Онтогенетическое развитие сложный процесс, который нуждается в механизмах точного контроля. Регуляция своевременности событий в ограниченных областях тела пока понята недостаточно. Однако имеются доказательства, подтверждающие, что транскрипционные факторы участвуют в менежменте онтогенетических процессов. Семейство hox генов содержит группу транскрипционных факторов и известно как один из основных игроков в регуляции развития. Hox гены организованы в кластеры и обладают определенными пространственным и временным паттернами экспрессии во время развития (Hart et al., 1985; Harding et al., 1985; Duboule et al., 1986; Gehring, 1987). Hox гены сильно законсервированы у широкого набора видов и обнаруживают сходные характеристики экспрессии градиентов вдоль их осей тела (Krumlauf, 1994).

Базируясь на исследованиях на животных, предложены три гипотезы регуляции экспрессии hox генов: (1) spatial, (2) temporal collinearity и (3) posterior prevalence.

Пространственная колинеарность впервые была описана на Drosophila (Lewis, 1978), продемонстрировав прямую ассоциацию определенных hox мРНК с сегментами bithorax. Пространственная колинеарность была предложена Dolle et al. (1989) для развития конечностей мышей и гонад (Dolle and Duboule, 1989). Позиция Hox генов на хромосоме соответствует реципрокной последовательности экспрессии их мРНК вдоль оси тела. Т.о., гены, расположенные на 5' конце кластера кодируют мРНК, важные для дистальных/каудальных регионов, тогда как те, что на 3' конце кодируют мРНК, участвующие в проксимальных/ростральных регионах (Duboule and Dolle, 1989; Galliot et al., 1989; Dolle et al., 1989, 1991a, b; Graham et al., 1989; Wilkinson et al., 1989; Gaunt, 1991; Hunt et al., 1991; Izpisua-Belmonte et al., 1991a; Kessel and Gruss, 1991; Hunt and Krumlauf, 1992). В соответствии с данными, полученными на животных моделях, HOXB13, по-видимому, важен для развития простаты у человека (Dhanasekaran et al., 2005), тогда как HOX паралоги групп 1-3, по-видимому, играют роль в развитии передней кишки (Yahagi et al., 2004).

Гипотеза временной колинеарности предполагает, что Hox кластеры экспрессируются от 5' к 3' во временной последовательности. Подтверждающие доказательства для "hox-clock" (Duboule, 1994; Kmita and Duboule, 2003) были описаны у мышей (Dolle et al., 1989), мышей и Drosophila (Izpisua-Belmonte et al., 1991b) и у кур (Dolle et al., 1991a).

Гипотеза posterior prevalence тесно связана с временной колинеарностью поскольку она также постулирует плодное доминирование задних (т.e., расположенных на 5' на хромосоме) над передними генами, экспрессирующимися в том же самом домене. Такое заднее доминирование предположено для развития Drosophila (Gonzalez-Reyes and Morata, 1990) и мышей (Duboule, 1991; Duboule and Morata, 1994).

Функциональная важность hox генов во время развития также становится очевидной благодаря некоторым мутациям потери функции (Carpenter et al., 1993; Condie and Capecchi, 1993; Favier and Dolle, 1997; Kondo et al., 1998). Потеря Hoxd13 приводит к тяжелым уродствам конечностей у мышей (Davis and Capecchi, 1996; Kmita et al., 2005). Hoxd12 и Hoxd13, как было установлено, важны для развития анального сфинктера мышей (Kondo et al., 1996) и терминальной части кишки (Mark et al., 1997), а Hoxa13 участвует в развитии задней кишки у кур (Roberts et al., 1995, 1998; de Santa Barbara et al., 2002). Дисфункция Hoxd11 у мышей вызывает уродства передних конечностей и крестцовой кости, и вызывает неполное развитие мышц подвздошно-слепокишечной переходной зоны (Davis and Capecchi, 1994; Davis et al., 1995; Zakany et al., 1996, 1997). Делеция Hoxd8 - Hoxd10 приводит к полной потере "переднего региона", содержащего проксимальные части передних и задних конечностей и всю абдоминальную область у мышей (Noordermeer et al., 2011). Нокаут всех групп hox паралогов 3, 4 и 5 приводит к уродствм шеи, групп 5-9 к уродствам грудного отдела, группы 10 поясничной части позвоночника и группы 11 к уродствам крестцовой кости и хвоста (Mallo et al., 2010). У людей мутации HOXA13 и/или HOXD13 вызывают аномалии развития рук, ног и гениталий (Goodman, 2002).

Хотя имеется несколько исследований на животных моделях, мало информации о функциональной роли HOX генов у человека. Наиболее выдающимися генетическими ассоциациями hand-foot-genital синдрома с HOXA13 (Mortlock et al., 1996; Goodman et al., 2000) и Guttmacher синдрома (Guttmacher, 1993; Innis et al., 2002) или брахидактилии и синполидактилии с HOXD13 и ассоциация HOXD13 с VACTERL (Akarsu et al., 1996; Goodman et al., 1997, 1998; Johnson et al., 1998; Kan et al., 2003; Zhao et al., 2007; Garcia-Barcelo et al., 2008). Однако неизвестно следует ли экспрессия генов HOX в соответствии с пространственной или временной колинераностью в развитии человека. Благодаря этическим и законным ограничениям исследования развития человека ограничены коротким временным промежутком развития 6 - 12 недель, что ограничивает функциональные онтогенетические исследования немногими органами. В это время задняя кишка подвергается важным онтогенетическим изменениям. Энтодермальная дифференцировка начинается с 6 недели и заканчивается на 9 неделе, сопровождаемая мезенхимной дифференцировкой мышечных слоёв на 7 неделе (Fritsch et al., 2007). На 10 неделе мышечные слои далее дифференцируются и это завершается на 12 неделе, когда мышцы достигают своего финального положения (Fritsch et al., 2010). Регуляция этих ступеней развития сегодня изучена плохо; однако функциональное участие HOX генов очень вероятно. Детальное знание молекулярных процессов (так как это суммировано Grapin-Botton, 2005, касательно животных) необходимо, чтобы ответить на вопросы развития человека (Lappin et al., 2006). Следовательно, изучение экспрессии HOX мРНК в определенных группах клеток во время определенных стадий развития д. предоставить важную информацию.

Для лучшего понимания процессов, участвующих в развитии задней кишки человека, мы собрали образцы, соответствующие возрасту развития 6 - 12 недель. Недавно разработан надежный метод исследования экспрессии мРНК во вновь полученных, а также в архивных выборках (Illig et al., 2009, 2010). Использование этого метода позволило продемонстрировать четко ограниченную в пространстве и времени экспрессию девяти HOX генов из заднего кластера в развитии задней кишки человека и у взрослых.

DISCUSSION

Полученные данные относительно паттерна экспрессии наиболее задних групп паралогов HOX paralogues groups (HOXPGs) показывают временные и пространственные профили экспрессии HOX генов во время эмбрионального развития и у взрослых в задней кишке человека. Наш данные согласуются с предполагаемой пространственной и временной колинеарностью, а также с моделью заднего превалирования. Однако помимо некоторого сходства, наблюдается заметные отличия по сравнению с животными моделями.

Comparability of Animal Models and Human Development

Наши данные строго подтверждают идею точной регуляции временной и пространственной экспрессии HOX генов во время развития человека (Fig. 7A). Мы наблюдали организованную экспрессию нескольких HOX членов из заднего кластера в определенных клеточных популяциях задней кишки (Fig. 7A). Экспрессия мРНК HOXA11 и HOXA13 уже была установлена в эпителии и мезенхиме в самых ранних образцах (6 недель). Экспрессия мРНК HOXA11 и HOXA13 остается стабильной вплоть до 11 недели. Заметная экспрессия Hoxa13 наблюдалась также в эпителии задней кишки грызунов, но не в мезенхиме (Warot et al., 1997; Zakany and Duboule, 1999a, b) и в задней кишке кур (de Santa Barbara and Roberts, 2002) на соотв. стадиях развития. В противоположность, экспрессия HOXA11 в задней кишке, по-видимому, характерное свойство для человека, которая сохраняется и у взрослых (Figs. 3, 4). Несмотря на ограниченную экспрессию в слепой кишке кур (Yokouchi et al., 1995), экспрессия Hoxa11 преимущественно ассоциирует с развитием скелета и мочеполового тракта (Small and Potter, 1993; Davis et al., 1995; Hsieh-Li et al., 1995; Zhao and Potter, 2001, 2002; Wellick et al., 2002; Wagner and Lynch, 2005; Wellick, 2011).

Слабое окрашивание на мРНК HOXD12 и HOXD13 наблюдается в задней кишке во время недели 6. HOXD12 снижается ниже границ детекции между 7 и 8 неделей и появляется повторно на 9 неделе в эпителиальных и мезенхимных клетках и далее персистирует вплоть до 11 недели. Мы наблюдали экспрессию во всех 5 образцах, полученных на 6 неделе, но ни в одном случае, полученном в образцах 7 и 8 недель (всего 9 образцов). На 9-11 неделе все образцы давали хорошо согласующиеся результаты. Итак, мы может быть уверены, что наши наблюдения в самом деле отражают изменения в уровнях мРНК. Однако мы не можем судить, насколько близки границы детекции уровней. Т.о., действительные флюктуации в экспрессии мРНК могут быть значительно мнее драматическими, чем это наблюдается. Так, Izpisua-Belmonte et al. (1991b) не наблюдали экспрессии Hoxd12 в терминальной части задней кишки мышей, а исследования Dolle et al. (1991a) и Kondo et al. (1996) выявили её экспрессию в окружающей мезенхиме. Экспрессия HOXD13 начинает распространяться на окружающую мезенхиму между 7 и 8 неделей и сохраняется вплоть до недели 12, это согласуется с находками, описанными для животных моделей (Dolle et al., 1991a, b; Kondo et al., 1997; Roberts et al., 1998). В нашем исследовании мы наблюдали широко распространенное пространственное и временное сосуществование HOXA13 и HOXD13. Это согласуется с находками у мышей, для которых подтверждена Hoxa13-зависимая экспрессия Hoxd13 (de Santa Barbara and Roberts, 2002). Напротив, исследования на крысах свидетельствуют в пользу экспрессии Hoxd13 прежде Hoxa13 (Mandhan et al., 2006). Т.к. мы наблюдали обе мРНК с самой ранней исследованной стадии, мы не можем судить о потенциальной взаимозависимости их у человека.

Potential Role of HOX Genes in Development

В нашем исследовании мы установили, что HOXA13 и HOXD13, которые, по-видимому, чрезвычайно важны для широкого разнообразия видов, также широко экспрессируются у людей (Fig. 7A). Мутации с отсутствием функции в HOXA13, как было установлено, являются причиной hand-foot-genital (OMIM 140000; Stern et al., 1970; Mortlock and Innis, 1997; Goodman et al., 2000) и Guttmacher (OMIM 176305; Guttmacher, 1993; Innis et al., 2002) синдромов у человека. Оба синдрома также включают тяжелые нарушения развития конечностей и мочеполовой системы. С HOXD13-связанные онтогенетические нарушения в основном затрагивают развитие конечностей, но оказываются также скоррелироваными в нарушениями в задней кишке в одиночном случае (Garcia-Barcelo et al., 2008). Исследования на позвоночных подтверждают, что нормальная экспрессия Hoxd13 является обязательным условием корректного развития структур в большинстве задних регионов вдоль первичной и вторичной осей тела (van der Hoeven et al., 1996; Johnson and Tabin, 1997). В соответствии с этим, гетеро- и гомозиготные делеции Hoxd13 вызывают нарушения в мышечных слоях и внутреннем сфинктере задней кишки мышей (Kondo et al., 1996; Mark et al., 1997; Warot et al., 1997).

HOXD12 мРНК обнаруживает сильные флюктуации в развитии задней кишки человека, это может соответствовать недвусмысленным данным, описанным для экспрессии Hoxd12 в эпителиальном и мезенхимном слоях мыши (Izpisua-Belmonte et al., 1991b; Kondo et al., 1996). Kondo et al. (1996) и Zakany and Duboule (1999a) подтвердили, что Hoxd12-индуцированная экспрессия Hoxd13 необходима для развития мышц сфинктера у мышей. У людей экспрессия HOXD13, по-видимому, не зависит от HOXD12. Напротив, высокая экспрессия HOXA11 и HOXA13 в эпителиальных и мезенхимных клетках на неделе 6 предшествует появлению мРНК HOXD12 и HOXD13, которые не обнаруживаются в мезенхиме до недели 8.

Интересно, что во время развития мРНК HOXA11 постоянно экспрессируется в задней кишке человека, но не мыши. В противовес задней кишке заметная экспрессия обнаруживается при разитии в осевом скелете, конечностях и мочеполовой системе кур (Burke et al., 1995; Davis et al., 1995; Nelson et al., 1996; Taylor et al., 1997; Zhao and Potter, 2002; Lynch et al., 2004) и у млекопитающих (Wagner and Lynch, 2005). В согласии с исследованием Connell и коллег (2009) , которые предположили участие HOXA11 в пролиферации фибробластов человека в маточно-крестцовых связках, нокдаун Hoxa11 у мышей приводит к измененному развитию маточно-кресцовых связок и матки (Ma et al., 2012). Отсутствие функции HOXA11 было ассоциировано с лучелоктевым синостозом с амегакариоцитарной тромбоцитопенией у человека (OMIM 605432; Thompson and Nguyen, 2000); не обнаружено ассоциаций нарушений с развитием задней кишки.

В противоположность развитию мышей (Zeltser et al., 1996; Cillo et al., 2001), у которых обнаружена пространственная экспрессия Hoxb13 вдоль первичной оси задней кишки, мочеполового тракта и заднего конца спинного мозга, не обнаружено мРНК HOXB13 в органах живота и таза человека. Экспрессия HOXB13 обнаружена в эпителии развивающейся трахеи и пищевода в нашем исследовании и в пролиферирующих фибробластах дермиса плодов Stelnicki et al. (1998) и Cazal and colleagues (2006) в минорных слюнных железах человека. Однако недавнее исследование, связанное с поиском мутаций зародышевой линии в HOXB13 и ассоциированным высоким риском рака простаты (Ewing et al., 2012) подтвердило возможное участие HOXB13 на стадиях развития, не исследованных здесь.

Экспрессия HOXC11 наблюдалась с плодной 16 недели до рождения в почках, скелетных мышцах и тонком кишечнике человека Mitchelmore et al. (1998), но не наблюдалась в задней кишке во время развития на 6-12 неделе или во взрослых тканях (данное исследование). Тем не менее экспрессия мРНК HOXC11 наблюдалась в эпителии кровеносных сосудов на 9-й неделе. У мышей самая ранняя экспрессия мРНК Hoxc11 обнаруживалась в нервно трубке и позднее в презумптивных регионах мочеполового тракта, бедренной и малоберцовой кости (Hostikka and Capecchi, 1998), и в превертебральном столбе змей (Di-Poi et al., 2010).

HOXC12 и HOXC13 мРНК не были обнаружены в наших абдоминальных образцах. Вместо этого мы обнаруживали HOXC12-позитиывные клетки в коже подошв в начале 11-й недели, HOXC13-позитивные фибробласты в грудной коже на 9-й неделе. Экспрессия этих мРНК также обнаруживалась сильно ограниченной в животных моделях (Suemori and Noguchi, 2000). Эксперименты на мышах показали, что делеция Hoxc13 ведет к потере волос и потовых желез (Godwin and Capecchi, 1998), но не вызывает изменений во внутренних органах.

Hoxd11, как полагают, экспрессируется в каудальных сегментах поясничного отдела позвоночника, модулируя экспрессию Hoxd10 во время развития позвоночного столба у кур (Misra et al., 2009). У мышей пространственная и временная экспрессия Hoxd11 наблюдалась вдоль оси тела во время развития осевого склета и конечностей (Davis et al., 1995; Favier et al., 1995, 1996; Kondo et al., 1997; Zakany et al., 1997; Zakany and Duboule, 2007), и в зачатках гениталий и дистальных частей конечностей (Spitz and Duboule, 2005). Обе находки мы не смогли подтвердить для развития в период 6-12 недель у людей и во взрослой ткани прямой кишки. Напротив, мы наблюдали некоторые фибробласты, экспрессирующие HOXD11 мРНК в рыхлой соединительной ткани у 9-недельных плодов.

Potential Role(s) of HOX Genes in Adulthood

Помимо хорошо известных функций Hox генов во время развития c помощью установленных ими Hox кода, роль Hox генов у взрослых остается неясной. Недавиние исследования подчеркнули,что HOX гены могут ирать устойчивую роль в поддержании позиционных качественных особенностей и в региональном регенеративном процессе в течение всего периода жизни организма (Yahagi et al., 2004). Chang et al. (2002) , а также Shah и Sukumar (2010) подтвердили, что одной из функций происходящей экспрессии HOX может быть тканевой гомеостаз. Потенциальные функциональные взаимоотношения между непрерывной экспрессией HOX и позиционными качественными особенностями клеток у взрослых,как было установлено, для гладкомышечных клеток человека (Chi et al., 2007) и для скелетных мышечных клеток (Donoghue et al., 1992; Grieshammer et al., 1992). Wang с коллегами (2009) подтвердили эту теорию, показав, что продолжающаяся экспрессия HOXA13 в фибробластах кожи ладоней человека обеспечивает позиционную память вновь генерируемым эпидермальным клеткам. HOX гены, как было установлено, специфицируют дистальную эпидермальную дифференцировку у взрослых (Rinn et al., 2007). В соответствии с этим в нашем исследовании тех же самых четырех задних НOX генов, а именно, HOXA11, HOXA13, HOXD12 и HOXD13, которые экспрессируются во время развития задней кишки, оставались активными и у взрослых (Fig. 7B). Заслуживает внимания, что экспрессия HOX генов супрессируется в тесной близи от ректальных раковых выборок (Illig et al., 2009), тем самым вычленяются различия между CDX2-позитивной опухолью от здоровой позитивной по HOX гену ткани за счет тонкого слоя клеток, которые были негативны как по HOX , так и CDX2. Напротив, в др. исследовании ректальных тканей человека описано отсутствие экспрессии HOXD13 в нормальной ткани, но усиление в неопластической ректальной ткани (Cantile et al., 2009). Кроме того, различающиеся результаты были описаны в двух исследованиях, касающихся экспрессии HOXB13 в ткани толстой кишки человека. В то время как Jung с коллегами (2005) выявили экспрессию HOXB13 в нормальной колоректальной ткани и уменьшение или потерю экспрессии в опухолях, наблюдения Edwards с когллегами (2005) выявили лишь маргинальную экспрессию HOXB13 в нормальной ткани толстой кишки, но убедительную повышенную экспрессию в колоректальных аденокарциномах. Более того, дивергентные паттерны экспрессии Hoxb13 и HOXB13 наблюдали также в ткани простаты (Economides and Capecchi, 2003; Takahashi et al., 2004; Edwards et al., 2005). Необходимц дальнейшие исследования.

Methodical Considerations

mRNA detection in archival tissue is not an easy issue and might be prone to false negative results and consequently misleading comparisons to animal models. In this respect, it is important that we observed positively labeled cells for all mRNAs investigated, a fact suggesting that areas devoid of labeling are actually lacking detectable amounts of the respective mRNA. Moreover, cellular mRNA distribution patterns of HOXA11, HOXA13, HOXD12, and HOXD13 were reproduced by immunohistochemistry at the protein level, which is especially important to exclude potential false positive results.

Conclusions

Based on our data, we suggest an initial expression of HOXA11 and HOXA13, which precede the expression of HOXD13 and potentially HOXD12 during human hindgut development (Fig. 7A). It is noteworthy that the same HOX genes were expressed in adult rectal tissue (see Fig. 7A,B), which may support the proposed function of the ongoing HOX expression in tissue homeostasis (Chang et al., 2002).

Spatio-temporal expression of HOX genes in human hindgut developmentRomana Illig, Helga Fritsch, Christoph Schwarzer Developmental Dynamics Volume 242, Issue 1, pages 53–66, January 2013

Spatio-temporal expression of HOX genes in human hindgut development
Romana Illig, Helga Fritsch, Christoph Schwarzer
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 1, pages 53–66, January 2013