Гибель механосенсорных волосковых клеток является ведущей причиной нарушений слуха и баланса в популяциях людей. Волосковые клетки чрезвычайно чувствительны к средовым воздействиям, таким как избыточные шумы и действие некоторых терапевтических лекарств. Однако индивидуальные реакции на повреждающие агенты могут варьировать частично из-за генетических различий. Ранее нами проводился прогрессивный генетический скрининг с использование системы боковой линии рыбок данио для идентификации мутаций, изменяющих реакции личиночных волосковых клеток на антибиотик неомицин, один из классов aminoglycoside соединений, который вызывает гибель волосковых клеток у человека.
Аминогликозидные антибиотики структурно родственные соединения, которые включают семейство лекарств, таких как neomycin, kanamycin, gentamicin, и streptomycin. Аминогликозиды постоянно используются для лечения грамм-отрицательных бактериальных инфекций и некоторых грамм-положительных и микобактериальных инфекций (напр. M. tuberculosis). Первое клиническое использование аминогликозидов, стрептомицина в 1944, сопровождалось вскоре сообщениями об ототоксичности и нефротоксичности [1]. Потеря слуха после приёма аминогликозида происходит в основном за счет гибели механосенсорных волосковых клеток внутреннего уха - клеток, которые первыми превращают изменения давление жидкости, генерируемые звуками, в синаптическую активность. Нефротоксичность возникает в результате гибели эпителия проксимальных почечных канальцев [2]. Кроме того, аминогликозидом индуцированная гибель волосковых клеток в вестибулярной системе вызывает нарушения баланса [3]. Хотя многочисленные естественные и синтетические аминогликозиды были идентифицированы, все они ассоциируют с серьёзным риском потери слуха [4]-[7]. Несмотря на эти противопоказания и несмотря на отсутствие фармацевтического вмешательства по предупреждению ототоксичности, aminoglycoside антибиотики продолжают использоваться сегодня как эффективные лекарства против угрожающих жизни инфекций. Если токсичность аминогликозидов на волосковые клетки и проксимальные канальцы почек будет блокирована или ослаблена, то это существенно улучшит эффективность и надежность терапии аминогликозидами [8].
Чтобы идентифицировать генетические факторы, которые контролируют чувствительность волосковых клеток к воздействию аминогликозидов и найти генетические кандидаты мишени для лекарства, которое будет блокировать ототоксические эффекты аминогликозидов, мы разработали генетический скрининг для модуляции токсичности аминогликозидов на волосковые клетки у рыбок данио [9]. Рыбки данио (Danio rerio), подобно большинству водных позвоночных имеют волосковые клетки на своей поверхности в структурах, наз. neuromasts [10]-[12], и поэтому представляют собой подходящую модель для изучения гибели волосковых клеток. Эти наружные волосковые клетки являются частью боковой линии, сенсорной системы, используемой рыбами и амфибиями для детекции движений в окружающей воде [13], [14]. Поверхностные волосковые клетки боковой линии структурно и функционально сходны с волосковыми клетками млекопитающих и легко обнаруживаются и отслеживаются [15]. Мы оценивали чувствительность волосковых клеток боковой линии к воздействию аминогликозидами lс помощью F3 forward генетического скрининга и выявили мутантных рыбок данио, которые сохраняли свои волосковые клетки после экспозиции неомицина [9].
Было установлено, что мутация
persephone обеспечивает резистентность к aminoglycosides. 5 dpf гомозиготные
persephone мутанты неотличимы от дикого типа братьев сестер, но отличаются своим сохранением волосковых клеток боковой линии в ответ на воздействие неомицина. Мутация
persephone картируется в chloride/bicarbonate обменнике slc4a1b и связана с одиночной заменой Ser-to-Phe в zSlc4a1b. Эта мутация предупреждает высвобождение обменника на клеточной поверхности и устраняет способность белка импортировать хлорид через плазматическую мембрану. Мы показали, что миссенс мутация в
slc4a1b вызывает неспособность белка поставляться в плазматическую мембрану и как следствие потеря активности обменника. Потеря функции zSlc4a1b снижает гибель волосковых клеток, вызываемую воздействием аминогликозидов neomycin, kanamycin и gentamicin и химиотерапевтического лекарства cisplatin. Фармакологический блок транспорта анионов с disulfonic stilbene производными DIDS и SITS, или воздействие экзогенным bicarbonate, также защищает волосковые клетки от повреждений. Как
persephone мутанты, так и обработанные DIDS личинки дикого типа снижают потребление меченных аминогликозидов. Предполагается, что сильная регуляция ионного окружения сенсорных волосковых клеток, обеспечиваемая с помощью активности zSlc4a1b, является критической для их чувствительности к аминогликозидным антибиотикам.
Мутанты
persephone обнаруживают также снижение потребления FM1-43, указывая на потенциальное влияние с механотрансдукцией связанной активности у мутантов. Было показано, что защита, обеспечиваемая потерей bicarbonate/chloride обменника, скорее всего, отражает снижение поступления аминогликозида в волосковые клетки и это потенциально влияет на снижение механотрансдукционной активности у мутантов.
Discussion
Хотя аминогликозидные антибиотики эффективны против системных инфекций, ассоциированный риск гибели волосковых клеток представляет существенное препятствие для их клинического использования. Мы идентифицировали persephone мутантов с супрессией гибели волосковых клеток боковой линии, вызываемой применением аминогликозида у личинок рыбок данио [9]. Ген slc4a1b кодирует обменник chloride/bicarbonate анионов. Мутация приводит к миссенс замене, которая устраняет функцию транспорта хлорида обменника. Фармакологическое ингибирование белков семейства SLC4 или обработка повышенными концентрациями bicarbonate (субстрата Slc4a1b) защищает волосковые клетки у рыб дикого типа. У persephone и в условиях, которые воспроизводят мутантный фенотип, поступление аминогликозида снижено. Это снижение поступления аминогликозида может быть следствием снижения mechanotransduction (MET) активности; FM1-43 мечение, используемое для выявления MET активности [37], [38], достоверно снижено у мутантов persephone. Т.к. мы не можем исключить, что ингибиторы активности SLC4 (DIDS и SITS) могут иметь взаимодействия с др. каналами, наши данные подтверждают, что имеются, скорее всего, градиенты анионов, регулируемые с помощью Slc4a1b, которые, в свою очередь, регулируют поступление аминогликозида в волосковые клетки боковой линии. Более того, эта регуляция может действовать посредством эффектов на канал механотрансдукции.
У рыбок данио Slc4a1b является членом семейства Slc4 транспортеров анионов, которые повсеместны у эукариот и экспрессируются время от времени у морских бактерий [21], [39]. Slc4a1b рыбок данио наиболее близок к Na+ независимым, электронейтральным chloride/bicarbonate обменникам SLC4A1, SLC4A2 и SLC4A3, которые регулируют внутриклеточный bicarbonate и chloride для буфферизации pHi, осмотического контроля и регуляции клеточного размера [25], [40]. Клеточно-специфические функции SLC4A1 включают дистальную мочевую ацидификацию и резорбцию bicarbonate интеркалированными клетками почечных собирающих канальцев Type A [26]. В желудочных париетальных клетках, SLC4A2 способствует секреции желудочной кислоты посредством базолатерального притока хлоридов и оттока бикарбонатов [41]. В нейронах SLC4A3 влияет на электрохимический потенциал посредством обмена хлоридов, что в свою очередь влияет на возбудимость нервов [42]-[45]. Мутации в SLC4 классе обменников ассоциированы с некоторыми болезнями человека: наследственной spherocytic анемией, наследственной overhydrated stomatocytic анемией и с distal renal tubular acidosis (dRTA) [28], [46]. Хотя нейросенсорный слух сохраняется у пациентов с dRTA, это чаще всего наблюдается у пациентов с мутациями в др. генах [47].
Несколько исследований описывают экспрессию белков семейства SLC4 в улитке млекопитающих [48]. SLC4A2 (AE2)был обнаружен во внутреннем ухе морских свинок и может играть роль в поддержании pH эндолимфы [48]. AE2 может также участвовать в регуляции ригидности наружных волосковых клеток. Однако это скорее всего за счет его функции связывания плазматической мембраны и цитоскелетных элементов скорее, чем активности по обмену анионами [49]. У рыбок данио, Slc4a1b строго экспрессируется в ионоцитах кожи, которые регулируют баланс соли и pH, в особенности в подтипе HR (H+ ATPase-rich) ионоцитов [21]. Эти ионоциты поддерживают гомеостаз pH путем секреции кислоты с поверхности рыб [50]. Поскольку slc4a1b обнаруживает широкую экспрессию, локус его действия в отношении функции волосковых клеток предстоит определить.
Благодаря описанным активностям Slc4a1b может широко влиять на физиологические и внутриклеточные процессы, пока неясно, как в точности потеря его активности защищает волосковые клетки боковой линии от воздействия аминогликозидов. Разумно предположить, что мутанты persephone изменяют внутриклеточные условия в волосковых клетках боковой линии, которые снижают токсичность аминокликозидов. Предыдущие исследования показали, что protonation аминогрупп аминогликозида является критической для соединения аминогликозида с рибосомальной РНК и др. макромолекулярными мишенями [51], [52]. Однако pKa gentamicin является 8.2. Без тяжело нарушенного внутриклеточного pH, вряд ли этот механизм является основным способом защиты у persephone. Измененный внутриклеточный pH может также влиять на функцию митохондрий, место токсичности аминогликозида [24], [53], [54]. Однако мутанты persephone не обнаруживают очевидные изменения морфологии митохондрий или др. внутриклеточных структур в отсутствие аминогликозидов. Микрофотографии необработанных личинок persephone неотличимы от таковых их братьев сестер дикого типа. Кроме того, 5 dpf persephone мутанты морфологически и поведенчески неотличимы от своих братьев сестер дикого типа. Эти наблюдения подтверждают, что защита у persephone скорее всего возникает благодаря специфическому для волосковых клеток эффекту скорее, чем широким физиологическим или онтогенетическим эффектам.
Альтернативным способом снижения токсичности аминогликозидов является изменение их загрузки в волосковые клетки. MET каналы в стереоцилиях облегчают проникновение аминогликозидов в волосковые клетки или непосредственно или косвенно [55]. Мутации и малые молекулы, которые снижают активность каналов МЕТ в волосковых клетках ингибируют поступление аминогликозидов и снижение вызываемой аминогликозидами гибели волосковых клеток [20], [35], [36]. У мутантов persephone потребление флюоресцентного аминогликозида аналога Gentamicin-Texas Red волосковыми клетками снижено. Мало вероятно, что это обусловлено изменениями подвижности аминогликозидов через сами мутантные Slc4a1b каналы. Как характеристики заряда, так и размер SLC4 субстратов мешают аминоглюкозидам выступать в качестве субстратов обменников [39]. Очень возможно, что внутриклеточные условия, изменяемые за счет активности Slc4a1b влияют на вступление аминогликозидов в волосковые клетки боковой линии. entry of aminoglycosides into the lateral line hair cells. Так, волосковые клетки, нагруженные styryl краской FM1-43, используемой в качестве показателя механотрансдукции в волосковых клетках боковой линии рыбок данио, существенно уменьшены в количестве в волосковых клетках persephone; однако, FM1-43 мечение у persephone снижено в меньшей степени, чем у мутантов с отсутствием механотрансдукции-напр., cadherin23 [36], myosin 6b [56] и protocadherin 15a [57]. Личинки persephone также не обнаруживают поведенческих фенотипов, наблюдаемых у мутантов, которые потеряли механотрансдукцию- напр., пониженное поведение испуга или минимальная спонтанная активность в плавании. Это очевидно за счет того, что persephone обнаруживают нарушенную активность, которая достаточна для снижения потребления аминогликозидов (и FM1-43), но не устраняет всей передачи сигналов от системы боковой линии.
Пока мы не знаем, как активность Slc4a1b влияет на волосковые клетки боковой линии. Мы благосклонны к идее, что нарушение активности обмена анионами Slc4a1b искажает ионное окружение MET канала и тем самым влияет на поступление аминогликозида в волосковые клетки. Предыдущие исследования показали, что SLC4 белки могут ассистировать в регуляции эндолимфатического потенциала в улитке млекопитающих [48]. Slc4a1b может сходным образом влиять на состав волосковых клеток боковой линии. Хотя эти волосковые клетки поверхностны, они могут поддерживать уникальные апикальные микроусловия-в cupula-в желатинозном матриксе, покрывающем стереоцилии и киноцилии [58]. Как cupula, так и эндолимфа поддерживают высокие концентрации ионов калия и хлорида [59], [60]. Регуляция pH может влиять на градиенты калия в эндолимфе, а поступление аминогликозида в волосковые клетки млекопитающих чувствительно к градиентам ионов [49], [61]. Slc4a1b-обеспечиваемый обмен бикарбоната и хлорида, следовательно, может быть важным для поддержания локальных ионных условий, которые делают возможной активность каналов механотрансдукции. Нарушения условий в cupula, как полагают, снижает способность аминогликозидов или проходить непосредственно через MET каналы или проходить MET-зависимыми путями [61].
C клинической точки зрения временные изменения в составе ионов эндолимфы могут предлагать способ защиты волосковых клеток от воздействия аминогликозидов, если баланс ионов впоследствии восстанавливается. У млекопитающих аминогликозиды, по-видимому, движутся через stria vascularis в эндолимфу и, наконец, через апикальный домен волосковых клеток [62]. Ионный состав эндолимфы, следовательно, скорее всего, является ключевым регулятором проникновения aminoglycoside в волосковые клетки. Мутанты persephone показывают, что рыбки данио являются пригодным инструментом для манипуляций с ионным окружением волосковых клеток, которое снижает активность волосковых клеток и токсичность аминогликозидов.
