Поверхностный эпителий тонкого кишечника являются динамичной тканью, которая подвергается полному самообновлению каждые 3–4 дня [1]. Эпителийпредставлен двумя основными повторяющимися сруктурными единицами: (a) криптами Lieberkuhn, которые расположены на дне слизистой и прродолжаются в (b) в ворсинки, пальцеподобные выпячивания, которые простираются в просвет. Это динамичное самообновление осуществляется из пропуляции ISCs, расположенных внутри крипт, которые функционируют как “ниши” стволовых клеток. Пролиферирующие идифференцирующиесся клетки мигрируют вверх в ворсинки, где они в конечном итоге погибают и слущиваются в просвет.

В течение многих лет идентификация ISCs была очень желанной, но только идентификация двух маркеров ISC в последние годы сделала возможным прогресс в понимании биологии кишечника [2, 3]. Профиль экспрессии этих двух маркеров ISC , Bmi1 [3] и Lgr5 [2], показал, что существуют две самостоятенльные популяции ISC. Клетки, экспрессирующие Bmi1 располагаются в +4 позиции относительно дна крипты. Позитивные по Lgr5 клетки быстро превращаются в columnar base cells (CBCs), при этом приблизительно 14 из этих клеток смешиваюттся с Paneth клетками надне крипты. Обе эти популяции обладают характеристиками стволовых клеток, они самообновляются, мультпотентны и важны для поддержания крипт [4]. Однако др. признак стволовых клеток, покой обнаруживается сегодня только в Bmi1 клетках [5] и не является свойством ежедневно делящихся клеток CBCs. Базируясь на маркерах, было предположено, что крипты содержат две популяции стволовых клеток. Первая из них это популяция активных делящихся стволовых клеток, представленная Lgr5-меченными CBCs [6]. Вторая это Bmi1 позитивная популяция стволовых клеток в положении +4, которая способствует увеличению и самообновлению Lgr5 популяции. Недавно эта модель, показала in vivo and in vitro , что в результате гибели или под действием дифтерийного токсина или радиации Lgr5 популяции, популяция Bmi1 в самом деле может действовать, чтобы заместить Lgr5 популяцию [7, 8].

Эта концепция двух популяций ISCs в дальнейшем была усложэнена двумя недавними сообщениями, которые продемонстрировали, что самообновление ISCs следует рисунку нейтрального дрейфа и элегантно установили пул эквипотентных стволовых клеток, которые регулируются своими соседями [9, 10]. Это вместе с наблюдением, что Lgr5 клетки экспрессируют наивысшие уровни Bmi1, указывает на то, что Bmi1 и Lgr5 метки перекрываются, если не идентичны в ISC популяциях [9, 11]. Одним из критических остается вопрос, как эти разные компартменты стволовых клеток взаимодействуют, особенно во время процесса регенерации крипт.

Возможно, что некоторые аспекты ответов на эти вопросы будут найдены путем проверки взаимодействий между ISCs и соседними с ними клетками внутри ниш, крипт стволовых клеток. В самом деле предыдущее предположение, что “стволовость” CBCs тесно связана с присутствием соседних с ними Paneth клеток [9], теперь было подтверждщено in vitro и in vivo [12]. Доказательтва, полученные в предыдущих исследованиях, в которых истощение или делеции Paneth клеток подтвердили, что они были несущественны для эпителиального гомеостаза в кишечнике, после более тщательной проверки было показано, что существуют только Lgr5 ISCs, и они могут конкурировать за важные сигналы ниш, предоставляемые их специализированными дочерными Paneth клетками [12].

Приведенные выше исследованияя проверяли роль клеток Paneth в отношении, по-видимому, нормальных ISCs. Важность клеток Paneth в ситуации, при которой популяция ISC повреждена, всё ещё неясна. Одним из таких обстоятельств являются последствия потери функции β-catenin, кондиционная делеция которого,как было установлено, ведет к разным и конфликтующим результатам [13, 14]. Первые из них [14] использовали tamoxifen (TAM) индуцибельный вариант Cre recombinase, экспрессируемой под контролем промотора гена villin, чстобыв управлять индукцией Cre специфически только в кишечном эпителии [13, 15, 16] (vil-Cre-ERT2). Используя эту систему, Fevr et al. [14] продемонстрировали быструю потерю временно амплиицирующихся клеток, структур крипт, терминальной дифференцировки ISCs, и потерю кишечного гомеостаза и функции после делеции β-catenin. Напротив, отдельное исследование использовало промоторный элемент гена cytochrome P450A1 (CYP1A1) крыс, чтобы управлять экспрессией Cre чувствительным к ксенобиотику способом, чтобы осуществить делецию индуцибельного гена в кишечном эпителии (Ah-cre) [13]. Ireland et al. [13] показали, что делеция β-catenin снова снижает жизнеспособность клеток; однако ось крипта-ворсинка в дальнейшем быстро заселется вновь нерекомбинантными клетками, экспрессирующими β-catenin и восстанавливается го меостаз. Принимая во внимание, что исследования с долговременнеым мечением показали, что как vil-Cre-ERT2 , так и Ah-cre модели индуцируют рекомбинацию в ISCs, механизмы, лежащие в основе этих разных исходов, неясны. Одной из возможностей является то, что эти две системы дифференциально управляют рекомбинацией внутри популяции стволовых клеток, так что vil-Cre-ERT2 система обусловливает большую пропорцию рекомбинаций в популяции ISC. Альтернативная возможность заключается в том, что vil-Cre-ERT2 модель делетирует CatnB в дифференцированных клетках, которые создают нишу для ISC. В последнем сценарии наиболее очевидным кандидатом являются клетки Paneth, так как было показано ранее они щадятся при Ah-cre [13]. Чтобы непосредстваенно оценить эти возможности, мы создали условия, при которых обе системы высвоборждали один и тот же уровень рекомбинации стволовых клеток и потом определяли дополнительный эффект рекомбинации в популяции Paneth клеток, используя систему vil-Cre-ERT2 . Анализ этих данных показал, что Paneth клетки очень чувствительнык к потере β-catenin и что его потеря критически нарушает способность кишечных крипт восстанавливаться после инсульта. DISCUSSION Недавно было предположено, что две популяции клеток содержат ISC. Одна маркируется экспрессией Bmi-1 и обнаруживается в положении 4 в крипте; вторая маркируется экспрессией Lgr5 и расположена в основании крипты. Сегодня остается неясным, как клетки переходят между этими популяциями, хотя было продемонстрировано, что Bmi-1 позитивная популяция может воспроизводить Lgr5 популяцию. Одной из интерпретаций этих данных является то, что Lgr5 популяция является “активным” пулом стволовых клеток, которая может быть пополнена из более пассивного Bmi-1 пула клеток. Эта активная Lgr5 популяция, по-видимому, зависит от взаимодействия с Paneth клетками внутри крипты, которые, как полагают, играют роль “питающих клеток” в поддержжании стволовости. Мы попытались выяснить это взаимдействие путем внесения повреждающих мутаций в популяцию ISC в присутствии или отсутствии Paneth клеток. Мы выбраали делецию β-catenin в качестве повреждающей мутации, т.к. во время предыдущих исследований были выявлены удивительно разнообразные фенотипические эффепкты потери β-catenin в зависимости от использованного Cre трансгена. Так, делеция обеспечиваемая vil-Cre-ERT2, ведет к катострофической потере эпителия и гибели животных в противовес Ah-cre обусловленной делеции, при которой наблюдается быстрое повторное засление WT клеток и отсутствие леальности.

Эти наблюдения привели к двум гипотезам. Согласно первой различия, наблюдаемые между двумя системами, являются прямым отражением разных скоростей рекомбинации внутри ISC компартмента (или Bmi-1 или Lgr5 позитивного). Согласноо второй различия возникают как следствие разных скоростей рекомбинации в дифференцированных клетках, таких как Paneth клетки. Чтобы оценить эти возможности, мы впервые определили режимы дозирования, которые должны обеспечить эквивалентные уровни рекомбинации ISC, при использовании любой Cre системы. Этим мы гарантировали, что различия фенотипов, наблюдаемые ранее, не будут обусловлены техническими различиями, связанными с использованием разных CatnB^flox аллелей. Мы осуществили повторно эксперименты с двумя линиями Cre и одним и тем же аллелем CatnB^flox 18. Для обоих Cre трансгенов мы наблюдали сходные фенотипы, которые ранее были описаны, мы наблюдали жизнеспособность и повторное замещение кишечника при использовании Ah-cre крипт и гибель прииспользовании vil-Cre-ERT2. Эти данные показывают, что фенотипические отличия не связаны с варьирующими уровнями функциональной рекомбинации ISC.

Ранее было показано, что основное различие в оценке вероятного рзличия клеточных типов в этих двух системах заключается в том, что Ah-cre не управляет рекомбинацией в клетках Paneth [13, 17]. Однако она управляет рекомбинацией в бокаловидных (goblet) клетках, др. секеторных клетках кишечного эпителияЭ в которых делеция CatnB ведет к потере goblet клеток[13]. Мы также подтвердили здесь, что Paneth клетки сохраняются в Ah-cre модели и показали, что потеря β-catenin в vil-Cre-ERT2 модели ведет к гибели Paneth клеток. Единственным объснением наших данных является то, что это критическое различтие между двумя моделями, касательно потери Paneth клеток оказывает выраженный эффект на способность регенерации крипт. Эта интерпретация подтверждается недавней работой, показавшей, что при использовании vil-Cre-ERT2 модели, чтобы делетировать Math-1 все Paneth клетки терялись, но архитектура крипт во всём остальном оставалась неизменной, т.к. др. Math-1-дефицитные клетки экспрессировали необходимые Wnts [28], тогда как др. модели делеции только Paneth клеток, демонстрировали потерю крипт [12]. Альтернативное объяснение заключается в том, что vil-Cre-ERT2 более эффектинво воздействует на потенциальный резерв популяции ISC. Поскольку наши данные четко показывают, что когда происходит репопуляция крипт, то она всегдда происходит из популяции не подвергшихся рекомбинации клеток, указывая тем самым, что Ah-cre и в сомом деле, сохраняет “резервную” популяцию стволовых клеток. Качественные особенности этой популяции неизвестны и отмечается, что отсутствует увеличение экспрессии гена Bmi-1, т.к. клетки, которые экспрессируют этот ген, как полагают, содержат “reserve ISC population.” Однако усиление распада крипт у Ah-cre мышей указывает на то, что резервная популяция происходит из ISC ниши. Представляет ли эта резервная популяцияe нерекомбинированныце ISCs или дедиференцированные ISC дочерние клетки, остается неизвестным.