PcG и в членах TrxG, обнаруживающих участие в комплексах ремоделирования хроматина, усиливали gcm доминантный фенотип, тогда как мутации в белках TrxG, известные специфическим противодействием функции PcG, восстанавливали его. Это указывает на то, что сбалансированное действие этих модификаторов хроматина регулирует функцию Gcm. Более того, мы продемонстрировали, что регуляторные последовательности gcm несут PRE и соединяются с Pc. Наконец, Pc ингибирует ауторегуляторную петлю, гарантирующую пороговые уровни Gcm [7] и , следовательно, глиогенез. Это первые прямые доказательства, что белки PcG негативно модулируют временно экспрессирующиеся детерминанты судьбы, влияя тем самым на специфические клоны в нервной система.

Discussion

Детерминация и поддержание клеточных судеб нуждаются в путях, которые тонко модулируют экспрессию генов и тем самым гарантируют собственно баланс типов клеток у метазоа. Наш скрининг и генетический анализ на модельных Drosophila представил в истинном свете роль модификатора хроматина Polycomb в генерации глиальных клеток в результате тонкого модулирования временно экспрессируемого детерминанта судьбы gcm.

A genetic screen that identifies novel gcm interactors

Генетический скрининг на сенсибилизированном фоне представляет собой чрезвычайно чувствительный инструмент, т.к. он позволяет идентифицировать некоторые гены, которые в гетерозиготном состоянии способны модифицировать сильный доминантный gcmPyx фенотип. Скрининг также указывает на функции взаимодействующих единиц, супрессоров или энхансеров данного фенотипа. Напр., sna и esg действуют как супрессоры gcmPyx, это соответствует тому факту, что gcmPyx запускает экспрессию NB-специфичных генов [20]. Идентификация interactor представляет собой исходную точку для обнаружения членов одного и того же пути, которые первоначально недооценили вообще-то из-за присутствия генов с противоположными эффектами или из-за регионов, которые не были затронуты дефицитом. В первом случае это Pc, во втором это osa и Ash1 (Figure S2). Скрининг также идентифицировал членов др. сигнальных путей (Table 1, Figure S2). Один из них зависит от Notch (N), который контролирует экспрессию gcm [20]. Поскольку мы использовали Deficiency kit, не покрывающий сам N, мы идентифицировали Suppressor of Hairless (Su(H)), который регулирует транскрипцию N мишеней, и Lethal (2) giant disc 1, который негативно регулирует трафик N рецептора [46]. Мы также тестировали и оценили генетическое взаимодействие с др. членами каскада, включая N, его лиганд Delta, и одну из его мишеней, Enhancer of split и Groucho, транскрипционный репрессор и партнер Su(H).

gcm genetically interacts with TrxG proteins

Некоторые белки TrxG действуют как генетические модификаторы фенотипа gcmPyxe. TrxG белки были первоначально идентифицированы как позитивные регуляторы HOX генов и рассматривались как противодействующие PcG. В последние годы, однако, стало ясно, что они выполняют более широкую роль в регуляции генов и стало неясно, выполняют ли они в основном функцию противодействия PcG или они более глобально контролируют экспрессию генов [12]. Интересно, что три гена для белков TrxG, которые ведут себя как позитивные регуляторы, Trx, Ash1 и dCBP, обнаруживаются в TAC и ASH1 комплексах, которые содержат гистон ацетилазную активность. Гистоновая ацетилтрансфераза dCBP, присутствующая в этих комплексах, ацетилирует H3K27, модификация, которая ассоциирована с генами мишенями для PcG, когда они активны [34]. Эта модификация несовместима с Pc зависимымt H3K27me3, поскольку эти модификации появляются в той же самой аминокислоте. Т.о., Trx- и Ash1-ассоциированная dCBP может быть ключевым игроком в противодействии зависимому от PcG молчанию гена gcm [31]. Дальнейшие исследования выяснять роль dCBP в каскаде Gcm.

osa и brm действуют как негативные регуляторы gcm. Белки TrxG могут формировать разные комплексы, которые обладают разными свойствами и в некоторых примерах репрессируют экспрессию генов. Напр., Trx и Brm, которые когда принадлежат разным молекулярным комплексам [30], действуют позитивно на HOX гены и влияют и влияют на фенотип гомеотической трансформации одинаковым способом [47], однако, Brm-содержащие комплексы вызывают репрессию транскрипции генов не HOX генов [48]. Появилось мнение, что SWI/SNF белки TrxG действуют как активаторы транскрипции или репрессоры в зависимости от временного и пространственного контекста [49]. Дальнейшие исследования определят могут ли TrxG белки действовать как негативные регуляторы gcm, репрессируя непосредственно его экспрессию или индуцируя репрессор gcm.

Pc modulates the transient expression of the fate determinant gcm

PcG белки репрессируют гомеотические гены, чтобы гарантировать поддержание состояния транскрипции и обеспечить клеточную память, которая передается через клеточные деления, в противовес способу их действия по контролю более динамических процессов, остается неясным. Мы показали in vivo, что члены PcG негативно регулируют путь gcm во время становления глиальной судьбы и пролиферации. По крайней мере, на первой ступени процесс, базирующийся на клеточной памяти, может быть исключен, т.к. Pc действует до деления GP, клетки. в которой gcm начинает экспрессироваться [41].

Метод qChIP как и экспрессия, трансфекция S2 клеток и данные по ауторегуляции строго подтверждают, что Pc непосредственно репрессирует поддержание транскрипции gcm. Кроме того, наблюдаемые фенотипы в ответ на изменения относительной доза гена показывают, что Pc и gcm д. присутствовать в соотв. пропорциях. Важность адекватного баланса между позитивными (Gcm) и негативными (Pc) факторами в становлении глиальной судьбы также подтверждается редким фенотипом, наблюдаемым на gcm-Gal4; Pc/+ фоне (1/17 wings), на котором GFP+ клетки экспрессируют Repo и Elav, указывая тем самым на промежуточное глиально/нейральное состояние (Figure 3V-3V?). Т.о., Pc действует, тонко настраивая временную экспрессию детерминанта судьбы.

Мы полагаем. что роль и способ действия факторов хроматина зависят от мишени. HOX промоторы, которые необходимы, чтобы оставаться в ON или OFF состоянии, могут использовать строгое связывание и высокое накопление хроматиновых регуляторов и некоторые исследования уже показали, что HOX активаторы коренным образом редуцируют K27me3 и также связывание белков PcG (Figure 7A) [34], [50], [51]. Более динамично экспрессируемые гены могут использовать менее строгое связывание, конфигурация, которая позволяет модифицировать экспрессию генов. С механистической точки зрения, т.к. активатор временно экспрессируемых генов исчезает, то белки PcG могут постепенно связываться с и выключать эти гены (Figure 7B), хотя мы не можем формально исключить, что белки PcG могут просто предоставлять постоянно репрессивный фон в качестве порога для активации (Figure 7C).

Figure 7 Schematic models for Pc mode of action. In line with these hypotheses, HOX and Gcm display different behaviors. A fragment of 219bp from Fab7, the classical PRE described on a HOX promoter, is sufficient to recruit PcG proteins on salivary glands [52], whereas a 2 kb gcm carrying the PRE seems very inefficient. In addition, the intensity of Pc, Ph and 'recruiters' peaks onto the gcm promoter is very low, definitely weaker compared to those found on the classical HOX PRE (Figure S8). Finally, the heterozygous Pc/+ mutation only temporarily prolongs gcm expression (Figure S5I), whereas it produces a long lasting HOX-dependent phenotype [53], [54].

Понимание точных молекулярных событий нуждается в разработке новых инструментов и в in vivo анализе организации хроматина на уровне специфических типов клеток или одиночных клеток. Наши данные тем не менее четко показывают, что Gcm и Pc конкурируют др. с др.: PcG белки связывают gcm гены, также как и repo (Figure 2, Figure S7, Figure S8) [33] и противодействуют активности Gcm. Следовательно, мы можем предположить, что Gcm вытесняет Pc с промоторов своих мишеней, включая самого себя, это могло бы объяснить, как регулятор общего хроматина наталкивается на клеточно-специфичную транскрипционную программу. У млекопитающих также было предположено, что транскрипционные факторы клеточных судеб играют роль в рекрутировании и смещении PcG, а некоторые из них, как было установлено, являются мишенями для PcG ([55] and reference therein). Наконец, 63 генов являются общими мишенями для Pc и Gcm, как было установлено при анализе сайтов связывания Pc у эмбрионов и в клеточных линиях (from [33] and [34]) и гены, позитивно регулируемые с помощью Gcm, идентифицированы при анализе микромассивов [23]. Ясно, что необходим геномный скрининг для выявления непосредственных мишеней для Gcm для подтверждения гипотезы вытеснения Pc. Эти исследования позволят также оценить, воздействуют ли PRCs на пролиферацию глии прямо или опосредованно через Gcm.

Pc represses gliogenesis

Устранение gcm-зависимого фенотипа в ответ на подавление Pc подтверждает роль этого хроматинового фактора на глиальную репрессию. Интересно, что активация или подавление Pc не продуцирует per se трансформации в противоположные судьбы (Figure S4D), скорее это модифицирует количество глии, показывая, что непосредственные уровни белка необходимы для разных процессов. У позвоночных PRC2 также участвует в продукции глиальных клеток, которые дифференцируются после волны нейрогенеза. Однако наблюдаются разные результаты в зависимости от экспериментального вклада. Livesey с сотр. ([56]) делетировали Ezh2, меняя тем самым баланс между самообновлением и дифференцировкой, и установили преждевременную дифференцировку астроцитов. Напротив, Gotoh с сотр. [57] использовали обусловленный нокаут Ezh2 и обнаружили снижение дифференцировки астроцитов. В первом случае авт. предположили, что ускорение времени нейрогенеза и ускорение начала глиогенеза вторичны по отношению к первичной функции PRC2 в клетках кортикальных предшественников. Во втором сообщении было показано, что Ezh2 репрессирует Neurogenin1, который контролирует время во время кортикогенеза и тем самым относительную продукцию нейронов и глии. Хотя эти исследования показали важность модификаторов хроматина в нервной системе, они не прояснили роль PRCs в глиогенеза. В нашем исследовании комбинированное использование чувствительных инструментов продемонстрировало, что хроматиновый фактор Pc непосредственно ингибирует глиогенез и идентифицировало gcm как основную мишень в этом пути. Хотя все полученные находки подкрепляют мнение, что определенное состояние хроматина характеризует клеточные судьбы, они также иллюстрируются низкими уровнями ацетилирования гистонов, наблюдаемыми как у мух, так и у позвоночных в глие [6], [58].