Посещений:
НАРУШЕНИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ГОЛОВЫ

Роль нарушений передачи сигналов FGF/FGFR

Tissue-specific responses to aberrant FGF signaling in complex head phenotypes
Neus Martinez-Abadias, Susan M. Motch, Talia L. Pankratz, Yingli Wang, Kristina Aldridge, Ethylin Wang Jabs, Joan T. Richtsmeier
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 1, pages 80–94, January 2013

BACKGROUND: The role of fibroblast growth factor and receptor (FGF/FGFR) signaling in bone development is well studied, partly because mutations in FGFRs cause human diseases of achondroplasia and FGFR-related craniosynostosis syndromes including Crouzon syndrome. The FGFR2c C342Y mutation is a frequent cause of Crouzon syndrome, characterized by premature cranial vault suture closure, midfacial deficiency, and neurocranial dysmorphology. Here, using newborn Fgfr2cC342Y/+ Crouzon syndrome mice, we tested whether the phenotypic effects of this mutation go beyond the skeletal tissues of the skull, altering the development of other non-skeletal head tissues including the brain, the eyes, the nasopharynx, and the inner ears. RESULTS: Quantitative analysis of 3D multimodal imaging (high-resolution micro-computed tomography and magnetic resonance microscopy) revealed local differences in skull morphology and coronal suture patency between Fgfr2cC342Y/+ mice and unaffected littermates, as well as changes in brain shape but not brain size, significant reductions in nasopharyngeal and eye volumes, and no difference in inner ear volume in Fgfr2cC342Y/+ mice. CONCLUSIONS: These findings provide an expanded catalogue of clinical phenotypes in Crouzon syndrome caused by aberrant FGF/FGFR signaling and evidence of the broad role for FGF/FGFR signaling in development and evolution of the vertebrate head. Developmental Dynamics 242:80–94, 2013. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.

Рис. и табл. см. в оригинале статьи
Передача сигналов посредством рецепторов факторов роста фибробластов (FGFRs) и их лигандов (FGFs) является одним из немногих межклеточных путей передачи сигналов среди всех метазоа (Itoh and Ornitz, 2004). Растет количество доказательств, что передача сигналов FGF/FGFR является фундаментальной в развитии современных позвоночных и играет критическую роль в возникновении и эволюции многих характеристик позвоночных, включая те, что вносят вклад в голову позвоночных (Bertrand et al., 2011). Мутации в FGFR2 чаще всего ассоциированы в синдромом краниосиностоза у человека (Ornitz and Marie, 2002), широко распространенным нарушением (~1:60,000)? характеризующимся преждщевременным закрытием швов свода черепа (особенно коронарного шва), но фактически представленным широким спектром аномалий (Wilkie, 1997; Cohen and MacLean, 2000; Ornitz and Marie, 2002). Роль передачи сигналов FGF/FGFR в развитии костей хорошо известна (Ornitz and Marie, 2002) и в дисморфологии черепа хорошо изучена при синдромах краниосиностоза, обусловленыенных, по крайней мере частично, неизменным появлением закрытия швов свода черепа и последующей реконструктивной хирургией у пациентов. Однако передача сигналов FGF/FGFR является критической для базовых клеточных процессов развития (напр., формирования паттерна, пролиферациии, дифференцировки и миграции) в тканях, иных, чем те, что с остеогенной судьбой (Thisse and Thisse, 2005; Hebert, 2011). Используя мультимодальное получение изображений высокого разрешешения мы осуществляли поиск дополнительных потенциальных мишеней для передачи сигналов FGF/FGFR в развитии головы путем оценки фенотипических эффектов изменений в передаче сигналов в различных скелетных и не склетных тканей головы, включая череп. головной мозг, nasopharynx, глаза и внутреннее ухо у мутантных и нормальных сибсов мышей, моделирующих синдром Crouzon.
Мыши, моделирующие синдром Fgfr2cC342Y/+ Crouzon, несут замещение цистеина на тирозин в позиции 342 (Cys342Tyr; C342Y) в Fgfr2 (Eswarakumar et al., 2004) эквивалентное наиболее распространенной мутации FGFR2 ассоциированной с синдромом Crouzon [OMIM no. 123500], но также вызывающей синдром Pfeiffer [OMIM no. 101600]. Присутствие аномалий пальцев и др. органов обычно отличает синдром Круазана от синдрома Пфаффера у пациентов, поскольку различия в черепно-лицевом фенотипе незначительны и обнаруживают заметное перекрывание в отношении черепно-лицевых признаков при двух синдромах (Rutland et al., 1995). У людей с синдромом Круазона черепно-лицевые фенотипические изменения варьируют, но обычно включают преждевременное закрытие коронарного шва (с одной или обеих сторон) , связанное с возникновением turribrachycephalic или brachycephalic свода черепа, генерализованную черепно-лицевую дисморфологию, дефекты средины лица, небольшой величины орбиты и глазной проптоз (Cohen and MacLean, 2000). Дети с синдромом Круазона могут обнаруживать дополнительные симптомы, затрагивающие др. структцры головы, такие как расщепление нёба (Peterson and Pruzansky, 1974; Riley et al., 2007), обструкцию верхних дыхательных путей (Moore, 1993; Sirotnak et al., 1995; Perkins et al., 1997; Scheid et al., 2002; Mitsukawa et al., 2004; Mitsukawa and Satoh, 2010; Randhawa et al., 2011), дисморфологию носоглотки и смежных структур, что нарушает нёбоглотолчную функцию и физиологию носового дыхания (Peterson-Falzone et al., 1981; Johnson and Wilkie, 2011) и легкую или умеренную потерю слуха (проводящую, нейросенсорную или смешанную) часто вызываемые повторяющимися истечениями гноя из-за отита среднего уха, фиксацией цепи слуховых косточек и атрезией наружного слухового канала (Cremers, 1981; Vallino-Napoli, 1996; Orvidas et al., 1999; Cohen and MacLean, 2000; de Jong et al., 2011; Huh et al., 2012). Аномалии головного мозга возникают нечасто при синдроме Круазона, но ventriculomegaly достаточно распространены (Proudman et al., 1995). Сходство между модельными мышами Crouzon и пациентами с синдромом Кпуазона продемонстрировано на морфологическом, гистологическом и молекулярном уровнях (Eswarakumar et al., 2004; Perlyn et al., 2006; Snyder-Warwick et al., 2010). Но всё ещё существует значительный пробел в наших знаниях относительно идентификации причинных генетических мутаций и разработки стратегии по предотвращению или лечению ассоциированных аномалий. Поэтому терапия в основном симптоматическая и базирующаяся на реконструкции, но не нацелена на этиологические источники краниосиностоза.
При синдроме Круазона FGFR2 C342Y мутация является мутацией избыточности функции в мезенхимном Fgfr2c варианте. Чёткая специфичность в связывании лиганда и тканеспецифическая экспрессия альтернативно сплайсированных мРНК вариантов FGFRs (b варианты специфичны для эпителия, c являются специфичными для мезенхимы) могут лежать в основе отличающихся фенотипических эффектов синдрома краниосиностоза. Изоформа IIIc FGFR2 преимущественно экспрессируется в мезенхимных тканях (Orr-Urtreger et al., 1993) и обязательна для клона остеобластов для нормального скелетогенеза. Однако поскольку продукция изоформ FGFR делает возможной взаимодействие между эпителиальным и мезенхимным слоями во время развития в ответ на FGFs (Eswarakumar et al., 2005; Degnin et al., 2010), и мутации, такие как FGFR2 C342Y в IIIc изоформе приводят к потере специфичности к лигандам и к постоянной активации FGFR2, запускающего аномальную передачу сигналов в отсутствие лиганда (Neilson and Friesel, 1995), поэтому эффекты мутации в IIIc изоформе д. затрагивать клеточные клоны иные, чем те, которым предназначено стать костью.
Чтобы широко охарактеризовать потенциальные конкурентные фенотипические эффекты мутаций в изоформе FGFR2c на скелетный и не скелетный фенотипы головы мышей, мы осуществили обширный количественный анализ голов новорожденный мышей с синдромом Fgfr2cC342Y/+ Crouzon и их не затронутых сибсов с использованием мультимодальных изображений. Мы тестировали гипотезу, что мутация в Fgfr2 IIIc сплайс варианте вызывает многочисленные и варьирующие изменения количетвенных характеристик некоторых скелетных и не скелетных тканей головы разного эмбриологического происхождения. Фенотипы голов новорожденных мышей Fgfr2cC342Y/+ Crouzon и неповрежденных сибсов оценивали количественно с использованием соотв. ориентироов и данных по объему изображений, полученных в результате микропроцессорной томографии высокого разрешения (?CT) и магнито резонансной микроскопии (MRM). Мы ожидали, что эффекты мутации Fgfr2 IIIc варианта будут прежде всего затрагиватьь костную ткань и что существенные различия между мутантными и незатронутыми мышами будут ограничены сводом черепа. Это предположение было отторгнуто, поскольку мы установили статистически достоверные отличия мужду мутантными и не затронутыми сибсами в не-скелетных тканях (напр., головном мозге, носоглотке, глазах, внутреннем ухе), указывающие, что Fgfr2 IIIc вариант влияет на морфогенез нескольких тканей в добавление к тем, которые образуются из мезенхимы. Альтернативная гипотезе предполагает влияние на множественные ткани передачи сигналов FGF/FGFR при развитии головы, и если это будет подтверждено, то это предоставит новые данные относительно широких эффектов FGFR мутаций на развитие головных структур и доказательства важности этого сигнального пути в интеграции и координации изменений в эвотлюции головы позвоночных (Bertrand et al., 2011; Martinez-Abadias et al., 2011).

DISCUSSION


По сравнению с тем, что было описано ранее для взрослых Fgfr2cC342Y/+ мышей (Eswarakumar et al., 2004; Snyder-Warwick et al., 2010), дисморфология черепа новорожденных Fgfr2cC342Y/+ мышей оказалась параллельнй с фенотипом черепа у детей с синдромом Круазона, хотя большинство костей нейрокраниума и основания черепа у новрожденных мышей сформировано лишь частично на ст. P0. Череп Fgfr2cC342Y/+ мышей и у незатронутых сибсов был сходен по размеру на ст. P0, но отиличался по форме (Figs. 1, 2). Эти различия сопровождались преждевременным закрытием коронарного шва и вариациями в открытости лицевых швов (Fig. 3, Table 3). Как и в предыдущих исследованиях (Eswarakumar et al., 2004; Snyder-Warwick et al., 2010), показатель расщепления нёба чрезвычайно низкий у мышей, гетерозиготных по этой мутации. Наш анализ впервые выявил дополнительные эффекты мутации Fgfr2 IIIc на форму и размер некоторых не-скелетных тканей головы новорожденных Fgfr2cC342Y/+ мышей. Мы составили каталог дополнительных мишеней для мутации Fgfr2 C342Y и выявили специфические важные изменения в форме головного мозга (но не в его размерах) (Figs. 4, 5), достоверное уменьшение объема носоглотки т достоверное увеличение объёма глаз (Fig. 6), это подтверждает альтернативную гипотезу, что мутация Fgfr2 IIIc варианта затрагивает развитие разных тканей головы эмбриона.

Direct and Indirect Effects of the Fgfr2 IIIc Mutation


Генетические варианты, вызывающие связанные с FGFR синдромы краниосиностоза, многочисленны и вариации в дефектах средины лица и дисморфологии нейрокраниума характерны для этих синдромов (Wilkie, 2005). Эти свойства обычно приписываются дисморфогенезу черепа, составной и сложной костной структуре, а нашши Fgfr2cC342Y/+ мыши обнаруживают многие и некоторые из наиболее тяжелых уродств, наблюдаемых в черепе людей, несущих эту м утацию. Хотя верно, что ткани минерализованного скелета создают структурный каркас для всей морфологии головы (Abzhanov et al., 2007), минерализация внутримембранозных и эндохондральных костей черепа происходит позднее в развитии по сравнению с появлением др. структур из мягких тканей и пространств (напр., головного мозга, носоглотки и ротовой части глотки и глаз). Более того, череп не является продуктом активности изолированных остеогенных клеток предшественников, а формируется в результате взаимодействия множественных типов клеток, которые посылают и отвечают на сигналы из многих источников (Noden and Trainor, 2005), всё это комбинируется в высоко скоррдинированных 4-мерных пространство-временных условиях, чтобы дифференцироваться в разные ткани, которые совместно формируют голову.
Исторически гипотеза функционального матрикса (FM) предполагает, что присутствие, размер и форма, рост и расположение в пространстве всех скелетных тканей является вторичным, компенсаторным и механически облигатным ответом на предшествующий по времени функциональный матрикс, связанный с мягкими тканями (Moss, 1962). Предложенный механизм (напр., биомеханический, биофизический) был предложен до современноого состояния знаний о генетических основах и был неспособен объяснить причину и эффект в развитии поосредством генерации передачи сигналов c помощью механических сил посредством межклеточных контактов между тканями (e.g., Yu et al., 2001). Предложенная для краниосиностоза гипотеза FM предсказывает. что изменения в ориентации волоконных трактов твердой мозговой оболочки изменяет растягивающие усилия, это влияет на расположение зачатков краниальных костей и швов, что приводит к преждевременному слиянию швов (Moss, 1959). Недавно, полученые данные относительно локальной экспрессии FGF/FGFR путей, специфичности лигандов, взаимодействия генных продуктов и клеточных событиях, происходящих локально, относительно швов, были соединены вместе с нашим знанием, что FGFs неотъемлемы для роста нормальной кости, а FGFR мутации вообще-то являются непосредственными и критическими игроками в процессе преждевременного слияния швов. Работа, представленная ранее (Martinez-Abadias et al., 2010) продемонстрировала, что закрытие коронарного шва не является ни первостепенным единственным локусом в дисморфологии черепа у моделей, моделирующих синдромы краниосиностоза.
Определение до какой степени количесивенные изменения в размере и форме в разных тканях испытывают непосредственное влияние мутации в каждой ткани и/или являются результатом косвенных эффектов перемежающихся уродливых тканей (те, которые мы анализировали, или альтернативы) на морфогенез др. тканей, необходим дальнейший анализ. Мы предоставили предварительный анализ взаимозависимости развития характеристик головы путтем подсчета корреляций размеров скелетных и не скелетных структур головы (Table 5). Этот корреляционный анализ выявил сходные паттерны взаимоотношений среди этих тканей у Fgfr2cC342Y/+ мышей и их неповрежденных сибсов. В обоих случаях корреляция между регионами черепа наивысшая, а корреляция между не-скелетными характеристиками очень низкая или отсутствует, эта находка явилась неожиданной, учитывая очевидную точную координацию между множественными развивающимися тканями во время морфогенеза головы. Наш предварительный анализ подтвердил, что такая детальная координация происходит с незначительной или отсутствием различимой статистической ассоциации между скелетными и не-скелетными признаками на ст. P0. Однако изменения в размере это просто один из аспектов развития. Изучение раннего постнатального роста (от P0 до P2) у мышей Fgfr2+/P253R, моделирующих синдром Apert, показало, что размер и форма изменяются по-разному в черепе и головном мозге, это предполагает некоторый уровень независимости в паттерне роста двух тканей (Hill et al., 2012). Будущий корреляционный анализ с большим размером выборки и дополнительными данными (напр., количественными измерениями формы) прредоставит дополнительную информацию о взаимозовисимости этих развивающихся тканей. Мы предполагаем, что вариации в изменениях локальных форм сложных характеристик головы вносят вклад в очевидные различия в относительном положении и общей пространственной ассоциации признаков у Fgfr2cC342Y/+ мышей по сравнению с неповрежденными сибсами (Fig. 7).

Figure 7. Relative position of skull (yellow), brain (purple), nasopharynx (light blue), globe of the eye (green), and inner ear (light blue) in Fgfr2cC342Y/+ Crouzon syndrome mouse (A) and unaffected littermate (B). In each panel the top view shows the superimposition of skull as visualized by ?CT and soft tissues segmented from MRM; the bottom view represents MRM data only. Scales are internally consistent for each imaging modality. Additional soft tissues of the head visualized on MRM shown in blue/green.

Полный двухсторонний краниосиностоз обоих коронарных швов наблюдается у 75% Fgfr2cC342Y/+ новорожденных (Table 3), это согласуется с предыдущими наблюдениями закрытия обоих коронарных швов у 80% взрослых мышей (Perlyn et al., 2006), и подтверждает, что слияние кронарных швов происходит пренатально, если присутствует данная мутация. Слияние presphenoid-basisphenoid синхондроза, наблюдаемое у взрослых Fgfr2cC342Y/+ мышей (Perlyn et al., 2006) не обнаруживается в наших выборках новорожденных, у которых минерализованные косточки основания черепа очень малы и четко отделены одна от др. (Fig. 2 and Supp. Videos S1, S2). Следовательно, преждевременное слияние минерализованных элементов основания черепа не может вызывать существенные изменения основания черепа, морфологии лица или свода черепа у Fgfr2cC342Y/+ на ст. P0. Наш анализ формы выявил границу эффектов основания черепа в средней точке основания черепа, где ростральные элементы основания черепа и ткани, которые занимают не минерализованные пространства между ними, уменьшены в размерах, тогда как те, что каудальнее basisphenoid удлинены (Figs. 1 and 2). Соответствуют или нет эти пограничные эффекты делению между происходящими из нервного гребня (presphenoid, basisphenoid) и происходящими из мезодермы (basioccipital) элементами основания черепа (McBratney-Owen et al., 2008) невозможно определить непосредственно по данным изображений. Изменчивость в открытии швов свода черепа и изменения в форме кости и головного мозга вносят вклад в дисморфологию нейрокраниума у Fgfr2cC342Y/+ мышей.
Дефекты средины лица у Fgfr2cC342Y/+ мышей проявляются в виде уменьшения костей лица и нёба (Figs. 1, 2), изменчивости в открытии швов (Fig. 3), и сильно уменьшенном объеме носоглотки (Fig. 6). Помимо гипоплазии средины лица, характерному признаку фенотипа краниосиностоза, часто наблюдается неправильное развитие лицевых костей, но мы не получили доказательств ограничения первичной мишени мутаций Fgfr2 клетками предшественниками костей. Примитивная глотка состоит из энтодермы изнутри, которая зависит от Fgf в своем морфогенезе и,как было установлено на рыбках данио, aглоточная энтодерма играет роль в обеспечении жизнеспособности локальных скелетогенных клеток нервного гребня и формировании паттерна костей и хрящей фарингеальных дуг (Crump et al., 2004). Следовательно, фарингеальная энтодерма может быть также первичной мишенью аберрантной передачи сигналов FGF/FGFR , которая непосредственно влияет на форму носоглотки и косвенно влияет на размер и форму лицевых костей, развивающихся внутри фарингеальных дуг. Нет сомнения в роли этих Fgfr2 мутаций в остеогенезе и аномальном развитии склетных компонентов. Наш анализ выявил дополнительные возможные первичные эффекты Fgfr2 IIIc варианта на не скелетные ткани головы, которые могут вносить вклад в дисморфогенез костей черепа.

FGF/FGFR Signaling and the Role of Head Development in Vertebrate Evolution


Наш анализ выявил параллели фенотипов головы человека и мыши, возникающих в результате C342Y мутации в FGFR2, показав строгую консервацию онтогенетических генетических программ, которые лежат в основе развития головы у млекопитающих и подтвердил пригодность этой мышиной модели для анализа развития фенотипа синдрома Круазона. Эти даннные представили новые факторы для будущих молекулярных и клеточных исследований эффектов этой мутации на передачу тканеспецифичных клеточных сигналов, которые вносят вклад в черепно-лицевой дисморфогенез и сложную этиологию фенотипа головы при синдроме Круазона. В то же время наши данные предоставляют основу для мышления более широко о реакциях организма на мутации, как на онтогенетические реакции, которые принуждают следовать установленному эволюционным паттернам.
FGFs являются малыми белками, характеризующимися законсервированным функциональным доменом, который действует путем связывания с FGFRs, заст авляя их гомодимеризоваться и в конечном итоге активировать и фосфорилировать множественные цитоплазматические сигнальные каскады (Eswarakumar et al., 2005). FGFRs являются ключевыми регуляторами многих клеточных процессов (Turner and Grose, 2010). Большое количество генов, кодирующих FGFs (по крайней мере, 22 у позвоночных), вместе с 4 их FGFRs, по-видимому, сгенерироваными в результате двух раундов дупликаций всего генома со множественными функциями, добавляемыми во время эволюции посредством накопления генов и сплайс-вариантов с разными лиганд-связывающими специкациями (Itoh and Ornitz, 2004; Popovici et al., 2005). Экспрессия FGFs в производных клеток нервного гребня, краниальных плакодах и специфических регионах головного мозга позвоночных и консервация определенных лиганд-связывающих свойств за альтернативно сплайсируемыми вариантами мРНК FGFRs увеличивает их функциональное разнообразие и делает передачу сигналов FGF/FGFR распространяющейся повсюду в развитии головы (Yeh et al., 2003; Itoh and Ornitz, 2004; Eswarakumar et al., 2005).
Растущее число доказательств подтверждает, что передача сигналов FGF/FGFR является фундаментальной для разнообразных процессов во время нормального развития позвоночных (Ornitz and Itoh, 2001; Thisse and Thisse, 2005; Wilkie, 2005; Szabo-Rogers et al., 2008; Hatch, 2010; Hebert, 2011). Представленные здесь доказательства множественных фенотипических эффектов мутации в FGFR2 демонстрирует влияние передачи сигналов FGF/FGFR на развитие множественных типов клеток и тканей. Важно, что эти доказательства также подтверждают роль передачи сигналов FGF/FGFR при приспособлении меняющихся ассоциаций тканей, которые возникают во время морфогенеза головы, роль, которая д. нуждаться в соотв. межклеточных сигнальных механизмах, при которых клетки разных тканей являются согласованно действующими партнерами в развитии общех ансамблей. Такого типа система не должна возникать de novo с внесением мутации у современных позвоночных, а вместо этого д. быть продуктом эволюции онтогенетических систем.
В предыдущем исследовании морфологической интеграции разных частей черепа у двух Fgfr2 мутантных мышей, моделирующих синдром Apert (Martinez-Abadias et al., 2011), мы подтвердили, что передача сигналов FGF/FGFR является covariance-generating механизмом, возникшим рано в эволюции позвоночных, который действует как глобальный фактор, модулирующий скоординированное развитие различных компонентов черепа. Далее мы показали, что этот механизм д. ограничивать важные для клиники изменения формы черепа, вызываемые мутациями Fgfr2 (Martinez-Abadias et al., 2011). В то время как морфологические интеграции черепа были оценены Martinez-Abadias et al. (2011) c помощью статистического анализа ковариаций среди форм компонентов черепа, здесьмы показали, что эта covariance-generating система не ограничивается скелетной тканью.
Ковариации, сгенерированные c помощью передачи сигналов FGF/FGFR возникают на уровне клеток. Передача сигналов FGF/FGFR может как индуцировать специфические паттерны генной экспрессии, так и обеспечивать специфические реакции не подвергнутых никаким воздействиям клеток, обеспечивая динамическую аккомодацию изменений формы, когда осуществляется сборка головы из простых популяций гомогенных клеток в точно скоординированные свойства клеток смешанного происхождения. Клетки, реагируют на передачу сигналов FGF/FGFR путем изменения размера и формы, c помощью дифференцировки, c помощью гибели и c помощью делений, c помощью посылки соотв. сигналов, c помощью обеспечения клеток способностью получать и соотв. реагировать на сигналы, или c помощью изменений генов воспринимающих клеток, обеспечивающих реакции. Важно, что тканеспецифические и глобальные реакции тканей головы на мутации FGFR индуцируются c помощью межклеточных паттернов передачи сигналов, продуцируемых свыше миллионов лет эволюции. Знание эволюции этих систем в конечном итоге может позволить нам лучше использовать их динамику в терапевтических целях.

CONCLUSIONS


In this work, we present a detailed analysis of the global and local phenotypic effects of the C342Y mutation on Fgfr2c on various skeletal and non-skeletal tissues of the head. The approach that we present is directly applicable to the study of other animal models of human disease. Our findings contribute to the growing evidence that FGF/FGFR signaling is part of a multifaceted set of interactions among genes and regulatory networks that drive communication among cells in the development of the head. The nature of the signals vary by cell type, location, and developmental timing so that the challenge becomes one of understanding the complexity of cell–cell signaling and phenotypic assembly at many levels across time (evolutionary and developmental) and space. In addition to the highly successful foundation of developmental biology built largely on molecular analyses of cells and tissues at specific developmental time points, the knowledge that complex craniofacial traits vary together by exploiting patterns of signaling, association, and covariation established over hundreds of millions of years of evolution should be used in the design of new tools for decoding the complex effects of specific mutations on head morphogenesis.