Посещений:
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ГРАДИЕНТЫ МОРФОГЕНОВ

Становление и Поддержание

How to build a robust intracellular concentration gradient
Martin Howard
Trends in Cell. Biol. Volume 22, Issue 6, June 2012, Pages 311–317 http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2012.03.002

Concentration gradients of morphogens are critical regulators of patterning in developmental biology. Increasingly, intracellular concentration gradients have also been found to orchestrate spatial organization, but inside single cells, where they regulate processes such as cell division, polarity and mitotic spindle dynamics. Here, we discuss recent progress in understanding how such intracellular gradients can be built robustly. We focus particularly on the Pom1p gradient in fission yeast, elucidating how various buffering mechanisms operate to ensure precise gradient formation. In this case, a systems-level understanding of the entire mechanism of precise gradient construction is now within reach, with important implications for gradients in both intracellular and developmental contexts.
Концепция концентрационного градиента важна для объяснения как развитие регулируется пространственно 1-6. Обычно пространственно варьирующие концентрации морфогенетического белка управляют пространственно отличающейся экспрессией генов посредством механизма порогов концентраций, при этом концентрации морфогена выше определенного порога могут, напр., активирует экспрессию специфического гена. Т.о., постоянно меняющаяся концентрация в пространстве м. превращать в территории с определенным паттерном генной экспрессии.
Классические морфогены часто действуют на относительно длинные расстояния; интенсивно исследованный морфоген Bicoid, важный для спецификации передних судеб клеток у ранних эмбрионов Drosophila , распространяется на сотни микронов от своего переднего источника [7]. Несколько короче шкала длины морфогена Decapentaplegic (Dpp), распространяется на десятки микронов прочь от границы между передним и задним компартментом в центре крылового имагинального диска Drosophila8,9. В обоих случаях градиенты перекрывают многие клетки (или ядра для Bicoid в синцитиальной бластодерме), генерируя дальнодействующий паттерн формирующий потенциал. Механизм формирования этих градиентов, как полагают, использует локальную продукцию белка, сопровождаемую эффективной диффузией прочь от источника и затем в конечном итоге деградация (Box 1). Система Bicoid в основном подтверждает этот механизм; хотя лежащий в основе пространственный градиент мРНК bicoid вносит вклад в градиент белка Bicoid, перемещение белка также необходимо10,11. Для Dpp, хотя система управляется с помощью эффективного диффузионного транспорта на более длинную шкалу длины, механизм перемещения морфогена по более короткой шкале всё ещё спорный [12].

Box 1. Making a simple concentration gradient Morphogen gradients in a developmental biology context often rely on local protein production, followed by diffusion and eventual degradation. The symmetry breaking necessary for gradient formation therefore relies on a localized source, which can be provided by previous localization of morphogen mRNA. Provided each morphogen protein is degraded independently at a constant rate, a simple mathematical analysis reveals a concentration profile that decays exponentially with distance from the (planar) source. The decay length of the gradient (the distance over which it decays to 1/e of its highest value) has also been measured in several cases (and is approximately 100 µm for Bicoid and 20 µm for Dpp). Modulating the decay process can produce qualitatively different gradient shapes; for example, if a dimerization reaction is required for decay (an example of self-enhanced degradation), a power law decay results at large distances. In this case, at large distances from a planar source, the concentration decays with distance as 1/(distance)a, where a is equal to two for the dimerization reaction.
Относительно внутриклеточного контекста возникает вопрос, достаточно ли клетка велика для поддержания внутриклеточного градиента или будут ли внутренние концентрации обязательно гомогенными. Молекулы с диффузионной константой D и временем жизни T, должна обычно перемещаться на расстояние порядка длины распада d α v- (DT) прежде чем окажется деградированной. Для диффузионной константы прядка D ~ 1 µm2s-1, а продолжительность жизни белка составлять часы, характерная длина распада (decay length) d должна быть значительно больше, чем типичные клеточные измерения. Однако отличительным свойством белкового градиента может быть модификация белка; напр., с помощью фосфорилирования. В этом случае эффективным временем жизни белка с соотв. модификацией может быть значительно короче. Напр., белок может быть дефосфорилирован в то самое время, как только оказывается локализованным в специфическом месте внутри клетки (как в случае Pom1p у делящихся дрожжей). Белок может затем диффундировать прочь , т.к. становится постоянным объектом попыток фосфорилирования. Если последний процесс происходит на временной шкале приблизительно в 1 s, с D ~ 1 µm2s-1, то будет возникать градиент с типичным d порядка 1 µm, это достоверно меньше, чем типичный размер эукариотической клетки и сравним с размером бактерии. Следовательно, внутриклеточные градиенты не только возможны, но и могут быть ожидаемы почти повсеместно. Будучи фосфорилированным, градиентный белок может затем подвергаться рециклингу и повторно использоваться в градиенте, это значительно более энергетически эффективный механизм поддержания градиента, чем быстрая деградация в комбинации с повторными синтезом белка.


Исследования последних лет показали, что концентрационные градиенты не принадлежат исключительно биологии развития, но могут также выполнять критическую роль в пространственной организации внутри одиночной клетки13-17. Brown and Kholodenko показали теоретически, что концентрационные градиенты могут существовать внутри индивидуальной клетки с соотв. биофизическими параметрами [13]. Следовательно, индивидуальные клетки не столь малы, чтобы гомогенные концентрации были неизбежны (Box 1). Т.к. затем, были выявлены разные градиенты в зависимости от хозяина, в зависимости от регуляторов клеточного деления18,19 и детерминант клеточной судьбы20,21 до организаторов клеточного веретена22-24. Даже некоторые самые мельчайшие бактериальные клетки содержат градиенты с протяженностью в пространстве лишь около микрона25,26. Существует важное отличие между внутриклеточными градиентами и их онтогенетическими кузенами: это роль деградации. В развивающихся системах морфогенетический белок обычно деградирует27,28 и это вместе с диффузией, как полагают, ответственно за снижение концентрации морфогена как функции расстояния от источника. Во внутриклеточных системах время жизни, необходимое для этого механизма, чтобы генерировать имеющий значение градиент, слишком коротко, чтобы быть реалистичным (Box 1). Вместо этого, обычно имеет место модификация белка (напр., его статус фосфорилирования), которая модулируется как часть градиента. Таким образом, типичный белок с продолжительностью жизни в часы или более потенциально может участвовать в формировании (phospho-)градиента в течение более длительного времени до своей деградации (Box 1).

Making development precise


Изучение морфогенетических градиентов недавно возобновлено с особым вниманием на шумы и точность15,29-32. Все биологические системы неминуемо содержат источники шумов, которые могут в принципе испортить способность системы генерировать надежные результаты. Шумы грубо могут быть подразделены на два класса: внешние и внутренние. Здесь внешние шумы означают флюктуации от одного градиента к др. в двух разных клетках или эмбрионах (Figure 1a). Это может возникать, напр., из-за разных количеств мРНК у разных эмбрионов, это ведет к разным профилям градиентов. Внутренние шумы означают прирожденные флюктуации даже внутри одной копии градиента (Figure 1b). В последнем случае шумы возникают из-за неизбежных биохимических флюктуаций прирожденных для процессов, таких как диффузия, которая необходима для становления градиента (Box 2) и которая будет особенно преобладать при низких количествах копий молекул. Флюктуации, как внешние, так и внутренние, д. снижать точность позиционной информации, предоставляемой градиентом (Figure 1).

Figure 1. Extrinsic and intrinsic noise both affect the precision of the positional information provided by concentration gradients. (a) Extrinsic noise in the morphogen production rate leads to a varying profile from one gradient to another. Variation in the position at which the gradient concentration drops through a critical level (PT) leads to imprecision in the specification of position XT. (b) Similarly, intrinsic noise within a single gradient also leads to imprecise positional information.



Box 2. Intrinsic fluctuations in gradient formation Intrinsic fluctuations inevitably reduce the precision of the positional information provided by a gradient. When the gradient concentration is measured in a detector volume, the number of gradient molecules present will fluctuate. Indeed, at a particular instant there could be no gradient molecules at all within the target volume. The detector will then have to wait for the noisy arrival of gradient molecules by diffusion before reliable measurement becomes possible. This effect is largest at low concentrations of gradient molecules, but can be large at surprisingly high concentrations if the measuring volume is small. Small effective measuring volumes are likely to be common for morphogens that act as transcription factors (even if the morphogen transcription factor attempts to increase the effective target size by diffusing in one dimension along the DNA [64]). Morphogens that bind to receptors covering an entire cell surface, however, will have much larger measuring volumes, meaning that intrinsic noise is likely to be small. To determine the quantitative importance of intrinsic noise for precision, a theoretical analysis is essential. If the dominant source of fluctuations is diffusion, the variance in the number of molecules in the detector volume will simply be equal to the mean. However, time-averaging will reduce these fluctuations by an amount that depends on the length of the time-averaging period. Essentially, after time averaging for a period t, the noise will be reduced by an amount proportional to v(t/t0), with a characteristic timescale, t0, set by the magnitude of the gradient molecule diffusion constant and the physical size of the detector. Reduction by the square root of the time-averaging period follows for the same statistical reasoning that the error of the mean in any series of measurements decreases essentially according to the square root of the number of independent measurements.


Возможны различные механизмы для глушения (buffer) этих источников шумов, тем самым увеличивается точность возникающей в результат позиционной информации. Усреднение во времени безусловно снижает позиционные ошибки, вносимые внутренними флюктуациями15,31 (Box 2), также может и пространственное усреднение считываемого градиента предоставляться с помощью соседних клеток или ядер в контексте биологии развития31,33. Временное усреднение осуществляется с помощью нижестоящей сети, преобразующей сигналы, с временной шкалой, детерминируемой с помощью времени жизни транскриптов и/или белков генов мишеней (напр., для Bicoid, это может быть временем жизни продуктов гена мишени hunchback). Внешние шумы могут быть снижены путем изменения процесса деградации, участвующего в удалении белка морфогена, изменяя тем самым форму градиента (see [34] и [29] for alternative methods).Напр., было продемонстрировано, что морфогены усиливающие свою деградацию, обнаруживают на длинных дистанциях профили, которые распадаются по экспоненциальному закону (Box 1) [32]. Теоретический анализ показал, что такие профили могут в принципе лучше глушить внешние шумы в скорости продукции морфогена по сравнению с профилями со стандартной (т.e. линейной) деградацией морфогена, которые создают профиль экспоненциального распада. В целом, если внешние флюктуации скорости продукции морфогена, так и внутренние флюктуации нуждаются буферизации, то форма градиента, которая делает максимальной точность, зависит от того, какой из источников шума наиболее важен [35]. Профиль экспоненциальной зависимости в принципе лучше для системы с доминирующими внешними шумами продукции морфогена (as expected from [32]), прямолинейные профили для внутренних шумов, а экспоненциальные профили для систем, где оба типа шумов важны35,36.
Пока такого типа анализ в основном применялся к системам онтогенетических морфогенов.

The intracellular Pom1p gradient in fission yeast


Одним из наиболее хорошо изученных внутриклеточных градиентов является таковой для Dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase (DYRK) Pom1p внутри делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe[37]. Pom1p образует кортикальный градиент с [18] (Figure 2a). Детальные изображения продемонстрировали, что профиль Pom1p обнаруживает крупные динамические флюктуации (Figure 2b). Градиент Pom1p, как полагают, выполняет множественные важные роли, регулируя полярность клетки, контролируя длину клетки38-40 и определяя плоскость деления клетки18, 19, 37,41. В частности, Pom1p, как полагают, негативно регулирует митотический активатор Cdr2p, который на кортексе расположен в центре клетки. Когда клетка растет, то концентрация Pom1p в центре клетки, как полагают, снижается при этом активируется Cdr2p и это позволяет клетке увязывать клеточный размер с клеточным циклом38,39. Более того, средина клетки это место локализации место фактора цитокинеза Mid1p, ответственного за позиционирование места деления, он также, как полагают, регулируется с помощью Pom1p18,19. Эти биологические функции интесивно исследовали в последнее время42-44. Мы рассмотрим механизмы собственно формирования самого градиента. В частности, мы рассмотрим, как эти механизмы могут глушить флюктуации, предоставляя точную позиционную информацию15,45.

Figure 2. Pom1p forms a noisy cortical gradient. (a) Confocal image of wild-type fission yeast cells expressing pom1-tomato in the medial focal plane (scale bar, 2 µm). (b) Four separately normalized pom1p cortical intensity profiles from 0.5 s exposures taken 15 s apart in the same cell. d is the distance measured along the membrane from a cell tip. Image and data reproduced from [57].

Кортикальный градиент Pom1p генерируется с помощью локального связывания Pom1p на кончиках клетки, это сопровождается его распространением по мембране с помощью диффузии, сопровождается с помощью membrane unbinding. Цикл фосфорилирования Pom1p лежит в основе этих событий ( Box 1) [46]. Когда Pom1p доставляется на кончик клетки он дефосфорилируется, этот процесс усиливает его сродство к клеточной мембране. Соединившись с мембраной, Pom1p, как полагают, подвергается автофосфорилированию. Этот процесс снижает сродство белка к мембране, что в конечном итоге ведет к отсоединению от мембраны. Затем Pom1p может диффундировать в цитоплазму прежде чем будет преобразован в кортикальный градиент путем повторного связывания с регионами кончиков клетки, где он снова дефосфорилируется. В соответствии с этой общей картиной, kinase-dead версия Pom1p располагается более широко по периферии клетки46,47, при этом роли аутофосфорилирования благоприятствует неспособность дикого типа Pom1p восстанавливать локализацию неактивного Pom1p [46].

Precise polar binding through self-focusing


Доставка на полюса Pom1p диктуется частично динамическими свойствами микротрубочек, а также общей палочковидной геометрией клеток делящихся дрожжей. Зарождающиеся микротрубочки первоначально стремятся расти в случайных направлениях перед установлением контакта краями клетки, затем скользя вдоль них в конечном итоге они ориентируются вдоль длинной оси клетки [48]. Белок Tea1p затем доставляется на концы клетки посредством системы доставки, базирующейся на микротрубочках; он располагается на растущих плюс концах микротрубочек и высвобождается, когда концы микротрубочек достигают кончика клетки49,50. Tea4p локализуется сходным образом, но зависит от Tea1p51,52. Собственно мембранная доставка Pom1p, как полагают, зависит от локализации на кончике клетки как Tea1p, так и Tea4p. В tea4? клетках, Pom1p неспособен локализоваться в кортексе, а в tea1? клетках, Tea4p не локализуется в кортексе, а Pom1p обнаруживает слабый униформный паттерн кортикальной локализации [18]. Более того, Tea4p как непосредственно взаимодействует с Pom1p (in two-hybrid assays) , так и рекрутирует фосфатазу Dis2p на кончики клетки46,53. Dis2p может дефосфорилировать Pom1p, тем самым помогая связыванию с мембраной Pom1p, как было описано выше [46]. Т.о., программа microtubule/Tea1p/Tea4p/Dis2p преимущественно доставляет Pom1p на кончики клетки (Figure 3a).

Figure 3. Tea1p/Mod5p/microtubule module ensuring precise binding of Pom1p at cell tips. (a) The rod-shaped cell ensures that most microtubule tips grow until they are close to the cell ends, where Tea1p is deposited. Occasional contact between short microtubules and non-polar membranes will inevitably occur, however, and could, without additional measures, lead to inappropriate Tea1p localization. (b) Schematic illustration of the autocatalytic self-focusing mechanism for Tea1p, which ensures more precise Tea1p polar localization than specified by its membrane input distribution. Curved solid blue arrow represents autocatalytic amplification of Tea1p mediated by Mod5p; dotted green arrow represents spreading of Tea1p by diffusion followed by membrane unbinding.

Изредка, однако, микротрубочки (особенно короткие) всё ещё остаются в контакте с мембраной в регионах не полюсов (Figure 3a). Это может запускать несоотв. локализацию Tea1p/Tea4p/Dis2p вызывать связывание Pom1p с несоотв. местами. Следовательно, помимо механизма доставки существует защита от этой возможности, включая как Tea1p, так и др. кончиковый регулятор, наз. Mod5p54-56. Закрепление Tea1p на кончиках клетки зависит от Mod5p, и vice versa. Поэтому одной из возможных гипотез является то, что Tea1p/Mod5p участвует в петле позитивной обратной связи, чтобы сделать более точной локализацию Tea1p на концах клетки. Дальнейшее подтверждение этой идеи предоставлено [54]. Простая потенциальная модель локализации Tea1p заключается в том, что Mod5p действует как молекулярный 'клей', чтобы удерживать Tea1p на кончиках клетки, при этом комплекс Tea1p-Mod5p д. оставаться относительно неподвижным. В этой модели, Tea1p и Mod5p д. иметь идентичные константы диффузии, как часть такого комплекса. Однако, fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) измерения, сделанные с помощью обесцвечивания половины кончика клетки, показали, что Tea1p и Mod5p имеют определенно разную динамику, при этом Tea1p восстанавливается после 5 мин в противоположность 50% восстановлению для Mod5p. Этот результат делает механизм простого связывания лиганд-рецептор маловероятным. Вместо этого было предположено, что Tea1p формирует полимерную сеть на кончиках клетки с включениями дополнительных Tea1p, обеспечиваемое с помощью Mod5p, и аутокаталитически усиливаемое существованием полимерного Tea1p (Figure 3b) [54]. Поскольку Mod5p, как полагают, быстро ассоциирует и диссоциирует от Tea1p полимерной сети, эта модель может объяснить быструю half-tip FRAP динамику Mod5p по сравнению с Tea1p, при этом диффузия Tea1p очень медленная, если он полимеризован.
Хотя многие из микроскопических свойств представленной выше модели не были протестированы непосредственно, некоторые косвенные предсказания были проверены [54]. Чтобы сформировать сеть в двухмерной области, Tea1p д. обладать локальной возможностью соединения из трех или выше. В соответствии с этим рассуждением, мутирование региона Tea1p, который как предсказывается формирует тримерные двуспирально закрученные мутантные Tea1p, неспособные накапливаться на кончиках клетки, несмотря на то, что аккуратно доставляются с помощью микротрубочек и взаимодействуют с Mod5p.
Также важна модель self-focusing свойств; эта модель предсказывает, что устойчивое распределение Tea1p на кончиках клетки д. быть значительно уже, чем пространственное распределение мест отложения Tea1p микротрубочками, благодаря аутокаталитическому умножению. Это в самом деле так. Умножение, как полагают, увеличивает концентрацию Tea1p вблизи самых краев кончиков до тех пор, пока такие пики оказываются сбалансированы притоком извне диффузией полимерных Tea1p вдоль мембраны и возможно несвязанного Tea1p. Этот механизм предоставляет простой способ коррекции любого потенциального не связанного с полюсом отложения Tea1p. В этом случае локальная концентрация Tea1p д. быть слишком низкой, чтобы запустить аутокаталитическое увеличение; вместо этого, Tea1p будет быстро подвергаться рециклингу обратно в цитоплазму, где он сможет опять быть отправлен в кончики клетки. Следовательно, механизм само-фокусиования делает возможным связывание с мембраной Tea1p, чтобы оказаться более тесно локализованным на кончиках клетки. Поскольку Tea4p в точности локализуется совместно с Tea1p[51], то это гарантирует узкое пространственное окно для связывания с мембраной Pom1p и т.о. для становления более точного нижестоящего градиента Pom1p (Figure 3b). Tea1p однако часто распределяется на кониках клетки как множественные дискретные точки скорее, чем одиночная полимерная структура. Пока неясно, как это наблюдение может повлиять на модель само-фокусирования.

How spreading can buffer noise


Оказавшись на мембране, используется простой механизм для формирования градиента с использованием диффузии кортикального Pom1p, при этом аутофосфорилирование Pom1p в конечном счете ведет к потере связи [46]. FRAP эксперименты на половинках кончиков клеток предоставили доказательства транспорта из одной половинки кончика в другую того же самого конца клетки46,57. Более того, формирование градиента, по-видимому, не затрагивается существенно цитоскелетными или эндоцитотическими нарушениями [57]. Эти результаты полностью согласуются с диффузией, как доминирующим механизмом транспорта кортикального Pom1p, который распределяется по мембране за пределами региона, оккупируемого его вышестоящими поставщиками (recruiters) Tea1p/Tea4p 46,57. Эти и др. FRAP результаты показывают, что средняя константа диффузии Pom1p равная приблизительно 0.1 µm2s-1 с продолжительностью жизни мембраны примерно в 30 s [57]. Используя рассуждения, приведенные выше (Box 1), эти параметры могут безусловно генерировать функциональный внутриклеточный градиент в клетках делящихся дрожжей (которые обычно длиной в 9-14 µm).
Однако конфокальные изображения срезов кортекса клеток делящихся дрожжей выявили неожиданный уровень сложности для Pom1p мембранной динамики [57]. Интересно, что на time lapse изображениях, Pom1p обнаруживается в кластерах, которые, по-видимому, увеличиваются и сжимаются стохастически на временно шкале в несколько секунд - значительно более быстро чем время покоя всей мембраны приблизительно в 30 s. Более того, отслеживание кластеров (также как измерения с помощью fluorescent correlation spectroscopy) дают константу диффузии кластеров значительно меньшую, чем это предполагалось при half-tip FRAP. Эти результаты позволили выдвинуть модель двух состояний динамики для Pom1p, при этом Pom1p существует или в более быстро диффундирующем, потенциально мономерном состоянии или в виде медленно диффундирующих кластеров (Figure 4a)[57]. Медленно диффундирующие кластеры могут абсорбировать быстро диффундирующие Pom1p посредством столкновений, но являются нестабильными и м. в принципе дезинтегрировать. Математическое моделирование этих процессов (с нелинейной агрегацией кластеров) позволило сделать неожиданное предсказание; а именно, что пик кортикальной концентрации Pom1p и длина распада (decay length) градиента д. быть скоррелированы отрицательно. Это заключение следует из того, что более высокие уровни Pom1p дают больше кластеров и, следовательно, в целом более медленную диффузию, тем самым снижая длину распада, тогда как более низкие уровни Pom1p ведут к меньшему числу кластеров и более быстрой диффузии, увеличивают длину распада. Отрицательная корреляция сохраняется даже когда собранный в кластеры Pom1p не может отсоединиться от мембраны, тем самым эффективно снижается скорость отсоединения от мембраны Pom1p. Принимая внешние вариации всех модельных параметров, отрицательная корреляция обычно не возникает в простых линейных моделях единичного состояния, в противоположность модели двух состояний. Измерения in vivo концентраций и длин распада выявили явную анти-корреляцию, прекрасно согласующуюся с предсказаниями модели двух состояний.

Figure 4. Pom1p exhibits dynamical clustering. (a) Schematic illustration of Pom1p clustering dynamics, showing average Pom1p cortical gradient close to a cell tip, as well as detailed Pom1p cluster aggregation/disintegration dynamics. Note that the fast-diffusing species need not necessarily be monomeric. All arrows represent fast diffusive motion, but only the green/red arrows correspond additionally to cluster aggregation/disintegration dynamics. (b) Diagram showing how an anti-correlation between peak Pom1p cortical concentration and decay length can reduce extrinsic fluctuations in Pom1p concentration.

Как проиллюстрировано схематически на (Figure 4b), представленный выше механизм свойств глушения шумов, смягчен против эффектов изменчивости концентраций Pom1p на кончиках. В самом деле, измерения показали, что анти-корреляция д. уменьшать внешние флюктуации на 40% [57]. Как столь замысловатая динамика кортикального Pom1p согласуется с его фосфорилированием пока неясно, однако происходящее образование кластеров не зависит Pom1p киназной активности [57]. Более того, предположения модели двух состояний довольно сырые. Хотя она и содержит важную концепцию и предоставляет поддающиеся проверке предсказания, в действительности, по-видимому, всё сложнее, при этом кластеры Pom1p представлены множеством разных размеров (скорее, чем только двумя ) и варьирующими биофизическими свойствами.

Quantifying and reducing intrinsic noise


Внутриклеточные концентрационные градиенты безусловно являются объектами внутренних шумов, возникающих из прирожденной стохастичности биохимических процессов, которые и дают градиент. В частности, чтобы измерить концентрационный градиент по детектору, молекулы градиента должны, прежде всего, доставляться с помощью диффузии. Этот процесс перемещения высоко стохастичен58,59 и поэтому накладываются физические ограничения на точность позиционной информации15,31 (Box 2). Однако эти флюктуации могут быть редуцированы с помощью временного усреднения (time-averaging) измеряемого сигнала на таких детекторах. Таким образом, внутренние (но не внешние) флюктуации может быть уменьшены (Box 2). В случае Bicoid, эффекты внутренних шумов были тщательно проанализированы и теоретически временное- (и пространственное) усреднение может снижать относительные внутренние шумы в градиенте до 10% в течение минут (значительно меньше периода одиночного ядерного цикла) [31]. Для системы Bicoid точность ограничена редкими, стохастически прибывающими молекулами Bicoid в их детектор: т.е. промотор его нижестоящей мишени, ген hunchback.
В случае Pom1p, точность, с которой градиент может быть считан, опять же определяется шумом прибытия Pom1p молекул на нижестоящие 'детекторы'. Эти детекторы могут включать, напр., молекулы протеин киназы Cdr2p, активатора вступления в митоз, который негативно регулируется с помощью Pom1p. Хотя влияние этих флюктуаций на точность внутриклеточного градиента рассмотрена теоретически15,45, вплоть до недавнего времени не было прямых экспериментальных измерений уровня внутренних шумов и степени, с которой временное усреднение может редуцировать их во внутриклеточной градиентной системе. Такие измерения были осуществлены недавно для Pom1p (который присутствует в числе копий приблизительно 5000 на клетку) и показали, что внутренние шумы могут быть значительны, особенно вдали от кончиков [57]. Однако временное усреднение по 30 s снижало внутренний шум в градиенте Pom1p до значительно более низких уровней (ниже во всех местах, чем при межклеточной вариации). Интересно, что потенциальные нижестоящие мишени для Pom1p, в частности Cdr2p, имеют довольно продолжительное мембранное время покоя (приблизительно 90 s или более) и могут поэтому интегрировать уровни Pom1p в течение этого времени, существенно редуцируя внутренние шумы [57].
В целом, внутренние флюктуации закладывают физические ограничения точности любого процесса сигнальной трансдукции [58], точности систем, базирующихся на градиенте. Количественный анализ является жизненно важным для определения, может ли сигнальная система давать реальные результаты15,31,45.

Lessons from a robust intracellular gradient


Как мы видели, множественные механизмы используются для гарантии, чтобы градиент Pom1p мог передавать реальную позиционную информацию. Мультидисциплинарные подходы, используемые как клеточной биологией, так математическим моделированием, оказались способными выявить существенные детали с почти полным пониманием системного уровня всего градиент-формирующего механизма, теперь доступны18,46,48,54,57. Многочисленные уроки могут быть получены с помощью этих подходов. Вообще-то наиболее важно то, что динамика биологических градиентов может быть существенно сложнее, чем часто представляют. Напр., динамика градиента Pom1p использует не только локальное связывание, диффузию и затем диссоциацию, но и также замысловатую и новую само-фокусирующуся и образующую кластеры динамику. Более того, эти новые механизмы могут иметь большое значение для систем развития. Напр., ничто в динамике механизма образования кластеров не является специфическим только для системы Pom1p. В самом деле, результат механизма образования кластеров - анти-корреляция между пиком концентрации и его decay length - наблюдается также в системе Bicoid, хотя источник этого пока необъясним36,60. Было бы интересно посмотреть, обладают ли др. внутриклеточные градиенты также механизмами снижения шумов или Pom1p является исключением в этом ряду. Сегодня разумно сказать, что др. внутриклеточные градиенты не исследованы с достаточной глубиной, чтобы ответить на этот ворпос. В частности, интересным примером может быть внутриклеточный градиент детерминанта клеточной судьбы MEX-5 у одноклеточного эмбриона Caenorhabditis elegans20,21. Этот градиент также проявляет сложное поведение, тем, что формирование градиента в целом зависит от фосфорилирования MEX-5, изменяющего его константу эффективной диффузии14,21. Наконец, градиент-формирующий и гасящий шумы механизмы, обсуждаемые в этом обзоре, интересные с точки зрения воссоздания in vitro динамики бактериальных Min белков, которые регулируют позиционирование клеточного деления у Escherichia coli61-63. Воссоздание in vitro в качестве первой ступени контрольного механизма с использованием системы Pom1p в конечном счете д. сформировать пригодный инструмент для точного позиционирования в контексте синтетической биологии.
Сайт создан в системе uCoz