Как и др. органы молочные железы формируются во время эмбрионального и плодного развития, но уникальность заключается в высокой динамичности ткани, при этом основные онтогенетические процессы происходят во время периода половой зрелости и беременности. Кроме того, начиная с половой зрелости, системные стероидные гормоны вызывают изменения в эпителии, а также в соседней строме в ходе каждого эстрального цикла и до менопаузы, когда изменяются уровни гормонов и железы спадаются. Молочные железы склонны к развитию эпителиальных раков, факторы риска включают ранние менструации и поздняя первая беременность, это указывает на то, что онтогенетические изменения, ассоциированные с менструальными циклами и беременностью, являются критическими параметрами чувствительности к раку. Развитие нормальной, а также раковой ткани базируется на пролиферации соматических стволовых клеток, предшественников и дифференцированных потомков. В последние годы предприняты многочисленные попытки по описанию клеточной иерархии в молочных железах. В этих попытках молочные железы мышей служили широко используемой моделью, а полученные на мышах результаты часто экстраполируются на ткани человека. Имеются, однако, и некоторые выраженные расхождения в развитии молочных желез у мышей и женщин, которые могут мешать дальнейшему прогрессу в этой области.

Mammary gland development

Молочные железы развиваются во время трех разных фаз; эмбриональной, пубертальной и беременности/лактации с наиболее резкими изменениями, происходящими постнатально. У эмбрионов человека и мыши развитие молочных желез очень сходное, хотя развитие молочных желез человека в чем-то более сложное было подразделено на 10 стадий в соответствии с длиной эмбриона/плода (Russo and Russo, 2004). У обоих видов, однако, развитие желез из плакод молочных желез происходит путем инвазии эпителиального зачатка молочных желез в подлежащую мезенхиму. Паренхима затем разрастается и ведет к формированию рудиментарной эпителиальной структуры, внедренной в мезенхиму, которая у мышей состоит из жировой ткани, жировое тело молочных желез. Ряд разных сигнальных путей был идентифицирован как ответственный за этот процесс (reviewed by (Watson and Khaled, 2008)). такое развитие ведет к становлению пяти пар молочных желез у мышей, расположенных непосредственно ниже кожи между передними и задними ногами, и одной пары молочных желез у человека.

В зачатке молочных желез у человека большинство эпителиальных клеток окрашивается как просветным, так и базальным маркерами, т. e. cytokeratin (CK) 19 и CK14. Такие дважды позитивные клетки не обнаруживаются во время развития молочных желез у мышей, у которых на ст. E15.5 и в менее развитых молочных железах экспрессируется только CK14 (Sun et al., 2010). Тяжи эпителия молочных желез человека оказываются полностью канализованными перед рождением, а у новорожденных просветный и базальный эпителиальные клоны оказываются четко разделенными и легко идентифицируются как или CK19⁺ клетки или CK14⁺ клетки (recently reviewed by (Petersen and Polyak, 2010)). Дальнейшее развитие происходит во время половго созревания. У мышей половая зрелость начинается на 3-ей неделе и характеризуется увеличением эстрогена, продуцируемого яичниками. У мышей terminal end buds (TEBs) располагаются на кончиках рудиментарных протоков и состоят из наружного слоя покровных (cap) клеток и множественных слоев из клеток внутреннего тела. Покровные (cap) клетки высоко пролиферативные и в конечном счете дают миоэпителиальные клетки протоков, тогда как клетки тела являются предшественниками эпителия просвета. TEBs начинают проникать в жировую подушку приводя к обширной элонгации протоков, а также ко вторичному ветвлению с помощью процесса. наз. бифуркацией (reviewed by (Silberstein, 2001)). Морфогенез ветвления является сложным процессом, регулируемым многими факторами, происходящими как из эпителия, так и стромы. Одним из наиболее важных компонентов является экспрессия estrogen receptor alpha (ERα) в эпителии, поскольку нокаут вызывает исчезновение TEBs, так что протоки не могут проникнуть в жировую подушку (Mallepell et al., 2006). Когда мыши достигают приблизительно возраста в 10-12 недель, то древо протоков достигает конца жировой подушки и TEBs регрессируют. Теперь эпителий состоит из двух основных типов клеток; внутреннего слоя из просветных эпителиальных клеток, которые продуцируют молоко во время лактации, и наружного слоя миоэпителиальных клеток, располагающихся на базальной мембране, они ответственны за проталкивание молока через сеть протоков в сосок. По достижении половой зрелости древо протоков заполняет только малую часть жировой подушки, оставляя крупные пространства между протоками и ductules, делая возможным лобулоальвеолярное развитие во время беременности (reviewed by (Silberstein, 2001)). Рост протоков является исключительно внутренним свойством эпителия молочных желез, поскольку ранние исследования показали, что трансплантации любого фрагмента протока в очищенную от эпителия жировую подушку ведет к формированию целого нового древа протоков, достигающего границ жировой подушки (Daniel et al., 1968). Это также указывает на то, что определенного типа ингибирующий сигнал предупреждает рост древа протоков за пределы жировой подушки, а также от заполнения пространства между протоками. В этом отношении transforming growth factor-β, TGFβs, как полагают, являются важными регуляторами роста протоков (reviewed by (Silberstein, 2001)). Развитие молочных желез у человека осуществляется в течение нескольких лет (Russo and Russo, 2004). Как и у мышей, половая зрелость у девочек характеризуется экстенсивным ростом и дальнейшим развитием молочных желез под контролем гормонов в крови, чтобы создать разветвленную систему протоков и ассоциированных долек/terminal ductal lobular units (TDLUs), которые являются функциональными единицами молочных желез. Половая зрелость, по-видимому, представляет собой самую крупную экспансию компартмента стволовых клеток в жизни женщин. Формирование долек в молочных железах женщин во время полового созревания не согласуется с развитием молочных желез у мышей, у которых дольки впервые появляются только, когда наступает беременность (reviewed by (Silberstein, 2001)). Во время беременности в молочных железах мышей полное развитие желез достигается за счет образования веточек третьего порядка, которые заканчиваются альвеолярными зачатками, где запускается продукция молока на поздней ст. беременности и во время лактации (reviewed by (Silberstein, 2001)). Этот процесс развития находятся под контролем гормона прогестерона, который ответственен за стимуляцию формирования дальнейших боковых веточек и альвеол. Кроме того, вместе с пролактином прогестерон индуцирует дифференцировку альвеол как единиц, секретирующих молоко. При нокауте рецептора прогестерона (PR) альвеологенез и дифференцировка прекращаются (Brisken et al., 1998). Сходным образом транскрипционный фактор Gata3 также необходим для достижения железами полного созревания альвеол и лактогенеза (Kouros-Mehr et al., 2006). После отнятия от груди массивная клеточная гибель ведет к постлактационной регрессии желез, процесс, наз. инволюцией, приводит к тому, что железы возвращаются к более или менее состоянию до беременности, хотя сохраняются немногие альвеолы по всей железе (reviewed by (Richert et al., 2000)).

Молочные железы женщин испытывают сходные драматические изменения во время беременности, но что очень важно, дольки уже присутствуют еще до беременности и молочные железы женщин не рассматриваются как полностью развитые и дифференцированные вплоть до завершения беременности (Russo and Russo, 1987). Во время лактации мало клеток пролиферируют, а в отсутствие кормления грудью или после отнятия от груди железы подвергаются инволюции, напоминая морфологически железы до беременности. С каждой беременностью эти изменения повторяются и эта регенеративная способность базируется на присутствии стволовых клеток. Железы, однако, не возвращаются полностью к исходному состоянию, т.к. железы рожавших женщин с каждым разом содержат все более крупные дольки. Как результат органы рожавших самок содержат больше железистой ткани, чем железы никогда не рожавших ((Russo and Russo, 2004) and references herein). Стволовые клетки нормальных молочных желез являются особенно пролиферативными и активными во время фаз эмбрионального/плодного развития, половой зрелости и беременности, но, по-видимому, участвуют также в более ограниченной экспансии во время каждого менструального цикла.

Mouse mammary stem cells

Доказательства существования стволовых клеток в молочных железах мышей накапливались последнюю декаду и теперь общепринято, что существует разнообразие разных субпопуляций клеток, от недифференцированных стволовых клеток до окончательно дифференцированных просветных эпителиальных и миоэпителиальных клеток. Пионерская работа Daniel and DeOme 50 лет тому назад показала, что если фрагменты эпителиальной ткани трансплантировать в свободные от эпителия жировые подушки млекопитающих (cleared fat pads), то они дают функционально древо протоков, напоминающее и ведущее себя подобно обычному древу молочных желез за исключением того, что нет соединения с соском. Любой тканевой фрагмент д. осуществлять это независимо от временного и пространственного происхождения, указывая, что популяция кандидат стволовых клеток расположена вдоль всего древа протоков (Daniel et al., 1971; DeOme et al., 1959), но это было также интерпретировано, что вся жировая подушка скорее, чем специфические топографические области служат в качестве ниш стволовых клеток. Более того, трансплантированные выросты могут быть серийно трансплантированы в новые очищенные жировые подушки до 5-8 раз прежде, чем они постареют, независимо от возраста донора или репродуктивной истории (Daniel et al., 1968; Daniel et al., 1971). Эти данные привели к предположению, что стволовые клетки молочных желез это относительно покоящиеся клетки, которые активируются только во время развития молочных желез, т.к. массивный рост, наблюдаемый во время беременности, по-видимому, поддерживается за счет предшественников протоков и альвеол (reviewed by (Smith and Medina, 2008)), которые могут обладать способностями, сходными со стволовыми клетками, т.е. самоудвоением и продолжительным существованием (Van Keymeulen et al., 2011). Когда того же самого типа эксперимент проводили с пренеопластическими и неопластическими клетками, то выросты могли быть серийно трансплантированы с неизбежностью (Daniel et al., 1975). Причины этих различий всё ещё неизвестны (reviewed by (Smith and Medina, 2008)). Метод очищенных жировых подушек теперь стал золотым стандартом для исследований свойств повторного заселения интересующих клеток. Факт, что возможно трансплантировать клетки молочных желез мышей в их нормальную микросреду и оценить их подобие стволовым клеткам или туморогенные свойства подчеркивает уникальность этого органа.

In situ observations of the mouse mammary stem cell

Электронный и световой микроскопический анализ показал, что эпителий молочных желез состоит из гетерогенной популяции клеток с разными клеточной структурой, локализацией и способностью к обновлению, это может отражать разные стадии дифференцировки эпителия (Chepko and Smith, 1997; Smith and Medina, 1988). 4 типа эпителиальных клеток могут быть определены ультраструктурно; примитивные small light cells (SLC), undifferentiated large light cells (ULLC), differentiated large light cells (DLLC) и large dark cells (LDC). LDC соответствуют дифференцированным просветным и миоэпителиальным клеткам, тогда как SLC были описаны, как обладающие свойствами, сходными со стволовыми клетками, исходя из присутствия митотических хромосом, отсутствия каких-либо органелл и способности подвергаться симметричным и асимметричным делениям (reviewed in (Smith and Chepko, 2001)). Кроме того, SLCs обнаруживают базальное расположение, иногда достигая базальной мембраны, но никогда просвета (Chepko and Smith, 1997). Процент SLCs постоянно 3% от желез девственниц, при беременности и инволюции, это указывает на то, что относительное количество SLCs увеличивается и уменьшается пропорционально более дифференцированным клеткам. Интересно, что SLCs исчезают в серийных трансплантатах, которые достигли старческого роста, это указывает на то, что эти клетки необходимы для поддержания наблюдаемых свойств репопуляции эпителиальных клеток молочных желез (reviewed by (Smith et al., 2002)). базируясь на морфологических и временных характеристиках SLCs, эти клетки, скорее всего, являются мышиными стволовыми клетками молочных желез. Более того, ультраструктурное описание показало, что стволовые клетки молочных желез находятся в специализированных микроусловиях, нишах стволовых клеток, которые играют жизненно важную роль в детерминации судьбы. К сожалению невозможно скоррелировать фенотипические свойства SLCs с популяцией кандидатом стволовых клеток, выделенной из свежей ткани, это означает, что окончательная проверка их свойств стволовости не может быть осуществлена методом трансплантации для заселения вновь. Тем не менее, тот факт, что SLCs имеют супрабазальное положение (Chepko and Smith, 1997) очень хорошо согласуется с проспективным выделением мышиных стволовых клеток молочных желез из базального слоя.

Functional characterization of mouse mammary stem cells

Характеристика мышиных стволовых клеток молочных желез в культуре клеток не была столь же пространной как их человеческих аналогов из-за очевидных преимуществ метода репопуляции in vivo. Также, культивируемые, рассортированные мышиные эпителиальные клетки молочных желез были очень пластичными в отношении экспрессии маркеров (Alvi et al., 2003; Smalley et al., 1998), это делает их менее идеальной экспериментальной моделью для изучения стволовыхв клеток молочных желез мышей по сравнению с методом повторного заселения. Однако сила культуральных экспериментов заключается в том, что они - в идеале - являются контролируемой системой, в которой каждый воздействующий фактор может строго регулироваться, тогда как in vivo структура точной последовательности событий неизвестна.

C момента первых экспериментальных доказательств существования стволовых клеток молочных желез множество усилий было сконцентрировано на идентификации и функциональной характеризации этих клеток. Из трансплантационных экспериментов эпителиальных клеток молочных желез в очищенные жировые подушки стало ясно, что существует иерархия разных стволовых клеток; некоторые ограничены продукцией структур долек, другие продукцией структур протоков и, наконец,стволовые клетки, которые способны давать как структуры, так и генерировать полностью функциональное древо молочных желез (Smith, 1996). Точная природа каждой субпопуляции пока неизвестна. Клетки, ограниченные дольками, неспособны продуцировать cap клетки, так что проникающие TEBs не формируются, поскольку клетки, ограниченные протоками, не дают альвеолярных структур во время беременности (reviewed by (Smith and Medina, 2008)). Обе популяции клеток дают структуры, которые состоят из внутреннего слоя клеток просветного эпителия и наружного слоя миоэпителиальных клеток, демонстрируя, что они происходят из одного плюрипотентного предшественника (Kordon and Smith, 1998). Недавнее исследование с WAP-Cre/Rosa-lacZ трансгенными мышами показало, что ограниченные дольками стволовые клетки становятся функционально активными во время беременности под действием эстрогена и прогестерона и что они располагаются на окончаниях протоков, где они дают альвеолярные структуры (Wagner et al., 2002). Интересно, что последующие трансплантации этих клеток в очищенные жировые подушки вместе с эпителиальными клетками дикого типа, показали, что они были мультипотентными и способными к самообновлению, давали как протоки, так и альвеолы, состоящие из просветных эпителиальных и миоэпителиальных клеток (Boulanger et al., 2005; Matulka et al., 2007). Однако их основной функцией является возможно продукция новых альвеол во время беременности, т.к. они не обнаруживают способности к самообновлению, будучи трансплантированы в очищенные свои собственные жировые подушки (Boulanger et al., 2005). Эти клетки, названные parity-induced mammary epithelial cells (PI-MEC) из-за их мультипотентных свойств, первыми выявляются вследствие беременности. Учитывая тот факт, что эти клетки относительно обильны у рожавших самок мыши, является мало вероятно, что они представляют гомогенную популяцию стволовых клеток. Вместо этого было предположено, что помимо стволовых клеток популяция включает клетки, которые важны для ниш стволовых клеток (Matulka et al., 2007).

Чтобы приблизиться к идентификации мышиных стволовых клеток молочных желез осуществляли долговременное мечение BrdU для выявления label-retaining cells (LRC) (Welm et al., 2002). Сохраняющие метку клетки, как полагают, являются медленно делящимися клетками, которые сохраняют свою исходную меченную матричную нить ДНК и поэтому могут быть идентифицированы в ткани спустя недели после воздействия краски, метящей ДНК, посредством своих флюоресцентных ядер. Эти LRCs являются кандидатами на роль стволовых клеток, как было продемонстрировано в ряде др. тканей, включая волосяные фолликулы, мышцы и кишечник (Blanpain et al., 2004; Morris and Potten, 1999; Potten et al., 1997; Shinin et al., 2006). LRCs в железах мыши обогащены маркером суррогатных стволовых клеток Sca-1 и могут регенерировать эпителиальные выросты, будучи трансплантированными в очищенные жировые подушки молочных желез в противоположность Sca-1^neg клеткам (Welm et al., 2002). Более того, LRCs были способны к вытеканию ДНК-краски Hoechst-33342, и были обозначены как "side population (SP)", и также обнаруживали свойства репопуляции, это позднее блыо подтверждено др. (Alvi et al., 2003). Однако т.к. затем др. оказались неспособны воспроизвести данные о свойствах стволовых клеток SP-клеток молочных желез (Matulka et al., 2007; Stingl et al., 2006), это подчеркивает, что точная природа этих клеток всё ещё остается неясной. Другие однако и далее изучают свойства стволовых клеток у LRCs, и временами неожиданно обнаруживают, что большая часть LRCs, включающая PI-MECs, активно делится асимметрично, так что они удерживают свою матричную меченную нить ДНК после делений (Smith, 2005). Следовательно, присутствие LRCs клеток в молочных железах в течение многих недель после применения ДНК-окраски не обязательно указывает, что клетки не делятся. То, что стволовые клетки молочных желез могут делиться, было подтверждено и другими (Stingl et al., 2006). Извесно, что все эксперименты были осуществлены во время активного роста протоков в ранней жизни, на стадии, когда стволовые клетки, как полагают, делятся. Интересно, что пропорция LRCs, экспрессирующих стероидные рецепторы express, ERα и PR, указывает, что LRCs представляют собой иерархию разных стволовых клеток и клеток предшественников (Booth and Smith, 2006). Во время беременности и сопровождающего её альвеологенеза LRCs продолжают делиться, а экспрессия стероидных рецепторов в этих клетках изменяется (Booth et al., 2008). Небольшая пропорция LRCs, наз "undefined cycling cells", негативна по cytokeratins, , стероидным рецепторам, а также миоэпителиальным маркерам и расположена базально во всем древе протоков (Booth et al., 2008). Остается установить, соответствуют ли эти клетки mammary repopulating unit cells (MRUs), которые обогащены с помощью проточной цитометрии, базирующейся на экспрессии CD24, CD29 (β1-integrin) и CD49f (α6-integrin) (Shackleton et al., 2006; Sleeman et al., 2006; Stingl et al., 2006), которые, как было установлено, лишены экспрессии стероидных рецепторов (Asselin-Labat et al., 2006; Sleeman et al., 2007).

В последнее время техника для восстановления жизнеспособных клеток из только что диссоциированных тканей молочных желез существенно улучшена. Это позволяет исследователям определять экспрессию поверхностных маркеров эпителиальных клеток молочных желез и после этого сортировать интересующие клетки проточного цитометра. Таким способом три отдельные группы исследователей показали, что если разные клеточные субпопуляции были отсортированы на базе экспрессии CD24, CD29 или CD49f, то стволовые клетки молочных желез мышей д. быть сильно обогащены по ним, как показывают оценки с помощью метода репопуляции в очищенные жировые подушки молочных желез, даже при относительно низких количествах трансплантируемых клеток (Shackleton et al., 2006; Sleeman et al., 2006; Stingl et al., 2006). Точнее говоря, три разные клеточные популяции могут быть идентифицированы, если анализировать клетки молочных желез мышей по экспрессии CD24, а именно, CD24^neg клетки (не эпителиальные), CD24^low клетки (миоэпителиальные) и CD24^high клетки (просветный эпителий) (Sleeman et al., 2006). Будучи трансплантированными в очищенные жировые подушки молочных желез CD24^low клетки обнаруживают наивысшую способность к репопуляции, давая разрастания, которые заполняют целиком жировую подушку молочных желез, даже если трансплантировано всего 1,000 клеток. Разрастания состоят как из просветного эпителия, так и миоэпителиальных клеток, которые организованы соотв. образом, это отражает мультипотентность CD24^low клеток. Клетки CD-24^high также обнаруживают регенеративный потенциал, но при более высоких количествах клеток и они не были способны генерировать структуры, заполняющие всю жировую подушку. Структуры, однако, содержали как просветный эпителий, так и миоэпителиальные клетки, указывая тем самым на мультипотентность трансплантированных клеток. Необходимо определить, способны ли трансплантированные разрастания испытывать полную дифференцировку во время беременности и лактации и способны ли они к самообновлению после серии трансплантаций, что является критическим признаком стволовых клеток. Эти аспекты. однако. были исследованы др. (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006), которые получили также mammary-repopulating unit cells (MRUs) с высокой экспрессией CD29 или CD49f и средней экспрессией CD24, соотв.

Частоты MRUs в CD29^hiCD24⁺ и CD24^medCD49f^high популяциях были приблизительно 1/60 (1.67%) по сравнению с 1/1400-4900 для тотальной популяции эпителиальных клеток молочных желез. После трансплантации отсортированные клетки могли генерировать полностью функциональное древо протоков, которое способно подвергаться lobulo-alveologenesis во время беременности и лактации и давать молоко (Shackleton et al., 2006). Авт., стремящиеся генерировать разрастания протоков после трансплантации одиночной MRU клетки, имели низкую долю успеха (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006).

Когда MRU субпопуляции были проанализированы в отношении экспрессии клональных маркеров, то они экспрессировали базальные/миоэпителиальные маркеры, это указывало, что MRUs обычно расположены в базальном слое древа протоков. Ясно, что большинство отсортированных клеток, если оно обогащено MRU клетками, не являются кандидатами на роль стволовых клеток, поскольку они составляют только около 1.67% отсортированных клеток, а остальные представляют собой смесь предшественников и дифференцированных клеток (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006). Напротив, в предыдущих сообщениях (Alvi et al., 2003; Welm et al., 2002), MRU клетки внутри субпопуляций CD29^hiCD24⁺ и CD24^medCD49f^high не обнаруживали ни SP-фенотипа, ни экспрессировали Sca-1. PI-MECs, как впоследствии было установлено, принадлежат CD49f^hi популяции (Matulka et al., 2007). Однако, PI-MECs расположены в основном в просветной эпителиальной нише (Wagner et al., 2002), это противоречит сообщениям, опубликованным по MRUs. Эти находки указывают на то, что PI-MECs и MRUs могут представлять самостоятельные субпопуляции клеток, хотя обе с признаками стволовых клеток. Важность экспрессии CD29 в базальном слое, который включает MRUs, выявляется по отсутствию генерации вторичных разрастаний из фрагментов первичной ткани, лишенных CD29 (Taddei et al., 2008), это подчеркивает, что взаимодействия интактных клеток с внеклеточным матриксом (ECM), обеспечиваемые с помощью CD29, необходимы для поддержания стволовых клеток. Первичные разрастания всё ещё обнаруживают рост протоков и альвеологенез во время беременности, но они задержаны по сравнению с контрольными мышами. Этот задержанный альвеологенез в поздней беременности, как полагают, обеспечивается с помощью популяции активированных предшественников альвеол, которые неспособны давать структуры протоков и которые не затрагиваются отсутствием экспрессии CD29 (Taddei et al., 2008). Эти клетки четко обнаруживают сходство с PI-MECs. Это снова подчеркивает, что эпителий молочных желез состоит из разнообразия разных стволовых клеток и предшественников, каждый со своей самостоятельной ролью, но которые вместе поддерживают функциональными молочные железы. Пока неизвестно, как разные клетки в этой иерархии вносят вклад в нормальный тканевой гомеостаз и беременность.

Просветные эпителиальные клоны обнаруживают низкий регенеративный потенциал (Sleeman et al., 2006; Sleeman et al., 2007) или отсутствие такового (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006), если трансплантируются в очищенные жировые подушки молочных желез небольшим количеством клеток, исследования показали, что они являются гетерогенной группой из разных субпопуляций, включая предшественников, которые играют жизненно важную роль во время нормального гомеостаза и при беременности. Более того, хотя наиболее примитивные стволовые клетки могут обнаруживаться внутри базального компартмента, недавние исследования предоставили доказательства, что просветные предшественники являются источником клеток для рака груди (Lim et al., 2009; Molyneux et al., 2010), как это уже давно предполагалось. Ясно, что компартмент просветного эпителия содержит клетки, которые могут дифференцироваться как в просветные эпителиальные, так и миоэпителиальные клетки, как показывают исследования с мечением (Boulanger et al., 2005; Matulka et al., 2007; Molyneux et al., 2010). Просветные эпителиальные предшественники характеризуются экспрессией CD61 (β3-integrin) (Asselin-Labat et al., 2007) и низким уровнем экспрессии Prominin-1 (CD133) и Sca-1 и отсутствием стероидных рецепторов (Sleeman et al., 2007). Важно, однако, что регенеративный потенциал предшественников просветного эпителия низкий, они всё ещё могут генерировать разрастания, которые состоят как из просветных эпителиальных, так и миоэпителиальных клеток, демонстрируя мультипотентность (Sleeman et al., 2007). Далее было показано, что регенеративный потенциал просветных клеток может быть существенно увеличен, если производится совместная инъекция с восстановленным внеклеточным матриксом, MatrigelR (Vaillant et al., 2011). Однако, вторичных разрастаний не возникает из этих происходящих из просвета первичных разрастаний, когда происходит повторная трансплантация в очищенные жировые подушки. указывая, что клетки не способны к сомо-обновлению (Vaillant et al., 2011).

Identification and functional characterization of stem cells in the human mammary gland

Доказательства, что нормальный эпителий молочных желез человека развивается из общего клеточного источника, в данном случае из стволовых клеток, впервые были получены в исследованиях паттерна инактивации X-хромосомы. Микропрепарирование эпителия нормальных молочных желез взрослых, сопровождаемое анализом паттерна метилирования ДНК, продемонстрировало, что нормальные молочные железы человека организованы в виде дискретных регионов, в которых все клетки имеют одну и ту же инактивированную Х хромосому (Tsai et al., 1996) и поэтому происходят из одного и того же источника клеток. Как было подтверждено выше, задолго до этой находки было продемонстрировано, что имплантация нормальной ткани в мышиные очищенные жировые подушки продуцирует ветвление и тем самым демонстрирует способность регенерировать древо молочных желез (DeOme et al., 1959). Чтобы прямо идентифицировать стволовые клетки молочных желез человека, выявить их онтогенетическую иерархию или определить их регуляцию оказалось нелегкой задачей и всё ещё является предметом интенсивных поисков. Большинство подходов для изучения функции и динамики стволовых клеток молочных желез человека использует первичную ткань. В сравнении с исследованиями на мышах, однако, относительно мало исследований посвящено идентификации стволовых клеток и их иерархии дифференцировки в нормальных молочных железах человека. Это, по-видимому, обусловлено частично ограниченным доступом биопсического материала, который в большинстве случаев получается в пластических операциях по уменьшению молочных желез у взрослых, частично из-за спорадичности собираемого материала он обнаруживает более высокую степень биологической изменчивости, чем материал от инбредных линий мышей, это требует большего числа выборок, чтобы получить достоверные статистически результаты.

Поскольку методы, такие как гистологическое окрашивание нормальной ткани молочных желез, представляют сбор интересующих клеток, то необходимы дополнительные методы тканевого анализа, чтобы выявить динамику онтогенеза. Одним из таких подходов является инкубирование кусочков ткани молочных желез в иммуно-некомпетентных мышах. С помощью подкожных имплантаций и радиомечения ДНК небольших кусочков нормальной ткани груди в бестимусных nude мышах, на которых воздействовали 17b-estradiol, популяция содержащих метку (долго живущих) клеток может быть идентифицирована и проанализирована (Clarke et al., 2005). Эта популяция включает клетки, экспрессирующие ER и предполагаемые маркеры стволовых клеток CK19, p21CIP1 и Msi-1. Однако, поскольку экспрессия и p21CIP1 и Msi1 высоко ассоциирована с ER-позитивной субпопуляцией они обнаруживались в разных субнаборах клеток (Clarke et al., 2005), и поэтому вообще идентифицировали предшественников скорее, чем стволовые клетки и в то же самое время демонстрировали, что методы для изоляции проспективных стволовых клеток и анализа их развития в культуре и/или in situ необходимы. Как и у мышей это частично сопровождается выделением и изучением специфических клеточных популяций с помощью использования проточной цитометрии. Как и у мышей клетки побочной (side) популяции были идентифицированы в молочных железах женщин (Alvi et al., 2003; Zhou et al., 2001). Побочная популяция является результатом действия белков ABC транспортерной кассеты и в частности резистентного к раку груди белка 1/ABCG2 (Zhou et al., 2001). Будучи применен в выше упомянутом исследовании Clarke et al., (Clarke et al., 2005), он показал, что боковая популяция в самом деле обогащена ER-позитивными клетками, но они не относятся ни к просветным, ни к миоэпителиальным клеточным клонам, т.к. маркеры этих клеток MUC1 и CALLA, соотв., не экспрессировались (Clarke et al., 2005).

Боковая популяция в противовес др. клеткам, однако, была способна формировать ветвящиеся структуры в трехмерном Matrigel (Clarke et al., 2005), показано методом, которые первоначально был предложен для воспроизведения in situ дифференцировки изолированных клеток (Petersen et al., 1992). Гистологическое окрашивание подтвердило, что клетки молочных желез женщин имеют промежуточную или супрабазальную позицию в эпителии (Clarke et al., 2005; Gudjonsson et al., 2002; Stingl et al., 2001), а в молочных железах взрослых такие с двумя потенциалами CK19⁺/CK14⁺ предшественники, как было установлено, способны дифференцироваться в клоны просветных и миоэпителиальных клеток (Gudjonsson et al., 2002). Поскольку такие дважды позитивные эпителиальные клетки не присутствуют во время раннего развития желез у мышей, они обнаруживаются при половой зрелости, спуся 2-3 после рождения, когда CK14 выявляется среди супрабазальных/ просветных клеток (Sun et al., 2010). Сохраняют ли эти клетки также двойной потенциал, предстоит исследовать.

Стволовые клетки молочных желез женщин разыскивали также с помощью комбинации проточной цитометрии и метода колоний in vitro с маркерами, чтобы идентифицировать предшественники и дифференцирующиеся клетки, соотв. Первоначально эпителиальные клетки молочных желез человека культивировали на питающих слоях из фибробластов, при этом они давали три морфологически отличающихся типа колоний, один экспрессировал просветные маркеры EpCAM, a6 integrin и MUC1, один экспрессировал миоэпителиальный маркер CK14 и один тип обладал смешанными фенотипами с центральной сердцевиной из клеток, экспрессирующих CK19, EpCAM и варьирующие уровни MUC1, окруденные CK14⁺ клетками (Stingl et al., 2001). После пассажей, однако, частоты трех типов колоний сворачивали в сторону миоэпителиальной дифференцировки (составляли 19% колоний в первичной культуре и 97% колоний в третьем пассаже) (Stingl et al., 2001), это указывает на то, что культуральные условия (включающие 5% сыворотки и эпидермального фактора роста) возможно поддерживают размножение миоэпителиальных клеток за счет др. типов клеток. Чтобы подтвердить, что колонии со смешанным фенотипом в самом деле представляют собой колонии и возможно стволовых клеток, EpCAM⁺ клетки были отсортированы в качестве единичных клеток и давали колонии, содержащие центральный стержень из MUC1⁺, окруженный CK14⁺ клетками (Stingl et al., 2001). Эти находки снова оказались в согласии с существованием супрабазальных клеток in situ с низкой экспрессией MUC1 и высокой экспрессией EpCAM/ESA с признаками стволовых клеток (Gudjonsson et al., 2002). Др. информация, как идентифицировать нормальные стволовые клетки молочных желез , получена в исследованиях опухолей, которые могут быть рассмотрены как карикатуры на нормальное развитие. Большинство опухолей груди обнаруживают дифференцировку просветных клеток в терминах экспрессии CK19 и ER. Далее было продемонстрировано, что lin^-/CD44⁺/CD24^low/- клетки из плевральных эксудатов пациентов с раком груди являются более туморогенными у иммуно-некомпетентных мышей, чем CD44^-/CD24⁺ клетки и, более того, lin^-/CD44⁺/CD24^low/- клетки фенокопируют оригинальные опухоли, подтверждая тем самым, что lin^-/CD44⁺/CD24^low/- клетки является раковыми стволовыми клетками (Al-Hajj et al., 2003), тогда как CD24⁺ клетки представляют их потомство.

Молекулярные профили этих двух CD44⁺ and CD24⁺ популяций в опухолях были впоследствии проанализированы и сравнены с CD44⁺ и CD24⁺ клетками, выделенными из нормальных молочных желез (Shipitsin et al., 2007). После замены CD44 на CD44⁺ клеточно-специфический ген, PROCR, почти взаимоисключающий паттерн экспрессии известного просветного эпителия и маркеров стволовых клеток наблюдался в CD24⁺ и PROCR/CD44⁺ популяциях и образование иерархических кластеров SAGE библиотеки очень убедительно демонстрируют, что нормальные и раковые PROCR/CD44⁺ более сходны, чем PROCR/CD44⁺ и CD24⁺клетки, изолированные из одной и той же ткани (Shipitsin et al., 2007). В противоположность более ранним исследованиям, однако, в которых ER⁺ находились внутри побочной (side) популяции стволовых клеток (Clarke et al., 2005), наблюдалась очень низкая концентрация ER в PROCR/CD44⁺ клетках из нормальных молочных желез (Shipitsin et al., 2007).

Др. исследования применяли культуральные модели для выявления сомо-обновления и способности к дифференцировке изолированных клеточных популяций при поиске эпителиальных стволовых клеток молочных желез человека. Метод клонального сферического роста нервных клеток в неслипчивой культуре в т. наз. нейросферы (Reynolds and Weiss, 1996) был адаптирован к эпителиальным клеткам молочных желез (Dontu et al., 2003). Mammospheres могут формироваться из первичных эпителиальных клеток при плотности 20,000 клеток на источник и они могут серийно проходить свыше 5 пассажей с частотой образования mammosphere 4 из 1,000 cells. Клетки, инициирующие mammosphere, содержатся в побочной популяции, а анализ экспрессии генов в mammospheres сравним с таковым в условиях дифференциального роста, демонстрируя, что mammospheres экспрессируют маркеры кандидаты стволовых и клеток предшественников (Dontu et al., 2003). Др. впоследствии показали, что mammosphere побочной популяции имеют CD24^low/CD44^lowфенотип, но что эти клетки не могут формировать mammospheres. Вместо этого способностью инициировать mammosphere обладает популяция CD44^high/CD24^low популяция (Dey et al., 2009) в соответствии с более ранним предположением, что нормальные стволовые клетки молочных желез обладают этим фенотипом (Shipitsin et al., 2007).

Пока неясно до какой степени MUC1^+/-/EpCAM⁺/CK19⁺ предшественники (Stingl et al., 2001) перекрываются с CD44⁺/CD24^- стволовыми клетками (Shipitsin et al., 2007), и обе ли комбинации маркеров предопределяют субнабор клеток, присутствующих с большей частотой, чем ожидалось, для популяции стволовых клеток во взрослой ткани. Т.о., специфический маркер или скоре более специфическая комбинация маркеров гарантирует с высокой вероятностью характеристики стволовых клеток молочных желез человека. Поскольку стволовые клетки молочных желез могут принадлежать базальному или супрабазальному компартментам, то остается нерешенным вопрос, играют ли эти клетки какую-либо роль в развитии рака груди. В этом отношении большинство информации получено на раке груди, ассоциированном с мутациями BRCA и с BRCA1 дефицитными мышами (Lim et al., 2009; Molyneux et al., 2010). Интересно, что расширенный клеточный компартмент у носителей BRCA, выявленный с помощью проточной цитометрии с EpCAM и CD49f, был сходен с компартментом ранее идентифицированным как обогащенный мультипотентными предшественниками в культуральных условиях трёхмерного Matrigel (Lim et al., 2009; Villadsen et al., 2007). Сходным образом CK14/CK19 двойной позитивный компартмент, ранее подтвержденный как подобный стволовому (Villadsen et al., 2007), также расширялся в гаплонедостаточной BRCA1 ткани молочных желез человека (Proia et al., 2011). Т.о., до сих пор установлена четкая ассоциация между компартментом стволовых клеток молочных желез и раком груди, это выглядит, как если бы компартмент просветных предшественников представлял собой наилучшего кандидата в качестве источника клеток, по крайней мере, для базально-подобного рака груди.

The mammary stem cell niche

Ниша стволовых клеток определяется как микроусловия (соседние сигнальные клетки, эпителиальные и стромальны, и компоненты внеклеточного матрикса), окружающие недифференцированные стволовые клетки, которые предоставляют необходимые сигналы для поддержания характеристик, специфичных для стволовых клеток, включая самообновление, неподвижность и незрелая природа (reviewed by (Fuchs et al., 2004)). Точная природа и локализация ниш стволовых клеток молочных желез не установлена полностью, хотя протоки, как полагают, являются кандидатами расположения (Fernandez-Gonzalez et al., 2009; Villadsen et al., 2007). Как утверждалось выше, эпителиальные фрагменты молочных желез, взятые из любой области железы могут давать новое древо протоков, указывая тем самым, что стволовые клетки и их ниши распределённые по всей сети протоков (Daniel et al., 1971; DeOme et al., 1959), или альтернативно, что вся жировая подушка фактически является нишей. Это д. объяснить, почему трансплантация одиночной MRU клетки в очищенную жировую подушку приводит к сложному эпителиальному разрастанию (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006). В то же самое время подчеркивается важность происходящих из стромы сигналов, необходимых для поддержания стволовых клеток молочных желез. Точная природа этих стромальных сигналов, как позитивных, так и негативных, пока невыяснена. Ясно, что эти сигналы д. управлять как симметричными, так и асимметричными делениями стволовых клеток, а также возможно способствовать одновременному развитию окружающей стромы, чтобы возникало полностью функциональное древо протоков. Пока специфические сигнальные пути, участвующие в становлении, поддержании и активации ниш стволовых клеток остаются неуловимыми. Несомненно, что стероидные гормоны играют жизненно важную роль в управлении судьбой стволовых клеток, возможно за счет действия на стволовые клетки клеток ниш. Хотя стволовые клетки молочных желез мышей сами по себе не экспрессируют стероидные рецепторы (Asselin-Labat et al., 2006; Sleeman et al., 2007), рост протоков и альвеол сильно ингибируется у нокаутных по ER мышей (Mallepell et al., 2006). Так, после нокаута ERa, обычная система рудиментарных протоков формируется, но последующий рост протоков во время половой зрелости блокирован. Этот блок может быть, однако. преодолен генерацией химерных эпителиальных структур, включающих смесь дикого типа и ERa нокаутных эпителиальных клеток (Mallepell et al., 2006). Это указывает, что нокаутные клетки содержат популяцию стволовых клеток, но в отсутствие необходимых сигналов от ERa позитивных клеток, их свойства стволовых клеток не поддерживаются. примером критического паракринного фактора, предоставляемого ERa позитивными клетками является amphiregulin, который секретируется в ответ на стимуляцию эстрогеном (Ciarloni et al., 2007). Amphiregulin в свою очередь действует на стромальные клетки, чтобы индуцировать сигнальный каскад, который пока полностью не изучен, но это взаимодействие безусловно ведет к пролиферации стволовых клеток и элонгации протоков (Wiesen et al., 1999). Во время беременности progesterone играет роль в качестве первичного стимулятора альвеологенеза. Progesterone индуцирует секрецию RANK ligand (RANKL) и wnt-4, которые в свою очередь воздействуют на стволовые клетки молочных желез, чтобы стимулировать их экспансию (Brisken et al., 2000; Mulac-Jericevic et al., 2003). Интересно, что RANKL секретируется с помощью просветного клона, поскольку RANK рецептор экспрессируется популяцией стволовых клеток молочных желез (Asselin-Labat et al., 2010) , в свою очередь, оказывая влияние на просветные эпителиальные клетки как часть ниш стволовых клеток. Итак, сценарий, обнаруживаемый в железах мышей, у которых на стадии половозрелости ниши стволовых клеток находятся под контролем эстрогенов, тогда как во время беременности под контролем progesterone. Остается установить, участвуют ли в этих двух нишах одни и те же стволовые клетки и клетки ниш, или изменения клеточного состава ниш происходят во время развития молочных желез.

Всё ещё спорят о точных характеристиках и локализации стволовых клеток молочных желез, однако уже возникает следующий вопрос представляют ли характеристики стволовых клеток, такие как способность к самообновлению и дифференцировке, продемонстрированные для культуральных моделей и с помощью трансплантаций у мышей точные реплики ситуации in vivo . Этот вопрос особенно уместен для стволовых клеток молочных желез человека. В то время как у мышей, окончательным доказательством существования стволовых клеток является способность к клональному заселению вновь очищенных жировых подушек, т.е. внутри исходной ниши (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006), такие эксперименты не могут быть осуществлены у человека и поэтому доказательства базируются на суррогатных методах (Clarke et al., 2005; Dontu et al., 2003; Gudjonsson et al., 2002; Stingl et al., 2001). Сходным образом, поскольку специфические маркеры стволовых клеток молочных желез недоступны, то используются постулируемые суррогатные маркеры стволовых клеток (Villadsen et al., 2007).

Три суррогатных маркера стволовых клеток, SSEA-4, CK15 и CK6a, локализуются фокально в дискретных кластерах клеток в протоках, включая терминальные протоки, и в основном отсутствуют в дольках. В соответствии с тем фактом, что покой является генеральным свойством стволовых клеток в из нишах, то предполагаемые стволовые клетки, располагающиеся в протоках, д. быть покоящимися, тогда как клетки предшественников долек, скорее всего, будут активно делиться. Путем сбора коллагеназой высвобождаемых протоков и долек под микроскопом и анализа клеток, формирующих колонии в культуре, формирующих mammosphere и морфогенез в Matrigel, было предположено, что стволовые клетки, в самом деле, располагаются скорее в протоках, чем дольках. Гистологическое окрашивание далее подтвердило, что зона кандидат стволовых клеток в протоках обогащена клетками, идентифицированными, как содержащие SSEA-4^hi/CK5⁺/CK6a⁺/CK15⁺/Bcl-2⁺ клетки, которые обычно молчащие и окружены chondroitin sulfate. Более того, окрашивание линейными маркерами CK14 и CK19 далее подтвердило мультипотентность клеток в зоне стволовых клеток и три клон-ограниченных типа клеток вне этой зоны (Villadsen et al., 2007). Сам по себе каждый из этих экспериментальных подходов не адекватен для точного определения местонахождения ниш стволовых клеток, но будучи применены коллективно они ведут к идентификации предполагаемой зоны стволовых клеток в молочных железах человека.

Будучи далеки от отслеживания действительных ниш стволовых клеток молочных желез человека, не удивительно, что сигнальные пути, ответственные за самообновление также описаны очень бедно. Некоторые намеки, однако, получены в результате молекулярного профилирования изолированных клеток. В то время как экспрессия BM1 более или менее одинакова в CD44⁺ и CD24⁺ популяциях, гены транскрипционных факторов пути передачи сигналов hedgehog, Gli1 и Gli2 экспрессируются на более высоком уровне в CD44⁺ клетках по сравнению с CD24⁺ клетками (Shipitsin et al., 2007). Это совпадает с находками, что уровни экспрессии Gli1 и Gli2 приблизительно в 25-раз и в 6-раз выше в mammospheres, чем в дифференцированных эпителиальных клетках, культивируемых в монослое (Liu et al., 2006). Это указывает, однако, что уровень экспрессии в mammospheres д. быть сравним с др. не-слипчивыми клетками, чтобы исключить, что 2-D в противовес 3-D культуре само по себе вносит вклад в различия скорее, чем отражает недифференцированные клетки в противовес дифференцированным. Несмотря на это lin^-/CD44⁺/CD24^-/low популяция, изолированная с помощью проточной цитометрии из метастатической карциномы груди человека, ксенотрансплантированной в NOD-SCID мышей, также обладает активированным сигнальным путем hedgehog, включая 30-кратное и 6-кратное увеличение экспрессии Gli1 и Gli2, соотв. (Liu et al., 2006).

В отсутствие информации о нормальных клетках, данные о раковых предшественниках или стволовых клетках могут быть важны. Передача сигналов TGF-beta, по-видимому, важна в CD44⁺ опухолевых клетках. Специфическая активация сигнального пути TGF-beta обусловлена ограниченной экспрессией TGF-beta receptor 2 в CD44⁺ клетках и её молчанием в CD24⁺ клетках. В соответствии с этими различиями воздействие ингибитора TGF-beta рецепторной киназы специфически влияет на CD44⁺ клетки и ведет к мезенхимно-эпителиальному переходу (Shipitsin et al., 2007). Является ли передача сигналов TGF-beta столь же важной в нормальных стволовых клетках молочных желез, предстоит определить. В целом, однако, передача сигналов TGF-beta важна для эпителиально-стромального взаимодействия, а экспрессия TGF-beta в железах мышей обеспечивает ингибирование роста протоков и снижение образования боковых веточек с помощью TGF-beta посредством стромальных рецепторов (reviewed by (Silberstein, 2001)), это, в свою очередь, подчеркивает важность микроусловий.

Др. сигнальные пути, которые могут быть важны для ниш стволовых клеток, это те, что ассоциируют с эмбриональным морфогеном Nodal, также относящемуся к сверхсемейству TGF-beta , и его корецептором Cripto-1 (reviewed by (Strizzi et al., 2008)). В нормальных условиях путь передачи сигналов Nodal строго регулируется на транскрипционном и пост-транскрипционном уровнях, а также с помощью внеклеточных Nodal ингибиторов, таких как Lefty, которые противодействуют сигнальному пути Nodal благодаря связыванию с и взаимодействию с Nodal и/или Cripto-1 (reviewed by (Strizzi et al., 2008)). Этот Nodal и Cripto-1 могут регулировать активность стволовых клеток, что было подтверждено избыточной активностью Cripto-1 у модельных трансгенных мышей, приводящей к усилению образования боковых веточек с латеральной стороны развивающихся протоков (hyperplasia) (Wechselberger et al., 2005) и задержке lobuloalveolar развития (Sun et al., 2005). Интересно, что обеих моделях увеличивается показатель опухолей молочных желез (Sun et al., 2005; Wechselberger et al., 2005), это подчеркивает дерегуляцию ограничивающих сигналов из микроокружения в качестве возможной причины развития опухолей. Приложимы ли сходные механизмы к молочных желез человека пока неизвестно, экспрессия Cripto-1 превалирует в солидных опухолях человека, включая опухоли груди (Kelly et al., 2011).

Genm Notch действует как регулятор клеточной жизнеспособности и пролиферации и является медиатором juxtacrine межклеточной передачи сигналов, при этом лиганды, экспрессируемые на сигнальных клетках, соединяются с рецепторами Notch на соседних сигнал-воспринимающих клетках (reviewed by (Harrison et al., 2010)). Гомологи Notch 1 и Notch 4 позвоночных участвуют в развитии молочных желез, а Notch 4, в частности, был исследован подробнее. Трансгенные WAP/int3 мыши, экспрессирующие постоянно активный Notch 4, обнаруживают развитие и рост меньшего числа долек во время поздней беременности между 14-м днем и родами и не обнаруживают секреторной активности (Gallahan et al., 1996). Во время беременности диспластические повреждения возникают и они затем прогрессируют в карциномы. Девственные, а также рожавшие мыши дают опухоли, но латентный период значительно короче у рожавших мышей. Снова это подчеркивает задержанное или уменьшенное развитие долек или дифференцировка желез выступают в качестве "фактора риска" развития рака. Хотя нормальная функция Notch 4 может поддерживать эпителиальные клетки молочных желез в состоянии, чувствительном к пролиферации, т.е. поддержания способности стволовых клеток и клеток предшественников. Это подтверждено последующими исследованиями клеток рака груди, где Notch активирующие лиганды увеличивают формирование вторичных и третичных mammosphere десятикратно, а также размеры первичных и вторичных mammospheres (Dontu et al., 2004), подтверждая тем самым, что активация Notch способствует самообновлению стволовых клеток.

Итак, в терминах морфологии, развитие молочных желез хорошо описано как у мышей, так и человека. Однако поскольку необходима более целостная картина участия стволовых клеток и дифференцированных клеточных линий, то для этого предстоит уяснить о разных популяциях стволовых клеток, нишах стволовых клеток в молочных железах и сигнальных путях, управляющих разными фазами развития.

Discussion

В то время как оригинальные исследования по трансплантации проложили путь для изучения развития молочных желез, существуют довольно продвинутые протоколы сортировки по многим параметрам эпителиальных клеток молочных желез в комбинации с методом повторного заселения, который является довольно продвинутым в этой области в последнее время. В частности, проспективное выделение различных субнаборов клеток позволило исследователям анализировать иерархию стволовых клеток молочных желез. Также разделение различных субпопуляций позволило получить профили экспрессии генов для индивидуальных субнаборов клеток, чтобы начать выявление сигнальных путей, вносящих вклад в гомеостаз молочных желез. Конечной целью этих подходов является полное понимание развития и функции молочных желез и получение информации, как возникает и развивается рак молочных желез. В самом деле, недавние исследования продемонстрировали, что выяснение иерархии (Lim et al., 2009; Molyneux et al., 2010) позволяет лучше понять происхождение клеток рака груди. Однако, по нашему мнению ряд важных вопросов необходимо иметь в виду при интерпретации результатов, получаемых на молочных железах мыши и человека, соотв. и кроме того необходимо решить некоторе проблемы. Некоторые профили предполагаемых стволовых клеток или популяций, включая клетки с признаками стволовых клеток, были предположены, но пока не совсем ясно, является ли они действительно отображением идентичных клеток. Это обусловлено частично тем фактом, что некоторые маркеры, напр., Sca-1, экспрессируются только в одном из видов (Sleeman et al., 2007; Welm et al., 2002), вместе с тем фактом, что большинство идентифицированных и изолированных популяций, напр., CD44⁺/CD24^- клетки (Shipitsin et al., 2007), возникают с более высокой частотой, чем можно было ожидать для стволовых клеток во взрослой ткани. Даже для хорошо установленных маркеров клеток молочных желез, таких как стероидные рецепторы, существуют нерешенные вопросы. В то время как стволовые клетки молочных желез мышей не экспрессируют ER, всё ещё ведутся споры экспрессируют ли его стволовые клетки молочных желез человека. Более того, исследования клеток человека базируются в основном на методах культивирования, это особенно важно, т.к. ER⁺ клетки нелегко поддерживать и размножать в культуре.

Огромное большинство исследований стволовых клеток молочных желез проводится на мышах. Это обусловлено более легким доступом к гомогенному тканевому материалу по сравнению с тканями человек, последнее сильно зависит от возраста женщин, поведенческих привычек и репродуктивной истории. Др. преимуществом использования мышиной модели является то. что ткань или клетки молочных желез мыши может быть трансплантирована в соотв. им физиологические микроусловия, очищенные жировые подушки. И вообще наиболее важно, с мышами возможны генетические манипуляции и техники, которые позволяют выявление значения, напр., специфического транскрипционного фактора, на определенных стадиях развития железы. Тем не менее, необходима осторожность, при прямой экстраполяции данных с мышей на человека. Хотя много сходства в развитии между этими видами, имеются также и важные отличия. Одним из наиболее очевидных отличий является то, что у людей дольки устанавливаются уже при половой зрелости, тогда как у мышей структуры долек впервые развиваются во время беременности. Более того, в то время как во время инволюции молочные железы мышей структурно напоминают железы нерожавших мышей с сохранением некоторых альвеол (reviewed by (Richert et al., 2000)), молочные железы человека подвергаются существенным морфологическим изменениям в результате беременности и кормления грудью (reviewed by (Russo and Russo, 2004)). Эти структурные различия между молочными железами мыши и человека не были экспериментально исследованы при изучении стволовых клеток, но по нашему мнению, их влияние на характеристики стволовых клеток молочных желез не может быть исключено. Это может быть , напр., оказаться, что или разные популяции стволовых клеток, именуемые у двух видов во время половозрелости и беременности, соотв., или что оперативные сигнальные петли (circuits) не одни и те же у мыши и человека, или и то и др. Даже внутри одного и того же вида разные стадии развития молочных желез могут использовать разные субнаборы стволовых клеток и клеток предшественников. Т.о., в большинстве исследований используются отсортированные стволовые клетки молочных желез мыши между 8-12 неделями, по существу в конце половозрелости. В это время функция стволовых клеток сегрегирует вместе с базальным клоном (Shackleton et al., 2006; Sleeman et al., 2006; Stingl et al., 2006). Однако некоторые TEBs могут всё ещё присутствовать на этой стадии, где cap клетки, которые дают протоковые миоэпителиальные клетки, как полагают, служат в качестве стволовых клеток, отвечающих за рост протоков во время половозрелости (Williams and Daniel, 1983). Вклад cap клеток в обогащенную популяцию стволовых клеток молочных желез, выделяемых по высокой экспрессии CD49f и CD29, не может быть целиком исключен и всё ещё неизвестно, являются ли cap клетки равными стволовым клеткам молочных желез взрослых. Фактически недавнее исследование показало, что активно делящиеся cap клетки во время половозрелости, также как и базальные клетки альвеолярных зачатков при беременности функционируют как мультипотентные само-обновляемые стволовые клетки (Bai and Rohrschneider, 2010) и что они обе соответствуют ранее выделяемым MRU клеткам, обогащенными по высокой экспрессии CD29 и CD49f (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006). Во время беременности появляется др. популяция стволовых клеток, PI-MECS, которая, как было установлено, обладает luminal-like свойствами(Wagner et al., 2002), которая отличается от MRU клеток, изолируемых из желез девственниц (Shackleton et al., 2006; Sleeman et al., 2006; Stingl et al., 2006). Представляют ли эти две последние популяции клеток одни и те же клетки или отдельные реальности стволовых клеток, предстоит определить.

Др. достоверным отличием между железами человека и мыши является состав непосредственного микроокружения эпителия. Мышиный эпителий внедрен в жировую ткань с относительно немногими фибробластами и кровеносными сосудами, тогда как человеческий эпителий внедрен в сильно коллагеновую строму, пронизанную внутридольковыми фибробластами и врожденной сетью кровеносных сосудов (Ronnov-Jessen et al., 1996), это подразумевает, что существуют разные типы взаимодействий между эпителием и стромой. Были предприняты измерения, чтобы оценить эти выдающиеся различия, которые во многих отношениях могут снизить значение мышиной модели. Мышиные жировые подушки могут быть fat pad can be "humanized" путем включения человеческих фибробластов перед трансплантацией эпителиальных и стромальных клеток человека в очищенные жировые подушки NOD/SCID иммуно-некомпетентных мышей (Kuperwasser et al., 2004). Жировые подушки молочных желез в возрасте 3-х недель были очищены и спустя 2 недели в них инъецировали фибробласты человека и после этого железы были готовы к немедленной трансплантации. Системные гормональные условия во время половозрелости достаточны, чтобы обеспечить пролиферацию и дифференцировку эпителия и в то же самое время воспроизводить критические аспекты морфогенеза нормальных молочных желез, а также рака груди (Kuperwasser et al., 2004). При этом методе кандидаты на роль стволовых клеток из молочных желез человека, изолированные на базе повышенной активности aldehyde dehydrogenase , как было установлено, дают разрастания, содержащие как просветные, так и миоэпителиальные клетки (Ginestier et al., 2007). Также др. in vivo метод не прямо использующий микроусловия молочных желез, но тем не менее хорошо подходящий для изучения потенциала разрастания эпителиальных клеток молочных желез человека, имеет отношение к изучению стволовых клеток молочных желез. Здесь изолированные клетки или фрагменты ткани, скомбинированные со стромальными клетками в коллагеновом геле, помещали под сильно васкуляризованную подпочечную капсулу иммуно-некомпететных мышей (Eirew et al., 2008; Parmar et al., 2002). В этих условиях базальные клетки обнаруживали наивысшую способность генерировать физиологически значимые разрастания в противоположность просветным клеткам (Eirew et al., 2008), это находится в хорошем соответствии с ранее опубликованными сообщениями по стволовым клеткам молочных желез мыши (Shackleton et al., 2006; Sleeman et al., 2006; Stingl et al., 2006). Однако не выявлена специфическая субпопуляция внутри всего базального компартмента, которая бы определялась как обогащенная кандидатами стволовых клеток, а скорее было показано, что активность стволовых клеток внутри молочных желез человека ко-сегрегирует с базальным клоном, будучи протестирована в этих условиях in vivo.

Фактически сегодня немного известно о клеточной гетерогенности среди базальных клеток в молочных железах человека и мыши. Это контрастирует с современным знанием об иерархии среди просветных клеток, где определено несколько самостоятельных субпопуляций с разными функциональными свойствами (Asselin-Labat et al., 2007; Sleeman et al., 2007). То, что стромальные микроусловия в самом деле важны в этих двух методах далее подчеркивается тем фактом, что без совместной инокуляции фибробластов, эпителиальные разрастания в трансплантатах не возникают (Eirew et al., 2008; Kuperwasser et al., 2004; Parmar et al., 2002). Критическая роль микроусловий в детерминации судьбы трансплантированных клеток молочных желез мышей в очищенные жировые подушки молочных желез также недавно была тонко продемонстрирована (Bai and Rohrschneider, 2010).

Когда стволовые клетки альвеолярных зачатков, выделенные в состоянии беременности, были инъецированы в очищенные жировые подушки половозрелых мышей, то они переключались на pubertal программу развития и начинали формировать разветвленное древо протоков (Bai and Rohrschneider, 2010), т т.о., отвечали на новые микроусловия скорее, чем воспроизводили свою современную стадию развития. Эти наблюдения четко демонстрируют, что метод золотого стандарта для стволовых клеток молочных желез, очищенные жировые подушки молочных желез , имеет ограничения.

Свойства стволовых клеток из трансплантированных клеток, по-видимому, находятся под контролем сигналов из ниш, предоставляемыми с помощью микроусловий, которые могут подвергаться изменениям временным и пространственным способом. Следовательно, фактически, некоторые субпопуляции клеток обладают более высоким регенеративным потенциалом, чем др., это может отражать то, что интересующие клетки способны отвечать более эффективно на сигналы ниш, чем сегодня это представляется. Более того, способность клеток отвечать на микроусловия может зависеть от профиля её поверхностных маркеров. Напр., высокая экспрессия интегринов, как полагают, помогает клеткам слипаться с внеклеточным матриксом при трансплантации, обеспечивая необходимыми сигналами для выживания и экспансии (reviewed by (Smith, 2006)). Следовательно, регенеративный потенциал разных клеточных субпопуляций может рассматриваться как комбинаторный результат свойств их стволовых клеток и их способности отвечать на окружающие микроусловия. Следовательно, можно считать, что отсутствие позитивного результата при трансплантации может быть не обязательно указанием, что клетки лишены мультипотентности или окончательно дифференцированы, а скорее, что используемый метод не пригоден для выявления их действительных характеристик.

In conclusion, while many issues remain to be investigated and await the identification of novel markers to reveal mammary stem cells and their niches as well as development of more appropriate models to address questions specifically about the human gland, the search of the stem cell within the mammary epithelium has nevertheless begun to establish cellular hierarchies (Sleeman et al., 2007; Villadsen et al., 2007). These findings in turn spur the search of the cellular origin of cancer, hopefully leading to novel strategies of diagnosis, prognosis and treatment of human breast cancer.

Mammary gland stem cells: current status and future challenges AGLA J.R. FRIDRIKSDOTTIR, OLE W. PETERSEN and LONE RONNOV-JESSEN Int. J. Dev. Biol. 55: 719-729 doi: 10.1387/ijdb.113373af

Mammary gland stem cells: current status and future challenges
AGLA J.R. FRIDRIKSDOTTIR, OLE W. PETERSEN and LONE RONNOV-JESSEN
Int. J. Dev. Biol. 55: 719-729 doi: 10.1387/ijdb.113373af