Сокращения индивидуальных кардиомиоцитов у рыбок данио совпадают с образование сердечной трубки (Stainier et al., 1993). Сердцебиения создаются за счет скоординированного сокращения множественных кардиомиоцитов, которые итерационно поднимают и высвобождают кальций (Berridge et al., 2003; Ebert et al., 2005). По ходу развития изменения в форме камер, кардиальное петлеобразование и развитие створок атриовентрикулярных клапанов, а также изменения в электрической возбудимости вносят вклад в становление синхронизированных сердцебиений. Напряжением контролируемые L-type calcium channels (LTCC), располагаются на поверхности кардиомиоцитов, они вносят вклад в кардиальный потенциал действия, обеспечивая поступление кальция в клетку и запуская вызываемое кальцием высвобождение кальция (Fabiato, 1983). Возникающие в результате высокие концентрации внутриклеточного кальция облегчают следующее систолическое сокращение (Bers, 2002). Кардиальные LTCC являются олигомерными каналами, состоящими из субъединицы α , образующей крупную пору и двух вспомогательных белков (the α ₂δ и β subunits). Трансмембранная α субъединица содержит сенсор напряжения (voltage sensor), который отвечает на деполяризацию мембраны открытием каналов, позволяя проникать Ca²⁺ в клетку. Ассоциированная с мембраной α₂δ регуляторные субъединицы увеличиваю ток кальция, и вызывает предрасположенность α субъединицы ассоциировать с плазматической мембраной(Davies et al., 2007). Субъединицы β, кодируемые генами CACNB, ответственны за основную регуляцию экспрессии и пропускной способности канала (Catterall, 2000). Проведение Ca²⁺, экспрессия канала и восстановление после инактивации увеличиваются в присутствии β субъединицы (Singer et al., 1991; Jeziorski et al., 2000).

Млекопитающие экспрессируют 4 β субъединицы (β 1-β 4), которые взаимодействуют без исключения с α субъединицами. Эмбриональная экспрессия β субъединиц во времени и пространственно разделена (за небольшим перекрыванием; Schjott et al., 2003; Acosta et al., 2004). мРНК и белок β субъединицы обнаруживаются во всех возбудимых тканях, а также в некоторых не возбуждаемых тканях, включая почки и печень (Ebert et al., 2008a, b; Link et al., 2009). Широкое распределение β субъединиц по всему телу согласуется с их важной ролью в поддержании физиологических функций. Более того, физиологическая изменчивость генов CACNB оказывается связанной с некоторыми заболеваниями человека, затрагивающими сердце и головной мозг, включая кардиальную аритмию, синдром Brugada и синдром семейной внезапной кардиальной гибели; Antzelevitch et al., 2007; Hedley et al., 2009; Burashnikov et al., 2010), сердечно-сосудистые заболевания (Levy et al., 2009), врожденные пороки сердца (Waleh et al., 2010), болезнь коронарных артерий (Davis et al., 2010a, b), биполярные нарушения (Lee et al., 2011) и распространенные мигрени (Nyholt et al., 2008).

У млекопитающих каждый из 4-х β генов ассоциирует с уникальными паттернами эмбриональной и взрослой экспрессии каналов и электрофизиологическими свойствами, при этом их общая сходная белковая структура позволяет классифицировать их как membrane associated guanylate kinase (MAGUK) семейство белков (Buraei and Yang, 2010). β белки, подобно др. MAGUKs, содержат SH3 домен, а также каталитически неактивный guanylate kinase (GK) домен, но лишены PDZ домена (Funke et al., 2005). Посредством своих доменов SH3 и GK межбелковых взаимодействий, MAGUK белки могут исполнять функции каркасов посредством формирования связей между трансмембранными белками и цитозольными элементами клеточных соединений или могут служить в качестве промежуточных образований в путях передачи сигналов (Jelen et al., 2003; Velthuis et al., 2007; Hara and Saito, 2009; Marasco et al., 2009). Напр., мультифункциональные ZO белки семейства MAGUK существенны для правильной организации плотных соединений, но также ассоциируют с G-белками и факторами, которые регулируют экспрессию генов (Bauer et al., 2010).

Недавние исследования выявили дополнительные роли и новые субклеточные регионы экспрессии, это подтверждает гипотезу, что β белки действуют как мультифункциональные MAGUKS скорее, чем вспомогательные субъединицы каналов (Colecraft et al., 2002; Alvarez et al., 2010; Zhang et al., 2010). Bo-первых, β субъединицы могут косвенно модулировать общую стабильность комплексов кальциевых каналов, регулируя доступность α субъединицы внутри клетки. В отсуствие β субъединиц, α субъединицы убиквитинируются с помощью RFP2 и направляются на деградацию протеосомами (Altier et al., 2011). Во-вторых, возможна роль β2 субъединиц в регуляции транскрипции, что подтверждается локализацией специфического сплайс-варианта β4 в ядре (Colecraft et al., 2002; Subramanyam et al., 2009), и его взаимодействием с хроматин связывающим белком (Hibino et al., 2003; Xu et al., 2011). Высокие уровни β 4 ассоциируют с желточными синцитиальными ядрами у рыбок данио, это может быть связано с неспособностью эмбрионов, истощенных по β 4 завершать эпиболию (Ebert et al., 2008c). Наконец, на периферии клеток роль β белков может быть расширена за пределы модуляции кальциевых каналов. Актин связывающий белок AHNAK и β2 обладают общими множественными сайтами связывания, а секвестрация β2 с помощью AHNAK может косвенно репрессировать токи через кальциевые каналы (Haase et al., 2005; Haase, 2007).

Субъединица β2 кодируется предоминирующим β геном, экспрессируемым во взрослом сердце мышей (Zhou et al., 2008; Link et al., 2009). Некоторые варианты транскриптов β2, существующие у рыбок данио, а также у млекопитающих, это увеличивает потенциальную сложность функционирования этих белков (Hullin et al., 1992; Ebert et al., 2008a; Zhou et al., 2008). Его роль в качестве регулятора L-типа кальциевого канала во взрослом сердце подтверждена на млекопитающих. β2 экспрессируется также в сердцах эмбрионов мышей и рыб, хотя не обязательно на высоких уровнях (Serikov et al., 2002; Ebert et al., 2008a; Zhou et al., 2008).

Потеря экспрессии β2 ведет к сосудистым и кардиальным деформациям у мышей (Weissgerber et al., 2006). Эти фенотипы оказались связаны с эмбриональной летальностью на ст. E10.5. Сердца с целенаправленно измененным β 2^-/- у нулевых мутантных мышей обнаруживают нарушения работы сердца, снижающие сердечный выброс и замедляющие сердцебиения. Сложность сосудистой сети желточного мешка снижена в основном из-за вторичный последствий изменений гемодинамических сил.

В данной работе мы использовали модельную систему рыбок данио для изучения функции β2 в развитии сердца. Поскольку эмбрионы рыбок данио в возрасте 6 дней или менее получают кислород путем диффузии скорее, чем работы сердца, то развитие сердечно-сосудистой системы может быть отслежено независимо от эффектов гипоксии. Геном рыбок данио кодирует два β2 гена, β2.1 и β2.2, это согласуется с дупликацией генома рыбок данио 450 миллионов лет назад (Jaillon et al., 2004; Ebert et al., 2008a). Из них, β2.1 наиболее сходен с человеческим β2 (87% гомологичных аминокислот по сравнению с 62% для β2.2). Мы установили, что истощение β2.1 у эмбрионов рыбок данио ведет к снижению петлеобразования сердечной трубкой, снижению работы сердца и слабой контрактильности. Морфология кардиальных камер нарушена, предсердия расширены, а желудочки спадаются. Чтобы исследовать механические основы этого фенотипа, мы исследовали спецификацию кардиальных предшественников внутри билатеральных полей сердца, скорость клеточной пролиферации в ранней сердечной трубке и функциональные свойства созревших кардиомиоцитов. Все эти свойства были изменены у истощенных по β2.1 эмбрионов, это позволяет утверждать, что β2.1 белок является важным компонентом развития эмбрионального сердца.

DISCUSSION

β2.1 вспомогательной β субъединице1й кальциевого канала, экспрессирующейся в эмбриональном сердце рыбок данио. Чтобы определить роль β2.1 ув развитии сердца, мы вызывали истощение продукта гена β2.1 у эмбрионов c помощью морфолино нокдауна. Поскольку β2 млекопитающих является главным регулятором кардиального LTCC канала, мы преположили, что его нокдаун может привести к нарушению функции сердца у эмбрионов рыбок данио. Достоверное замедление скорости сердцебиений и ослабление сердечных сокращений у β2.1-истощенных эмбрионов подтверждает эту гипотезу. Мы показали, что β2.1 является важной для роста камер желудочков, для хода петлеобразования сердечной трубки и изменений формы клеток, связанных с раздуванием камер, и для структурной целостности сердечной трубки. Специальный сплайс-вариант β2.1 tv_6, достаточен для достижения этих эффектов. Механистическая основа для фенотипов в результате истощения β2.1 связана с несколькими аспектами. Во-первых, инициальная спецификация кардиальных предшественников, детерминация камер-специфических судеб клеток, жизнеспособность клеток и добавление клеток к сердечной трубке на артериальном и венозном полюсах, всё это осуществляется нормально в β2.1-истощенных сердцах. β2.1 однако необходим для соотв. пролиферации кардиомиоцитов в желудочках в ходе большей части периода образования сердечной петли и морфогенеза камер. Кроме того, хотя кардиальные клетки β2.1-истощенных эмбрионов кажутся здоровыми и генерируют нормально актиновые стрессовые волокна, N-cadherin сильно истощен по периферии клеток у морфантов, указывая тем самым, что соединения соседних кардиальных клеток посредством слипчивых соединений нарушены у таких эмбрионов.

Главной находкой данной работы является то, что эмбрионы, истощенные по β2.1, образуют сердечную трубку, содержащую достоверно меньше кардиомиоцитов желудочков по сравнению с диким типом. В β2.1-истощенных сердцах меньше кардиомиоцитов вступают в S фазу клеточного цикла, как показывает включение BrdU в ходе развития сердца. Это первое сообщение, продемонстрировавшее эффект β субъединицы на пролиферацию клеток, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить является этот эффект непосредственным или опосредованным.

Онтогенетические функции белков β2 д. рассматриваться в свете как потенциала, связанного с кальциевыми каналами, или как активности, независимой от кальциевых каналов. Субъединицы β2 могут влиять на клеточные процессы посредством межбелковых взаимодействий, опосредованных c помощью их MAGUK доменов, особенно SH3 и GK регионов. Существует прецедент для белков семейства MAGUK в регуляции пролиферации и плотности эпителиальных клеток посредством стабилизации циклинов во время митозов и посредством взаимодействия с транскрипционными факторами, необходимыми для осуществления клеточных делений (Balda et al., 2003; Capaldo et al., 2011). Альтернативно, благодаря вспомогательным субъединицам к кардиальным LTCC каналам, влияние β2 белков на экспрессию и пропускную способность LTCC может воздействовать на передачу сигналов кальция, что впоследствии д. приводить к изменению клеточной пролиферации и транскрипции генов. Напр., calcineurin является протеин фосфатазой, чувствительной к изменениям внутриклеточного кальция вследствие событий сигнальной трансдукции. Специфичный для сердца мутагенез calcineurin у мышей ведет к изменению экспрессии зависимых от кальция генов в эмбриональном сердце и ассоциирует со снижением количества кардиомиоцитов (Maillet et al., 2010). В 2008, Meissner and Noack показали, что блокирование проводимости LTCC каналов c помощью канальных антагонистов в культивируемых эпителиальных клетках человека приводило к снижению пролиферации, тогда как воздействие канальными агонистами восстанавливало количества клеток (Meissner and Noack, 2008). Сходным образом мутации у рыбок данио, которые снижают функцию LTCC канала, ассоциируют с с меньшими количествами клеток в развивающейся сердечной трубке (Rottbauer et al., 2001). У рыбок данио аллель island beat (isl) кодирует нулевую мутацию в alpha субъединице Cav1.2, CACNA1C (Rottbauer et al., 2001). Гомозиготные isl мутантные эмбрионы содержат на 43% меньше вентрикулярных кардиомиоцитов. Предсердия isl эмбрионов фибриллируют, тогда как желудочки не способны сокращаться совсем. Хотя фибрилляции предсердий мы никогда не наблюдали в истощенных по beta;2.1 сердцах, сократительная способность была слабой, а функция сердца нарушена. Т.о., имеется прекрасный прецедент, что LTCC-обеспечиваемая передача сигналов кальция может быть важным регулятором пролиферации кардиомиоцитов, это привело нас к предположению, что β2.1 может влиятьна пролиферацию клеток зависимым от кальциевого канала способом.

В подтверждение этой идеи, что β2.1 действует зависимым от кальциевого канала способом, мы установили, что ингибирование активности LTCC посредством nifedipine вызывает кардиальные фенотипы, которые напоминают таковые при нокдауне β2.1. Более того, функция LTCC может быть восстановлена как у обработанных nifedipine, так и истощенных по β2.1 эмбрионов, добавляя LTCC агонист BayK, это приводит к частичному устранению кардиальных фенотипических отклонений и подтверждает связь между β2.1 активностью и функцией LTCC. Интересно, что активность LTCC, по-видимому, не полностью уничтожается в β2.1-истощенных сердцах и не с сердцах, подвергнутых воздействию 20 µM nifedipine, поскольку кардиомиоциты всё ещё сокращаются. Возможным объяснением этого наблюдения у морфантов является то, что другие ? гены экспрессируются в сердце, включая β 4.1, β 4.2 или β2.2, частично компенсируя потерю β2.1, так что некоторая активность LTCC сохраняется. Также возможно, что некоторые аспекты функции β2.1 зависят от кальциевых каналов, тогда как др. (какие как функции клеточной целостности) не зависят от кальциевых каналов, Необходимы более детальные исследования с использованием мутантных и укороченных конструкций, чтобы подтвердить в точности, какие фенотипические отклонения при истощении β2.1зависят от LTCC.

Исследования на рыбках данио показали, что множественные механизмы детерминируют размер сердца. Первоначально ограниченная популяция клеток в латеральной пластинке мезодермы детерминирует размер сердца. Инициально ограниченная популяция клеток в латеральной пластинке мезодерм ы специфицируется, чтобы стать кардиомиоцитами (Yelon, 2001). Рекрутирование новых кардиомиоцитов и регулируемые клеточные деления в комбинации с локальными изменениями в клеточной морйфологии, приводят к росту и формообразованию развивающегося эмбрионального сердца (de Pater et al., 2009). Генетический анализ подтверждает, что передача сигналов кальция, паракринные коммуникации и сигнальные каскады транскрипционных факторов являются главными механизмами, которые совместно регулируют эти морфогенетические процессы в формировании сердца в раннем развитии (Morin et al., 2000; Rottbauer et al., 2001; Ebert et al., 2005; Marques et al., 2008; Caprioli et al., 2011; Suzuki, 2011). У рыбок данио кардиальный митогенный фактор fgf8 экспрессируется рано на ст. трех сомитов в зарождающихся полях сердца в латеральной пластинке мезодермы (Reifers et al., 2000). Генетический анализ показал, что fgf8 является одним из самых ранних игроков, участвующих в спецификации кардиомиоцитов и что он необходим для индукции и формирования паттерна миокардиальных предшественников (Reifers et al., 2000). Эмбрионы, гомозиготные по мутантному аллелю fgf8, обнаруживают снижение экспрессии камер-специфичных маркеров на ст. 21 сомита и позднее развившееся сердце содержит достоверно меньше клеток на ст. 48 hpf (Marques et al., 2008). У истощенных по β2.1 эмбрионов мы не обнаружили различий в экспрессии fgf8 на ст. 4-х сомитов, подтвердив, что изменения, ответственные за снижение количества кардиомиоцитов, скорее всего, возникают после инициальной спецификации поля сердца. По ходу развития желудочки, по-видимому, испытывают более сильное влияние со стороны истощения β2.1, чем предсердия. В желудочках оказывается на 25% меньше клеток к 48 hpf. Более низкая скорость пролиферации наблюдается в камерах желудочков на некоторых стадиях до 48 hpf, это, скорее всего, и объясняет различия.

Спецификация клеток вторичного поля сердца на венозном и артериальном полюсах, по-видимому, не испытывает влияния со стороны нехватки β2.1. Мы заметили однако , что нормальная спецификация клеток на венозном и артериальном полюсах не обязательно указывает на то, что эти клетки действительно соединяются в развивающееся сердце. В самом деле, предполагается, что β2.1 может играть роль в образовании клеточных соединений, который может нарушать миграцию этих клеток в сердце и тем самым влиять на общее количество кардиомиоцитов в желудочках или предсердиях. Чтобы проверить эту альтернативную гипотезу необходимы многоцветные трансгенные инструменты, подобные тем, что разработаны de Pater et al. (2009) или Lazic and Scott (2011), которые могут аккуратно отслеживать дифференцировку и добавление клеток к полюсам сердца.

Кардиомиоциты, которые активно сокращаются д. сохранять строгое прикрепление к ECM и к соседним кардиомиоцитам, чтобы облегчать механотрансдукцию (Noorman et al., 2009). Некоторые исследования показали, что целостность клеточных соединений между кардиомиоцитами играет важную роль в регуляции роста и жизнеспособности миоцитов, кардиальном морфогенезе и в становлении или поддержании нормального сердечного ритма сокращений (Grossmann et al., 2004; Samarel, 2005; Bugorsky et al., 2007; Al-Amoudi and Frangakis, 2008). Хотя кардиомиоциты экспрессируют несколько разных клеточных соединений, которые , как полагают, обеспечивают в основном структурную целостность камер, которые являются структурами постоянных сокращений (Noorman et al., 2009). Главным компонентом слипчивых соединений является трансмембранный белок N-cadherin, соединяющийся с внутриклеточным актиновым цитоскелетом посредством катенинов (Ebnet, 2008). Распределение N-cadherin у мутантов glass onion рыбок данио ведет к летальному кардиальному фенотипу, при котором подавляется как кардиальная функция, так и морфология и в результате образуются округлые, очень рыхло ассоциированные кардиомиоциты внутри сердечной трубки (Bagatto et al., 2006). В общем, значительная степень ремоделирования актина сопровождается созреванием слипчивых соединений, т.к. они соединены с цитоскелетом (de Mendoza et al., 2010). В нашем исследовании сердца эмбрионов, истощённые по белку β2.1 , обнаруживали резкое снижение N-cadherin белка, расположенного на клеточной периферии, подтверждая, присутствие очень незначительного количества слипчивых соединений на поверхностях соседних кардиомиоцитов. Те же самые сердца демонстрировали пониженную способность поддерживать целостность ткани в стрессовых условиях.

Др. сообщали, что подавление N-cadherin связано с округлением клеток и неспособностью увеличиваться в длину (Knollmann and Roden, 2008; Hara and Saito, 2009). В сердцах дикого типа мы наблюдали, что клетки OC желудочков превращаются, как и ожидалось, из округлых в удлиненной формы клетки приблизительно на ст. 48 hpf, когда раздуваются камеры и закончилось образование кардиальной петли (Auman et al., 2007). Однако в β2.1-истощенных сердцах клетки OC были неспособны удлиняться и вместо этого сохраняли свою округлую форму, указывая, что необходимые для этого перехода молекулы или организация цитоскелета отсутствуют. Напротив, сердца из β2.1-истощенных эмбрионов несущественно отличались своими уровнями или глобальной организацией F-actin, подтверждая идею, что организация цитоскелета в целом не изменена в сердцах с отсутствием β2.1. Поэтому мы склоняемся в пользу гипотезы, что альтерации в форме клеток и целостности сердечной трубки, нарушены у морфантов β2.1 за счет изменений в межклеточных соединениях, обеспечиваемых N-cadherin, мы не могут полностью исключить альтернативную возможность, что незначительные альтерации в цитоскелетных структурах или механизмах пассивного натяжения действуют как факторы вносящие вклад в неспособность β2.1-истощенных OC кардиомиоцитов удлиняться, как ожидалось. В самом деле, контрактильность, нарушенная у этих эмбрионов, открывает возможность, что саркомеры негативно изменены, что в свою очередь может влиять на форму клеток.

Превращение формирующихся межклеточных соединений на плазматической мембране в зрелые сцепления между клетками нуждаются в соотв. сборке белков соединений c помощью MAGUKS и др. каркасных белков (Knollmann and Roden, 2008; Marasco et al., 2009). Сборка межклеточных соединений является динамичной и регулируется множественными белковыми комплексами в зависимости от состояния зрелости (Velthuis et al., 2007; Ebnet, 2008). Цитоплазматические каркасные белки, как полагают, координируют механическую связь между соединениями и актиновым цитоскелетом (Funke et al., 2005). В некоторых случаях рекрутирование дополнительных белков в зрелые слипчивые соединения на мембране зависят от передачи сигналов кальция и осцилляц2ий кальция на мембране. Напр., воздействие на фибробласты блокаторами каналов кальция снижает cadherin-обеспечиваемую слипчивость на 60% (Ko et al., 2001). Поэтому разумно предположить, что β2.1 может влиять на целостность слипчивых соединений косвенно, посредством модуляции передачи сигналов кальция c помощью LTCC. Альтернативно, β2.1 белок может действовать посредством своих MAGUK доменов, обеспечивающих межбелковые взаимодействия, чтобы рекрутировать или стабилизировать белки, необходимые для становления или поддержания слипчивых соединений.

CONCLUSION

We show here that β2.1 is essential for cardiac development and function. Specifically, β2.1 is critical for regulation of cardiomyocte proliferation and for the integrity of cardiomyocyte adhesions, mostly likely mediated through adherens junctions. Although potentially indirect, both of these functions represent novel roles for a ? subunit.