Посещений:
ПОДДЕРЖАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ

Лабильность и стабильность

Maintaining differentiated cellular identity Johan Holmberg Thomas Perlmann
Nature Reviews Genetics 13, 429-439 (June 2012) | doi:10.1038/nrg3209

Различные исследования продемонстрировали, что соматические дифференцированные клетки могут быть перепрограммированы в др. состояния дифференцировки или плюрипотентности, демонстрируя тем самым, что дифференцированные клеточные состояния не являются необратимыми. Эти находки вызвали огромный интерес к процессу репрограммирования и механизмам, которые управляют плюрипотентным состоянием. Однако открытие, что дифференцированные клетки могут быть заставлены переключиться на существенно отличающийся клон, подчеркивает также, что необходимо понять, как качественные особенности зрелых клеток обычно поддерживаются. Здесь рассматриваются недавние исследования о том, как контролируются дифференцированные состояния на транскрипционном уровне и обсуждается новая информация о механизмах, лежащих в основе стабильного поддержания характеристик зрелых клеток.

Somatic cell nuclear transfer (SCNT).
The process by which the nucleus from an adult cell is transferred into a previously enucleated cell; the reconstructed oocyte is activated, which initiates subsequent development.

Reprogramming
The conversion of a differentiated cell to another cell type, either to another differentiated cell type (transdifferentiation) or to a progenitor (dedifferentiation).

Induced pluripotent stem cells (iPSCs).
Pluripotent cells that can be generated from many different types of somatic cells by expression of only a few pluripotency-related transcription factors and that have properties of embryonic stem cells.

Metaplasias
Environmentally induced processes in which one differentiated cell type is transformed into another differentiated cell type.

Heterokaryons
Non-dividing cells that contain two or more nuclei in a common cytoplasm as a consequence of cell fusion between cells of different identities.

Binary cell specification
The process through which two different cell types are specified from a common progenitor. Feedforward cascades Hierarchical organization of several transcription factors emanating from an initiating transcription factor that sequentially activates downstream transcription factors that in turn activate each other.

Terminal selectors
Transcription factors that directly control effector genes for determining mature cell identity. They typically act by binding conserved sequence motifs in multiple effector genes, such as in ion channel genes and other neuron-specific genes in neurons. They were first proposed by Hobert for Caenorhabditis elegans neurons but are potentially applicable to other mature cell types.

Effector genes
Genes that define the cell-type-specific functional properties of a terminally differentiated cell.

Epigenetic modifications
Heritable changes in gene expression that do not depend on a change in DNA sequence.

О Детерминации и дифференцировке
Центральным является вопрос, ассоциирована ли клеточная дифференцировка с необратимыми ограничениями способности продуцировать незрелые клетки, которые бы могли поддерживать развитие нового организма. В 1938, Hans Spemann1 подтвердил, что перенос клеточных ядер между разными клетками может решить этот фундаментальный вопрос. То, что дифференцированные клетки не являются необратимо зафиксированы в своих зрелых характеристиках, но сохраняют способность генерировать все др. типы клеток организма, в самом деле, было продемонстрировано в экспериментах по переносу ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer (SCNT)), при которых они оказались способны к репрограммированию в плюрипотентное состояние2,3. Многочисленные др. исследования подкрепили этот вопрос с помощью др. подходов, включая индуцированные слияния клеток и принудительную экспрессию ключевых онтогенетических транскрипционных факторов (BOX 1). Наиболее впечатляющим успехом стали достижения в области клеточной инженерии, это получение индуцированных плюрипотентных клеток, (induced pluripotent stem cells (iPSCs)) за счет принудительной экспрессии лишь немногих транскрипционных факторов4. Эти манипуляции, которые обсуждаются в многочисленных прекрасных обзорах5-7, четко демонстрируют, что дифференцированное состояние безусловно не 'окончательное' в том смысле, что оно является обратимым состоянием клетки. Однако более дифференцированные клетки наиболее трудно репрограммировать8 (reviewed in REF. 9), это указывает на то, что полностью зрелые клетки обладают экстраординарной способностью сохранять свои свойства дифференцировки.
Последствия потери фенотипа или неконтролируемой трансдифференцировки, конечно, должны быть вредными: рак ассоциирует с переходами, которые напоминают репрограммирование в более недифференцированные или даже в подобные плюрипотентным состояния10,11, а др. аномальные клеточные состояния, такие как те. что наблюдаются при определенных метаплазиях, характеризуются потерей нормальных клеточных характеристик (rev. REF. 12). В последние годы выявлены многочисленные сигнальные пути и транскрипционные механизмы, которые лежат в основе важных решений клеточных судеб и становлении признаков дифференцировки. Механизмы, которые гарантируют, что клеточные характеристики будут стабильно поддерживаться в клетках млекопитающих менее понятны, но растут наши знания о том, как предопределяются клеточные судьбы. В данном обзоре мы рассмотрим эксперименты, такие как слияния клеток и эктопическая экспрессия специфических транскрипционных факторов и обсудими, что они говорят нам о механизмах поддержания клеточных характеристик. Ключевые транскрипционные факторы, которые важны для спецификации клеточных особенностей во время развития часто остаются экспрессирующимися и в зрелых типах клеток. Мы также обсудим, как экспериментальные стратегии, такие как условное устранение огена у мышей, помогают понять, почему определенные транскрипционные факторы постоянно необходимы для предупреждения потери приобретенных клеточных характеристик, тогда как др. совсем несущественны для дифференцированных клеток. Мы опишем, как такие результаты могут быть связаны с функцией транскрипционных факторов внутри более или менее стабильных регуляторных сетей и как разные типы зрелых клеток могут отличаться в отношении из врожденной пластичности и склонности превращаться в альтернативные клеточные характеристики. Наконец, мы обсудим значение сохранения дифференцированных клеточных характеристик для болезней.

Box 1 | Different strategies to achieve reprogramming of cells

Differentiated cells are usually stably maintained and do not alter their phenotypes into alternative cellular identities. However, for more than 50 years, it has been evident that the differentiated state is not irreversible. Using different strategies, the following experimental paradigms have revealed a striking plasticity in the differentiated state.

Somatic cell nuclear transfer
Reprogramming into totipotency was first demonstrated by Gurdon's somatic cell nuclear transfer experiment, whereby a nucleus from a differentiated cell that had been transferred to an enucleated oocyte was reprogrammed so that it could support the development of an animal2. Such reprogramming has since then also been reproduced in mammals3.

Cell fusion
Cell fusion of somatic cells can form non-dividing multinuclear cells that are referred to as heterokaryons. They can be of different identity and species, and thus it is possible to analyse expression of markers from each original cell type and determine the extent of reprogramming13-15.

Induced pluripotent stem cells
A striking reprogramming method that may be of considerable importance for cell regenerative medicine is the demonstration that generation of induced pluripotent stem cells can be achieved by overexpression of a only a few key transcription factors in somatic cells: for example, POU domain, class 5, transcription factor 1 (POU5F1), SOX2, Kruppel-like factor 4 (KLF4) and MYC4.

Transdifferentiation by transcription factor expression
Direct reprogramming into alternative cellular identities (a process that is often referred to as transdifferentiation) can also be achieved as a result of forced transcription factor expression. This was first shown for myoblast determination protein 1 (MYOD1) that could convert fibroblasts into skeletal muscle cells24. Numerous examples have now been described and show that combinations of transcription factors can convert fibroblasts, for example, into other types of differentiated cells, such as macrophages, neurons and hepatocytes (reviewed in REF. 5).


Lessons from reprogramming


Heterokaryons and the importance of continuous instructive regulation.


Использование слияния клеток важно для разрешения вопросов, как дифференцированные клеточные характеристики поддерживаются. Индуцированные клеточные слияния дифференцированных клеток могут формировать многоядерные неделящиеся гетерокарионы, в которых ядра оригинальных клеток остаются интактными13,14. Гетерокарионы могут т .о. рассматриваться как предел экспериментов по избыточности функции, которые позволяют понять, как полное содержание одной клетки влияет на геном другой. Слитые клетки от одного вида с разными клеточными типами др. вида позволяют проследить видо-специфическую экспрессию маркерных генов в возникших гетерокарионах. Такого типа эксперименты демонстрируют, что неустановленные регуляторы одной клетки могут заставить активировать специфичные для типа клетки гены в ядре другой15. Так, когда мышечные трубки, мышей слитые с разными типами клеток человека, включая фибробласты, нервные клетки, кератиноциты, В лимфоциты или гепатоциты, то их признаки дифференцировки быстро супрессируются и индуцируются маркеры мышечных клеток человека15-20. Кажется, что если сливается партнер, который вносит количественно больший вклад цитоплазмы, то ядро будет доминировать и вызывать быстрое и эффективное репрограммирование генома партнера по слиянию19. Недавно начаты также исследования по изучению влияния гистоновых модификаций и метилирования ДНК на процесс репрограммирования в гетерокарионах20-22. Итак. эти данные подчеркивают важность заключения, что репрограммирование быстрое и высоко эффективное и не нуждается в осуществлении репликации ДНК для основных изменений в экспрессии генов и паттернов модификаций гистонов и ДНК.
Данные экспериментов п слиянию клеток подтвердили важную концепцию, что дифференцированное состояние постоянно управляется инструктивными регуляторами, которые остаются активными в неделящихся дифференцированных клетках. Эта идея была высказана ещё в 1991 Blau and Baltimore23 и базировалась на появившихся сообщениях о пластичности дифференцированных состояний, включая исследования по репрограммированию ядер гетерокарионов и события трансдифференцировки, индуцированные транскрипционными факторами.

Transcription-factor-induced reprogramming.


Активный интерес к тому, как типы клеток специфицируются из недифференцированных популяций стволовых клеток, продемонстрировал центральную роль транскрипционных факторов, которые регулируют прогрессивное развитие специфических клеточных клонов в окончательно дифференцированные состояния. Эти находки также выяснили стадию для более непосредственного исследования того, как специфические транскрипционные факторы вносят вклад в активное поддержание клеточных качественных особенностей. Функция транскрипционных факторов может быть, поэтому изучена с помощью индуцированной экспрессии в клетках, в которых они обычно не экспрессируются и с помощью экспериментов по потере функции, в которые определенные транскрипционные факторы были устранены.
Многочисленные исследования анализировали, как принудительная эктопическая экспрессия транскрипционных факторов влияет на клетки, продемонстрировав сильное клональное репрограммирование в пермиссивных клеточных контекстах. Это впервые было продемонстрировано в 1980s, когда Weintraub с сотрудниками24 показали, что мышце-специфический транскрипционный фактор myoblast determination protein 1 (MYOD1) может индуцировать образование мышечных трубок, когда он неправильно экспрессируется в делящихся фибробластах. Др. более недавние примеры включают переключение детерминированных эритроидных предшественников в моноцитарный клон или vice versa25-27, клональное превращение предшественников мышечных клеток в клетки коричневого жира28 и многочисленные примеры мощного клонального переключения в предшественниках ЦНС29-33. При спецификации клеточных судеб транскрипционные факторы часто участвуют в перекрестной ингибирующей регуляции др. транскрипционных факторов, чтобы регулировать действительно исключительные онтогенетические бинарные решения спецификации клеток (FIG. 1a). Такая детерминация клеточных судеб сопровождается упреждающей индукцией дополнительных транскрипционных факторов, которые кооперативно осуществляют продолжение процесса дифференцировки, как это схематически представлено на FIG. 1a. Такие упреждающие каскады гарантируют правильность и специфичность регуляции и часто обнаруживаются как один из основных мотивов регуляторной сети, используемой в развитии (rev. REFS 34,35). Транскрипционные факторы могут безусловно воспроизводить такие регуляторные события и могут также индуцировать эффективное бинарное переключение в подходящих клеточных контекстах, в которых они были эктопически экспрессированы (rev.REF. 5). Др. экспериментально индуцированные изменения судеб приводили к более драматическим онтогенетическим 'скачкам' - процесс, часто обозначаемый как трансдифференцировка - и происходили они, по-видимому, благодаря механизмам, которые не в точности воспроизводят переключения нормального развития клеточных судеб.



Figure 1 | Feedforward regulatory cascades of transcription factors functioning in cell development and maintenance. a | A simple developmental binary stem cell switch. The two transcription factors A and D are autoregulating their own expression and are also involved in a mutual cross-inhibitory regulation. Owing to a shift in the balance between A and D expression - for example, as a consequence of a developmental signalling event - cell lineage specification directs the differentiation into either cell type 1 or cell type 2. During the progressive development of these cell types, feedforward induction of additional transcription factors leads to the co-expression of several lineage-specific transcription factors (A, B and C in cell type 1 and D, E and F in cell type 2). The transcription factors expressed during differentiation are also often continuously expressed in mature cells. Numerous examples of such binary switching and feedforward regulation has been described (for examples, see REF. 5). b | Transcription factors, referred to as terminal selectors, have key roles in, for example, Caenorhabditis elegans neuron-specific lineage determination and maintenance44. In the example on the left, the terminal selector A controls lineage-specific target genes (shown by the DNA under the arrows) by binding to common cis-regulatory elements in target genes. Binding of A to two of the effector genes is illustrated in more detail. To the right, a hypothetical more complex regulatory logic in higher vertebrates is illustrated. A more elaborate network of transcription factors (A, B, C and D in this example) are maintained in a regulatory network. Target genes are not all regulated by a similar cis-regulatory logic. Instead, different combinations of lineage-specific transcription factors are co-regulating different subsets of target genes in distinct ways, as illustrated in the three examples.

Напр., в некоторых исследованиях индуцированное транскрипционным фактором клональное перепрограммирование фибробластов в типы клеток, такие как кардиомиоциты, нейроны или макрофаги происходит без перехода через промежуточное недифференцированное состояние36-42. Перепрограммирование in vivo взрослых экзокринных панкреатических клеток в инсулин-продуцирующие β-клетки за счет неправильной экспрессии трех панкреатических онтогенетических транскрипционных факторов у взрослых мышей представляет др. пример трансдифференцировки, которая не нуждается в переходе через состояние пролиферативных предшественников43. Широко распространенной темой в этих экспериментах является использование комбинаций некоторых транскрипционных факторов, подчеркивается, что отобранные комбинации факторов обладают выраженной инструктивной способностью, которая не зависит от онтогенетического контекста. Эта концепция хорошо согласуется с экспериментами на гетерокарионах, которые продемонстрировали, что устойчивая инструктивная регуляция определяет качественные особенности дифференцированных клеток.

Instructive transcription factor networks


Были предприняты исследования, чтобы понять, как транскрипционные факторы, которые необходимы во время ранней спецификации клеточных судеб и которые остаются экспрессирующимися в дифференцированных клетках, также вносят вклад в дифференцированные клеточные характеристики в зрелых клетках. Ряд таких экспериментов оказался сфокусированным на нервных клетках, которые являются интересной моделью для характеризации механизмов, которые необходимы для поддержания стабильных клеточных характеристик благодаря свой продолжительной жизни у высших животных.

Качественные особенности нейронов C. elegans поддерживаются за счет терминальных селекторных генов


Простой план тела у полностью развитых особей Caenorhabditis elegans делает возможными генетические исследования, которые выявляют механизмы, лежащие в основе развития нейронов, а также механизмы, которые важны для поддержания свойств нейронов. В развивающихся клонах нервных клеток последовательно действуют регуляторные импульсы, инициирующие экспрессию специфичных для типа нейронов транскрипционных факторов, которые иногда обозначаются как терминальные селекторы, чья экспрессия поддерживается в течение всей жизни зрелых нейронов (rev. REF. 44) (FIG. 1b). Транскрипционные факторы могут быть эффективными индукторами клеточных характеристик благодаря своей способности контролировать экспрессию различных генов (которые здесь обозначены как эффекторные гены), которые скоординировано вызывают фенотипы определенных типов клеток. Терминальные селекторы поддерживают свою собственную экспрессию путем авторегуляции, тем самым гарантируя стабильное сохранение клеточных характеристик. Напр., сенсорные нейроны (ASE neurons) поддерживаются таким способом с помощью CHE-1, транскрипционного фактора, который регулирует ASE-специфические гены путем соединения с 'ASE-мотивами'45-47. У C. elegans che1-нулевых мутантов, ASE нейрональные признаки теряются, тогда как сохраняются всеобщие нервные характеристики без очевидного приобретения альтернативной нейрональной судьбы. Это указывает, что хотя терминальный селекторный ген che-1 постоянно необходим для поддержания ASE-нейрон-специфичных фенотипов, более характерных для определенного класса, клеточные признаки, которые общи с др. нейронами, не поддерживаются терминальными селекторами. Поддержание др. нейрон-специфичных характеристик следует сходной логике: напр., в механосенсорных и AIY промежуточных нейронах, которые зависят от постоянной активности MEC-3-UNC-86 и TTX-3-CEH-10 гетеродимеров. соотв.48-52. Признаки холинергических двигательных нейронов контролируются специфической цис-регуляторной сигнатурой и непрерывной экспрессией транскрипционного фактора UNC-3 (REF. 53). исходя из этих и др. примеров становится очевидным, что качественные особенности нейронов C. elegans преимущественно поддерживаются за счет простой регуляторной логики, которая зависит от постоянной инструктивной активности немногих ключевых транскрипционных факторов, которые специфически экспрессируются в разных типах клеток (FIG. 1b).

Figure 2 | Guardians of differentiated cell identities. Examples of differentiated cell types that are controlled by key transcription factors, as revealed by conditional gene ablation experiments. a | Conditional targeting of paired box gene 5 (Pax5) in mature B cells leads to the generation of uncommitted proliferating progenitors that can differentiate into T cells and along the more distant macrophage lineage. b | The targeting of forkhead box P3 (Foxp3) in regulatory T cells (TReg cells) leads to direct reprogramming into T helper 1 (TH1) cells. c | Conditional targeting of prospero-related homeobox 1 (Prox1) in lymphatic endothelial cells leads to direct reprogramming into blood endothelial cells. d | Conditional targeting of forkhead box L2 (Foxl2) in adult ovaries leads to the induction of Sertoli and Leydig cells. Interestingly, the ablation of doublesex and mab-3 related transcription factor 1 (Dmrt1) in the adult testis leads to induction of granulosa-like cells, demonstrating that differentiated cells in both female and male gonads are labile and susceptible to transdifferentiation.

Transcription factor combinatorial codes.


Действуют ли сходные принципы у более сложных организмов, таких как млекопитающие, которые обладают нервной системой, состоящей из нескольких сотен разных типов клеток? Интересно, что многие гены, которые специфически экспрессируются в фоторецепторах сетчатки мыши, контролируются за счет непосредственного связывания гомеодоменового транскрипционного фактора CRX, указывая. что этот транскрипционный фактор может быть определен как терминальный селектор у млекопитающих54. Напротив, др. наблюдения у высших позвоночных указывают на более сложную регуляцию. Несмотря на то, что C. elegans специфичные для допаминовых нейронов признаки контролируются с помощью AST-1 (REF. 55), экспрессия генов допаминового пути у мыши не зависит от его аналога у млекопитающих ETV1 (REF. 56). Вместо этого, по-видимому, значительно большая панель транскрипционных факторов контролирует дифференцировку у млекопитающих57,58, в частности, используя сложное и ещё плохо изученное комбинаторное кодирование, причем субнаборы эффекторных генов контролируются разными комбинациями транскрипционных факторов; только когда транскрипционные факторы экспрессируются совместно они могут индуцировать полный репертуар соотв. генов дифференцировки (FIG. 1b). Это может быть расширением простого комбинаторного кодирования, которое наблюдается для некоторых типов клеток у C. elegans: напр., TTX-3-CEH-10 и MEC-3-UNC-86 гетеродимерные пары совместно регулируют гены дифференцировки в AIY и механосенсорных нейронах, соотв. 49-51.
Коды транскрипционных факторов могут возникать из простой упреждающей (feedforward) индукции, как показано на FIG. 1a. Пептидергические подтипы нейронов у Drosophila melanogaster предоставляют подходящий пример. Эти типы клеток специфицируются за счет упреждающей индукции за счет индукции транскрипционных факторов, которые создают родственные, но уникальные коды транскрипционных факторов с разным объемом информации в дифференцирующихся постмитотических нейронах59. Интересно, что неправильная экспрессия факторов, определяющих один из этих клеточно-специфичных кодов ведет к драматической эктопической активации нейропептидергических генов в большом количестве нейронов, независимо от их онтогенетической истории, демонстрируя тем самым, что определенная комбинация транскрипционных факторов может быть достаточной для инструктирования генома по изменению репертуара эффекторных генов59. Важно, что при условном устранении, как недавно было установлено, эти онтогенетические транскрипционные факторы постоянно необходимы в зрелых нейронах для поддержания своей качественной особенности60. Т.о., регуляторные каскады, которые участвуют в развитии, по-видимому, генерируют окончательные состояния имеющихся сетей транскрипционных факторов, которые сами по себе способны предоставить полный и достаточно инструктивный 'код' для поддержания программ специфичной для типа клеток экспрессии генов в дифференцированных клетках.

Control of labile differentiated states


Guardians of differentiated cell identity in mammals.


Недавно были проведены исследования для выяснения степени, с которой транскрипционные факторы участвуют в спецификации клеточных характеристик, необходимые постоянно для поддержания этих качественных особенностей. Эти исследования помогли путем увеличения доступности линий мышей, которые были преобразованы, чтобы экспрессировать Cre рекомбиназу, используя тканеспецифические промоторы. Эти линии включали и те, что экспрессировали tamoxifen-индуцибельный Cre-ERT2 для эксцизии LoxP-flanked генов мишеней в необходимый временной момент61. Эти модели сделали возможной устранение гена в дифференцирующихся тканях мышей, тем самым сделав возможными эксперименты, которые могут отличать между дефектами, возникающими в результате разрушения онтогенетических в противоположность поддерживающим механизмам. Устранение некоторых транскрипционных факторов в дифференцирующихся клетках млекопитающих приводило к драматической потере фенотипа, что сопровождалось приобретением альтернативной судьбы62-69, демонстрируя существование индивидуальных транскрипционных факторов, которые критически участвуют в обеспечении дифференцированного состояния (FIG. 2). Как они выполняют такую фундаментальную роль и что они выявляют относительно типов клеток, в которых они экспрессируются?
Детерминация и дифференцировка B клеточного клона нуждается в paired-box транскрипционном факторе PAX5 (REF. 70). Условное устранение Pax5 в детерминированных развивающихся pro-B клетках превращает их в недетерминированные клетки предшественники с потенциалом дифференцироваться в макрофаги или T клетки71. Интересно, что у животных, которые истощены в отношении незрелых B клеток, условное устранение Pax5 специфически в зрелых B клетках приводит к потере характеристик зрелых B клеток. Эти дедифференцированные Pax5-истощенные B клетки сильно напоминают нормальных недетерминированных предшественников и обладают потенциалом генерировать множественные типы гематопоэтических клеток62. Впечатляющим результатом этих экспериментов стала демонстрация, что изолированные и очищенные зрелые Pax5-дефицитные B клетки способны восстанавливать лимфопоэз у T-cell-дефицитных Rag2-/- мышей. Более того, эти клетки были также способны, несмотря на низкую частоту, дифференцироваться в более удаленный миэлоидный клон и дифференцироваться в макрофаги. PAX5 обычно способствует дифференцировке B клеток в результате непосредственного связывания и активации многочисленных B клеточных эффекторных генов72. Точные регуляторные мишени, которые ответственны за репрограммирование зрелых B клеток у Pax5-дефицитных мышей, остаются неизвестными, но некоторые гены, которые или непосредственно или косвенно репрессированы с помощью PAX5 в pro-B клетках были идентифицированы, как кодирующие белки, такие как рецепторы клеточной поверхности, которые безразличны для дифференцировки B клеток72. Т.о., эти впечатляющие наблюдения четко демонстрируют, что Pax5 критическим не только для обеспечения развития B клеток, но и также для поддержания качественных особенностей дифференцированных B клеток62.
Др. пример это удаление prospero-related homeobox 1 (Prox1), который кодирует транскрипционный фактор, важный для детерминации судеб лимфатических эндотелиальных клеток73. Если активность этого гена внезапно удалена с помощью активации тамоксифеном Cre-ERT2 или в незрелых или взрослых лимфатических сосудах, то происходит быстрый переход, ведущий к активации маркеров кровеносных эндотелиальных клеток и к супрессии маркеров лимфатических эндотелиальных клеток. Др. гистологические свойства также указывают, что существенное репрограммирование происходи как результат устранения Prox1. В противовес результатам устранения Pax5 в дифференцированных В клетках, потеря Prox1 ведет к непосредственному превращению в кровеносные эндотелиальные клетки без прохождения состояния незрелых предшественников64.
Ещё одно переключение фенотипа, которое фундаментально меняет половые характеристики, описано после устранения гена транскрипционного фактора forkhead box L2 (Foxl2) во взрослых овариях мышей. Foxl2 способствует дифференцировке гонад самок в нормальном развитии74,75. Удивительно, устранение Foxl2 у взрослых ведет к быстрому репрограммированию клонов клеток granulosa и theca в клетки Sertoli и тестостерон-продуцирующие клетки Leydig65. Лишь спустя 3 недели после устранения обнаруживаются крупные гистологические изменения, которые затрагивают почти всю гонаду. Уровни тестостерона в сыворотке таких мышей сравнимы с таковыми у нормальных самцов мыши и наблюдаются значительные вторичные изменения на реверсию пола в тканях мишенях, реагирующих на повышенные уровни тестостерона. Анализ геномного транскриптома выявляет крупные изменения в программе экспрессии генов, одно из них связано со значительным сходством с гонадами самцов, чем самок после удаления Foxl2. Важно, что быстрый и почти полный переход строго указывает на то, что устранение Foxl2 вызывает трансдифференцировку скорее, чем дедифференцировку, что сопровождается нормальным развитием типов клеток, подобных гонадам самцов. FOXL2 непосредственно репрессирует экспрессию транскрипционного фактора, кодируемого геном SRY-box containing gene 9 (Sox9), который является первичной мишенью детерминирующего пол самцов SRY транскрипционного фактора.
Т.о., FOXL2 ответственен за непрерывное поддержание характеристик гонад у самок мышей как во время развития, так и у взрослых65. Интересно, что соотв. ситуация доказана и у самцов. Соответственно удаление у взрослых самцов doublesex and mab-3 related transcription factor 1 (Dmrt1), который экспрессируется в гонадах самцов, ведет к активации Foxl2 и трансдифференцировке клеток Sertoli в клетки, похожие на гранулёзные, приводя к частичной феминизации. DMRT1 непосредственно репрессирует экспрессию Foxl2, демонстрируя, что эти два фактора являются центральными компонентами в лабильном балансе контроля поддержания гонад самцов и самок в ходе взрослой жизни69. Соотв. роль DMRT1 недавно описана у рыб medaka, у которых сначала образуются гонады самцов, но затем трансдифференцируются в гонады самок у Dmrt1-мутантных рыбок76.
Клональное переключение ассоциировано с внутренне присущей пластичностью дифференцированной судьбы клеток. Указывают ли эти и др. редкие примеры клонального переключения клеток у взрослых млекопитающих на существование механизмов, которые защищают от приобретения альтернативных клеточных судеб в большинстве или даже во всех дифференцированных типах клеток? Хотя это остается возможным, но трудно исключить, что, по-видимому, подобные примеры драматического превращения клонов отражают физиологическую потребность в высокой степени клеточной пластичности определенных типов клеток. В самом деле, полностью дифференцированные B клетки в норме пластичны, это доказывается, когда учитывается то, что стимуляция антигеном В клеточных рецепторов запускает переключение фенотипа с Pax5-экспрессирующих B клеток на секретирующие антитела плазматические клетки, которые не экспрессируют Pax5 (REF. 77). В этом контекста интересно отметить, что гены, репрессируемые с помощью PAX5, не обнаруживают обогащения Polycomb group (PcG)-mediated гистоном H3, триметилированного по лизину 27 (H3K27me3), метке, которая обычно ассоциирует с репрессированным хроматином, это вообще-то отражает потребность в быстрой активации супрессируемых генов вследствие снижения экспрессии Pax572. Такая гибкость дифференцированного состояния может также объяснить способность, с помощью которой зрелые B клетки могут быть репрограммированы в макрофаги после неправильной экспрессии CCAAT/enhancer binding protein-α (C/EBPα) и C/EBPβ, которые супрессируют активность Pax578. Др. клеточные типы клона лимфоцитов также могут быть необычно пластичными, как это подтверждается наблюдением, что зрелые регуляторные T клетки превращаются в helper T клетки после устранения гена транскрипционного фактор forkhead box P3 (Foxp3)67,68 и что после устранения гена транскрипционного фактора Bcl11bнекоторые типы зрелых Т клеток превращаются в клетки, подобные естественным киллерам66.
Происходящие из энтодермы панкреатические и печеночные клетки являются дополнительными примерами довольно лабильного дифференцированного состояния с наследуемой способностью изменять фенотип. Интересно, что острое устранение панкреатических β-клеток у взрослых мышей запускает превращение глюкагон-продуцирующих α-клеток в инсулин-продуцирующие β-клетки79. Снова, хотя молекулярные события остаются неясными, этот пример указывает на существование впечатляющей пластичности, которая была адаптирована под физиологический механизм клеточного замещения.
Наконец, потребность регулировать дифференцированное состояние типов клеток гонад самок и самцов может быть связана с эволюционно законсервированной потребностью постнатального превращения пола, которая широко распространена у низших позвоночных. В самом деле, взаимные антагонистические взаимоотношения между Sox9 и Foxl2 доказаны для низших позвоночных и, следовательно, эволюционно законсервированный механизм детерминации пола.

Control of stable differentiated states


Как упоминалось ранее, широко распространенным наблюдением является то, что транскрипционные факторы, которые существенны для спецификации и дифференцировки ранних типов клеток, продолжают экспрессироваться в клетках, которые приобрели полностью дифференцированный фенотип. Более того, многие такие онтогенетически важные транскрипционные факторы соединяются непосредственно с большой пропорцией соотв. эффекторных генов, как продемонстрировано в исследованиях по связыванию транскрипционных факторов72,80-82. Является ли такая устойчивая экспрессия и непосредственное связывание со многими эффекторными генами способом продолжения экспрессии этих транскрипционных факторов, и необходима ли она для поддержания клеточных характеристик инструктивно? Возможно отчасти counter-intuitively, некоторые исследования условных нокаутов у мышей продемонстрировали относительно умеренные фенотипы, когда гены ключевых транскрипционных факторов, которые участвуют в ранней дифференцировке, устранены во взрослых тканях. Напр., PC12 ETS domain-containing transcription factor 1 (PET1; также известный как FEV) и LIM homeobox transcription factor 1β (LMX1β) являются транскрипционными факторами, которые играют ключевые роли в развитии serotonergic (5-HT) нейронов в ЦНС. Оба фактора поддерживаются во взрослых постмитотических 5-HT нейронах83-85. В то время как ранние нокауты этих факторов приводят к тяжелой потере всех или почти всех (для Pet1) дифференцированных 5-HT нейронов86,87, устранение Lmx1b или Pet1 в головном мозге с взрослых мышей ведет только к поведенческим аномалиям и подавлению некоторых маркеров 5-HT нейронов83,88. Однако клетки сохраняются и крупные гистологические признаки выглядят нормальными. Более того, некоторые гены, которые зависят от Pet1 или Lmx1b в раннем развитии остаются активными после устранения этих генов у взрослых мышей.
Имеются ещё примеры всё более и боле умеренных фенотипов, когда гены подвергаются нокауту поздно во время дифференцировки у мышей. Сюда входит Nurr1 (также известен как Nr4a2), который кодирует ключевой транскрипционный фактор, который необходим для дифференцировки dopaminergic нейронов58. У Nurr1-нулевых мышей полный блок дифференцировки dopamine нейронов приводит к полному отсутствию этих нейронов у новорожденных мышей, тогда как устранение у взрослых приводит к подавлению некоторых маркеров dopamine нейронов, но клетки сохраняются и выглядят морфологически нормальными58. Кроме того, Foxa1 и Foxa2 обладают уникальными и перекрывающимися функциями в морфогенезе тканей, происходящих из энтодермы, включая поджелудочную железу89,90 (rev. REF. 91). Комбинированный условный нокаут Foxa1 и Foxa2 у взрослых приводит к аномальной функции β-островковых клеток и к неправильной регуляции генов дифференцировки, но клетки поддерживаются и сохраняется крупная тканевая морфология92.
Стабильные нижестоящие сети могут лежать в основе надежности дифференцированных клеточных характеристик. Возможны несколько объяснений, почему позднее устранение ключевых онтогенетических транскрипционных факторов является менее разрушительным. Напр., родственные транскрипционные факторы, которые совместно экспрессируются с данным транскрипционным фактором могут быть перекрывающимися в поздний, но не в ранний момент развития. Более того, некоторые из этих транскрипционных факторов могут выполнять ранние роли: напр., в бинарных механизмах клеточной спецификации в популяциях пролиферирующих предшественников, как показано на FIG. 1a. Нулевые мутации зародышевой линии, следовательно, нарушают события клеточной спецификации, которые не связаны с функцией по регуляции соотв. эффекторных генов в дифференцированных клетках. Однако относительно легкие фенотипы, которые возникают после устранения в зрелых клетках также могут отражать то, что определенный тип клеток является более стабильным, чем те, что описаны выше, когда транскрипционные факторы, по-видимому, существуют как ключевые узловые точки. Трудно исключить, что такие узловые точки будут в конечном итоге идентичными для всех типов клеток, но более вероятна гипотеза, что умеренные фенотипы, которые возникают после разрушения ключевых онтогенетических транскрипционных факторов, отражают то, как сети транскрипционных факторов стабилизируются со временем за счет перекрывающихся функций с помощью близких или более удаленных транскрипционных факторов. Принципиальное различие между лабильным и стабильным состоянием дифференцировки д. зависеть частично от стабильности соотв. сети транскрипционных факторов, как показано на FIG. 3. Изучение транскрипционных факторов, экспрессирующихся в развивающихся и зрелых гепатоцитах демонстрирует эту точку зрения.
Hepatocyte nuclear factor 4 фосфорилирование (HNF4α) безразлично для печёночной спецификации, но эмбриональный нокаут Hnf4a ведет к нарушению дифференцировки гепатоцитов93,94. Позднее устранение специфичного для гетпатоцитов Hnf4a вызывает изменение экспрессии генов, но не общую потерю качественных особенностей гепатоцитов95. Сходным образом инактивация др. транскрипционных факторов гепатоцитарного клона, как было установлено, изменяет экспрессию генов, не приводя к потере общих характеристик клеток печени96.
Эти результаты могут быть поняты, если учесть, как формируется сложная сеть транскрипционных факторов гепатоцитов со временем. HNF4α, как было установлено, соединяется с промоторами более 40% всех экспрессирующихся в печени генов, которые обычно корегулируются с помощью др. специфичных для печени транскрипционных факторов82. Во время ранней дифференцировки устанавливаются, по-видимому, простые каскады положительной обратной связи ко-экспрессирующихся транскрипционных факторов, которые всё более становятся взаимосвязаны в сложную сеть транскрипционных факторов (FIG. 1a). Интересно, что хотя устранение специфического для гепатоцитов взрослых Hnf4a лишь слегка нарушает экспрессию др. экспрессируемых печенью генов транскрипционных факторов, нокаут зародышевой линии более разрушителен из-за менее сложной сети транскрипционных факторов в развивающихся гепатоцитах97,98. Эта тенденция тесно коррелирует с всеобщей тяжелой потерей печеночных генов транскрипционных факторов, когда Hnf4a устраняется рано, но не поздно во время дифференцировки гепатоцитов.



Figure 3 | Models for how transcription factor networks might control the stability of the differentiated state. a | In cells endowed with intrinsic high plasticity - for example, stem and progenitor cells or mature B cells - the transcriptional networks that govern distinct phenotypes are characterized by labile transcription factor networks and active cross-inhibition sets the stage for binary switching between cell types 1 and 2, respectively. This can occur even in a mature cell if transcription factor A is ablated. Forkhead box L2 (FOXL2) and other 'guardians' of the differentiated state seem to represent such key transcription factors. b | It seems likely that stably differentiated cell types are controlled by more elaborate transcription factor networks, illustrated by more cross-regulatory interactions (arrows) and autoregulation. As a consequence, even if factors A and E are involved in a cross-inhibitory regulation of each other, the stability of each respective network will prevent a switching between cell types 1 and 2 (symbolized by the vertical dotted line) even in the event of transcription factor ablation. c | Other transcription factor regulatory networks may not be accessible in more stable differentiated cells owing to, for example, absence of direct cross-regulation or more permanent silencing of alternative networks. Thus, in such situations, genetic ablation of a transcription factor may be sufficient to disrupt an existing network but may not necessarily lead to activation of other lineage-specific factors expressed in other cell types.

Разумно предположить, что сходное становление во все более и более сложную и стабильную сеть транскрипционных факторов в созревающих клетках широко распространено. Напр., экспрессия PET1, потерянная в ранних, но не поздних Lmx1b условно нокаутных клетках, подтверждает, что она становится 'защищенной' за счет перекрывающихся взаимодействий по ходу развития83,86,87. Предполагается, что стабильность таких сетей также связана со стабильностью фенотипа, так что долго живущие клетки, такие как нейроны, зависит от более сложных и перекрывающихся перекрестно-регуляторных взаимодействий.
DNA and chromatin modifications may add stability to differentiated identities. Эксперименты, описанные выше, включая мощное репрограммирование, наблюдаемое у гетерокарионов, четко согласуются с мнением, что большинство активных генов нуждается в присутствии инструктивных связанных с ДНК транскрипционных факторов, которые д. постоянно экспрессироваться в дифференцированных клетках. Однако дифференцированные состояния могут быть в принципе стабильными, поскольку др. регуляторные сети недоступны, как показано на FIG. 3c, или, напр., они могут быть стабилизированы путем становления модификаций ДНК или гистонов, которые не нуждаются в постоянных инструктивных факторах для поддержания. Регуляция качественных особенностей сегментов тела личинок D. melanogaster тому пример. Характеристики сегмента зависят от собственно экспрессии homeobox (Hox) и engrailed генов. Их первоначальная экспрессия диктуется с помощью нескольких рано экспрессируемых транскрипционных факторов; собственно паттерн экспрессии Hox генов поддерживается даже тогда, когда развитие осуществляется после того, как рано экспрессируемые транскрипционные факторы более не присутствуют. Поддержание, но не становление экспрессии соответствующих Hox и engrailed генов зависит от белков Trithorax group (TrxG) и PcG, которые вносят, интерпретируют и умножают активирующие и репрессирующие метки метилирования гистонов99,100 (rev. REFS 101-103). Недавние исследования подтвердили, что некодирующие РНК также участвуют в поддержании экспрессии генов Hox. Напр., в фибробластах кожи взрослого человека некодирующая РНК HOTAIR, как было установлено, регулирует кластер HOXD путем рекрутирования репрессивных PcG белков104,105. PcG белки также необходимы для собственно замалчивания сотен генов, участвующих в детерминации клеточных судеб106-111. Как модификации клеточной ДНК и гистонов могут влиять на постоянную потребность в инструктивных транскрипционных факторах и на поддержание экспрессии генов принципиально проиллюстрировано на FIG. 4.
Прогрессивное замалчивание генов альтернативных клеточных судеб диктуется инструктивными транскрипционными факторами и ассоциирует с репрессивными гистоновыми модификациями замалчиваемых генов111-113. Повышенное отложение репрессивных гистоновых модификаций может способствовать метилированию ДНК114-117 и сжиманию хроматина с помощью ремодельеров хроматина118,119. Такие условия, репрессирующие хроматин, могут т.о., служить в качестве стабильной конечной точки, которая может замалчивать аберрантную транскрипцию без необходимости в постоянном присутствии транскрипционных факторов, которые инициировали репрессию, как показано на FIG. 4c. Доказательством такой персистирующей 'памяти' предыдущих инструктивных событий могут служить эксперименты по репрограммированию с помощью SCNT120 (rev. REF. 9) или по получению iPSCs121. Хотя клетки полностью удовлетворяют критериям плюрипотентности122, память о



Figure 4 | Dependency of instructive factors in the regulation of the chromatin state is distinct for active versus repressed genes. a | An activating transcription factor (A) is important for the induction of expression of a gene. Gene activation is associated with several modifications in chromatin structure (shown by the blue circles). As exemplified by numerous studies in this Review, the same or other instructive transcription factors are continuously required for the maintained expression of active effector genes also in mature cells. b | Induced repression of expression of a gene is illustrated. The binding of a transcriptional repressor (R) is associated with repressive chromatin modifications (red circles). In one scenario, continued repression depends on continuous binding of a transcriptional repressor to maintain the repression. c | Alternatively, the initial repressive chromatin modifications (red circles; for example, histone modifications) are followed by additional repressive chromatin or DNA modifications (yellow boxes; for example, 5-methyl cytosine methylation of promoter DNA) or chromatin compaction, thus leading to a more permanently silenced state that may not require continuous presence of instructive transcriptional repressors. Presumably, several layers of suppressive chromatin modifications stabilize the differentiated state and provide a barrier against transdifferentiation or reprogramming into the pluripotent state. In some reprogrammed cells, such suppressed chromatin is retained as a 'memory' of their cellular origin.

состоянии соматической клетки сохраняется, по крайней мере, в некоторых iPSC линиях. Как следствие, iPSCs, которые генерируются из панкреатических β-островковых клеток и из разных гематопоэтических типов клеток, которые более тесно связаны с источником клеточных типов121,123,124. Кроме того, многие линии iPSC сохраняют паттерны метилирования ДНК и модификаций гистонов, напоминающих таковые из их клеток источников123-125, и такие модификации появляются также сделать дифференцированные клетки более устойчивыми к репрограммированию126 (rev. REF. 9). Хорошо известные феномены, такие как инактивация и импринтинг Х-хромосомы, представляют дополнительные примеры репрессированных состояний, которые, по-видимому, персиститруют пассивно в хроматине и 'запоминают' даже клеточный контекст, в котором др. аллель активен (rev. REFS 127,128).
DNA and histone marks are often referred to as epigenetic modifications. Однако термин 'эпигенетический' понимается неправильно в этом контексте. Т.к. трудно доказать, что модификации хроматина устанавливаются во время развития и пассивно сохраняются, инструктивные связывающие ДНК регуляторы пока ещё не найденные, как взаимодействующие с данной регуляторной областью, могут быть фактически ответственными за это. Важно также отметить, что клеточная память, возникающая в результате инициальных инструктивных событий, не обязательно использует модификации ДНК и гистонов, которые пассивно сохраняются. Такая регуляция может быть объяснена регуляцией с помощью простой прямой обратной связи, при этом инициирующий транскрипционный фактор ведет к экспрессии др. фактора, который затем поддерживается с помощью ауторегуляции.

Maintenance of phenotype in disease


Интересен вопрос, как транскрипционный контроль поддержания клеток связан с болезнями. Некоторые исследования выявили корреляцию между степенью злокачественности опухоли и экспрессией транскрипционных факторов, которые ассоциированы с плюрипотентностью и усиленным самообновлением эмбриональных стволовых клеток10,11. Т.о., разумно предположить, что факторы, защищающие от повторного вступления в недифференцированное, пролиферативное состояние, д. обладать способностью супрессии опухолей. В самом деле, одним из последствий делеции Pax5 в зрелых B клеток мышей является развитие агрессивных лимфом62, и PAX5, по-видимому, является опухолевым супрессором острой лимфобластной лейкемии у человека, на что указывают мутации моноаллельной потери функции в большой пропорции таких раковых опухолей129. Потеря факторов, которые необходимы для поддержания зрелого и не пролиферативного состояния в уже дифференцированных клетках д. играть сходные роли в защите против др. типов раковых опухолей.
Как обсуждалось выше, Foxp3 является критическим для поддержания фенотипа регуляторных Т клеток и поэтому он защищает от избыточной иммунореактивности. Мыши с условным нокаутом по Foxp367 или даже лишь с ослабленной экспрессией Foxp3 (REF. 68) обнаруживают тяжелую аутоиммунную патологию, а нарушение регуляции Foxp3 ассоциирует с различными аутоиммунными заболеваниями у человека130,131. Транскрипционные факторы, обозначенные выше, как защитники дифференцированного состояния, ассоциируют с болезнями, что кажется очевидным. Однако это также похоже на то, что транскрипционный контроль более стабильных клеточных состояний д. быть также целью процессов, способствующих болезни. Напр., потребность в поддержании нейронов интактными в течение многих декад указывает на то, что клеточные дисфункции, приводящие к трудностям поддержания фенотипов нейронов могут быть ассоциированы с нейродегенеративными болезными. В самом деле, ранние симптомы при некоторых нейродегенеративных нарушениях, скорее всего, вызываются потерей функции нейронов скорее, чем клеточной гибелью132. В подтверждение этого мнения, нарушение регуляции и полиморфизмы затрагиваемых генов, которые кодируют транскрипционные факторы dopaminergic нейронов, такие как NURR1, PITX3 и LMX1B, оказались ассоциированными с болезнью Паркинсона и шизофренией, подтверждая, что нарушение инструктирующих механизмов, которые поддерживают допаминергические фенотипы, могут усиливать чувствительность к болезни133,134. Кроме того, др. признак указывает, что нейродегенеративные заболевания могут быть ассоциированы с затруднениями в обеспечении дифференцированного состояния это наблюдения повторного вступления в клеточный цикл нейрональных клеток, в частности при болезни Алцгеймера. При этих патологических условиях нейроны способны синтезировать ДНК (т.е. , проходить через S фазу), но не вступают в митоз. Как это влияет на прогрессирование болезни, непонятно, но вполне возможно, что это вносит вклад в дегенеративный процесс 135.

Conclusions and future directions


As emphasized by studies described in this Review, in some cells requiring a high degree of plasticity, there is a dependency on finely balanced binary switching mechanisms that are similar to those that are fundamental in cell fate specification during development. By contrast, in more stably differentiated cells, we hypothesize that labile binary relationships have either been eliminated or stabilized by redundant cross-regulation involving a sufficient number of additional transcription factors and/or regulatory RNAs; these networks are stable so that even in the event of ablation of single key factors, the overall differentiated state is not easily perturbed. In addition, repressive histone modifications and DNA methylation also contribute to the stability of the differentiated cell identity.
Our understanding of how transcription factors and chromatin-modifying processes are integrated in regulating the differentiated state in mammals remains limited, and it will be important in future studies to elucidate how regulatory network architectures can accommodate stringent requirements that balance stability versus flexibility. Such studies are now feasible through mouse models for conditional gene ablation in differentiated cells and chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP–seq) techniques for the genome-wide mapping of transcription factor binding sites and DNA and histone modifications. Moreover, focusing on how other gene regulatory mechanisms contribute to the stability of the differentiated state will be important. For example, it seems to be likely that differentiated cells, which are generally postmitotic, depend on a strict control to prevent cell cycle re-entry. It will be interesting to understand to what extent cell cycle control mechanisms are interlinked with the control of the differentiated state. For example, in the D. melanogaster eye, the expression of the retinoblastoma tumour suppressor protein (RB) homologue rbf, in combination with components of the Hippo tumour suppressor pathway, is necessary to maintain the differentiated identity of retinal photoreceptor cells136, but it does not seem to be required for preventing cell cycle re-entry. By contrast, in differentiated horizontal interneurons of the mouse retina, members of the RB family are required to prevent re-entry into the cell cycle, but intriguingly both structural and functional features of differentiated horizontal interneurons are retained when RB family functions are lost137. Thus, these studies that focus on known tumour suppressor pathways seem to indicate that the control of cell cycle exit and differentiation are not always inextricably linked. In addition to the cell-intrinsic mechanisms for maintenance discussed in this Review, it is also important to point out that extrinsic signalling can provide instructive cues that are necessary for identity maintenance. For example, the maintenance of specific neuron identities depends on the continuous secretion of bone morphogenic protein from surrounding tissue138,139. Little is understood about such regulation in other cell types, but it is an important area for further investigation.
The intense recent interest in reprogramming emphasizes the importance of understanding how cells normally secure their identities in stably differentiated cells, because studies focusing both on how differentiated states are maintained and on how they can be directly reprogrammed seem to constitute two sides of the same coin. With increasing understanding of how the differentiated state is stably maintained, it may eventually become possible to interfere with these processes in ways that may facilitate the generation of iPSCs and other deliberate cell lineage conversions that may be clinically relevant. Moreover, and as discussed above, it is also anticipated that mechanisms controlling the differentiated state will be relevant in future attempts to treat cancer and cell degenerative diseases.
Сайт создан в системе uCoz