Посещений:
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

Роль и механизмы

Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond
Peter A. Jones
Nature Reviews Genetics Nat Rev Genet. 2012 May 29;13(7):484-92. doi: 10.1038/nrg3230.

DNA methylation is frequently described as a ‘silencing’ epigenetic mark, and indeed this function of 5-methylcytosine was originally proposed in the 1970s. Now, thanks to improved genome-scale mapping of methylation, we can evaluate DNA methylation in different genomic contexts: transcriptional start sites with or without CpG islands, in gene bodies, at regulatory elements and at repeat sequences. The emerging picture is that the function of DNA methylation seems to vary with context, and the relationship between DNA methylation and transcription is more nuanced than we realized at first. Improving our understanding of the functions of DNA methylation is necessary for interpreting changes in this mark that are observed in diseases such as cancer.


(Рис.1.)  |  Figure 1 | Molecular anatomy of CpG sites in chromatin and their roles in gene expression.


(Рис.1.)  |  Figure 2 | Silencing precedes DNA methylation.

CpG islands
CpG-rich regions of DNA that are often associated with the transcription start sites of genes and that are also found in gene bodies and intergenic regions.

Bisulphite-treated DNA
Bisulphite treatment of DNA converts cytosine to uracil but leaves 5-methylcytosine intact. Thus, 5-methylcytosine patterns can be mapped by subsequent sequencing.

Insulators
DNA elements that control interactions between enhancers and promoters. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond

Ten-eleven translocation (TET).
Proteins of this type were recently shown to catalyse the conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine.

Activation-induced cytidine deaminase (AID).
An enzyme that removes the amino group from cytosine or 5-methylcytosine. It is involved in class switch recombination and DNA demethylation.

Thymine DNA glycosylase
A protein that is involved in the repair of T:G mismatches that are often caused by 5-methylcytosine deamination and that participates in DNA demethylation.

Nucleosome-depleted regions
(NDRs). Regions of DNA that are not extensively wrapped up in nucleosomes. They can be seen at transcription start sites and other regulatory regions such as enhancers.

Polycomb proteins
Polycomb proteins participate in the silencing of genes by mechanisms that do not involve DNA methylation. They often silence genes that are key regulators of differentiation.

Imprinted genes
Imprinted genes show parent-of-origin expression and are controlled by epigenetic processes, including DNA methylation.

X-chromosome inactivation
One of the two X chromosomes in female mammalian somatic cells is stably silenced by epigenetic processes, including DNA methylation, to achieve dosage compensation.

Fragile X syndrome
A developmental disorder triggered by the genetic expansion of triplet repeats near the promoter of the FMR gene, which leads to its silencing, DNA methylation and to the disease phenotype.

Immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies syndrome (ICF syndrome).
This can be caused by mutations in DNA methyltransferase 3B (DNMT3B) and leads to centromeric instability, developmental abnormalities and immune deficiencies.

Две ключевые работы в 1975 независимо показали, что метилирование цитозиновых остатков в контексте CpG динуклеотидов может служить в качестве эпигенетической метки у позвоночных1,2. В этих работах было предположено, что последовательности могут быть метилированы de novo, что метилирование может наследоваться в ходе делений соматических клеток за счет механизма, использующего энзим, который распознает гемиметилированные CpG палиндромы, так что присутствие метильных групп может быть интерпретировано с помощью ДНК-связывающих белков и что метилирование ДНК непосредственно делает гены молчащими. Хотя некоторые из этих ключевых догматов скорее всего корректны, взаимоотношение между метилированием ДНК и молчанием генов, как оказалось, сложно разгадать. Большинство работ на животных сфокусировано на 5-methylcytosine (5mC) в контексте последовательности CpG. Метилирование др. последовательностей широко распространено у растений и некоторых грибов3,4 и как недавно было установлено и млекопитающих5. У млекопитающих функция метилирования non-CpG пока неизвестна. Здесь основное внимание будет уделено метилированию CpG в геномах млекопитающих, включая некоторое обсуждение о наблюдаемых отличиях у др. животных и растений.
Понимание функции метилирования ДНК нуждается в рассмотрении распределения метилирования по геному. Более половины генов в геноме позвоночных содержат короткие (приблизительно в 1 kb) регионы, богатые CpG, известные как CpG islands (CGIs), а остальная часть генома небогата CpGs. Поскольку 5mC может быть превращен в thymine за счет спонтанного или энзиматического деаминирования, считается, что потеря геномных CpGs обусловлена деаминированием метилированных последовательностей в зародышевой линии; CGIs, как полагают, существуют из-за того, что они, по-видимому, никогда или лишь временно метилируются в зародышевой линии6. Существует множество рассуждений, как в точности должны быть определены CGI7 и хотя CpG плотность в промоторах геномов млекопитающих имеет бимодальное распределение, регионы с промежуточной плотностью CpG всё же существуют8. Вплоть до недавнего времени большинство работ по метилированию ДНК концентрировалось на CGIs в transcriptional start sites (TSSs), в данной работе будут рассмотрены общие положения о функции метилирования ДНК.
Недавние подходы, которые делают возможным изучение метилома (BOX 1) - напр., используя обработанную bisulphite ДНК (которая обнаруживает 5mC и hydroxymethyl-cytosine; см. BOX 1) - подчеркнули, что позиция метилирования в транскрипционной единице влияет на его отношение к генетическому контролю. Напр., метилирование в непосредственно близи к TSS блокирует инициацию транскрипции, но метилирование в теле гена не вызывает блокирования и может даже стимулировать элонгацию транскрипции, а захватывающие новые доказательства подтверждают, что метилирование в теле гена может оказывать влияние на сплайсинг. Метилирование в повторяющихся регионах, таких как центромеры может быть важным для стабильности хромосом9 (напр., для сегрегации хромосом в митозе) и также, скорее всего, супрессирует экспрессию мобильных элементов и т.о., играет роль в стабильности генома. Роль метилирования в изменении активности энхансеров, инсуляторов и др. регуляторных элементов только начинает вырисовываться. Более того, хотя имеются многочисленные доказательства, что метилированные CGIs в TSSs связаны с некоторыми молчащими генами, время метилирования de novo в отношении замалчивания генов сегодня начинает выясняться.
Функция метилирования ДНК от природы связана с механизмами становления, поддержания и удаления метильных групп. Эти механизмы детально рассмотрены10,11, но некоторые ключевые точки необходимо держать в голове. Уже много лет известно, что ДНК метилтрансферазы, включая т.наз. de novo ДНК метилтрансферазы DNMT3A и DNMT3B, важны для становления паттернов метилирования ДНК в раннем развитии. Нашему осознанию того, как это происходит, может существенно помочь от факт, что в некоторых случаях субстратом для de novo метилтрансфераз является ДНК нуклеосом и что модификации гистонов внутри нуклеосом оказывают значительное влияние на способность этих энзимов вызывать метилирование de novo12. Ранее считалось, что DNMT1 сама собой может поддерживать установившийся паттерн метилирования ДНК, но сегодня мы знаем, что это неверно и что участие DNMT3A и DNMT3B необходимо для поддержания метилирования10. Каждая из трех DNMTs необходима для эмбрионального и неонатального развития13,14, а полное отсутствие метилирования несовместимо с жизнью соматических15 или раковых клеток16, но не эмбриональных стволовых клеток (ESCs)17. DNMT3A, как было установлено, важна для дифференцировки гематопоэтических стволовых клеток18, это также подчеркивает фундаментальную роль 5mC в дифференцировке позвоночных. Время метилирования de novo в отношении замалчивания гена это область дискуссий, но идея, что метилирование ДНК непосредственно замалчивает гены de novo, как полагают Riggs2 и Holliday and Pugh1, по-видимому, не является преимущественным путем замалчивания генов. 5mC может быть удален или пассивным или активным способом, чтобы установить пермиссивное состояние для последующей экспрессии гена. Поиск ДНК деметилаз был долгим и был чреват множеством фальшь-стартов19, но сегодня довольно широко принято, что деметилазы существуют20,21. недавно большое количество работ показало, что активное деметилирование может быть достигнуто, хотя для этого необходим механизм, которые в конечном итоге использует клеточное деление или репарацию ДНК и эксцизию оснований скорее, чем удаление непосредственно метильной группы с 5mC половинки11,22. Вовлечение энзимов, таких как ten-eleven translocation (TET) methylcytosine dioxygenases, activation-induced cytidine deaminase (AID) и thymine DNA glycosylase (TDG) в активном и пассивном деметилировании и в активации генов сегодня общеизвестно11,23-26. В самом деле, отсутствие TET3 ведет к неспособности деметилирования CpG сайтов в ключевых генах, таких как Oct4 (также известного как Pou5f1) или Nanog, в отцовском геноме и задерживает эмбриогенез27,28.
Альтерации в метилировании ДНК, как известно сегодня, кооперируют с генетическими событиями и участвуют в канцерогенезе у человека29. Следовательно, понимание роли метилирования ДНК важно для понимания этих болезненных процессов. В обзоре я оцениваю доказательства, связанные с функциями метилирования ДНК в разных геномных контекстах, с особым вниманием взаимоотношению с транскрипцией (ключи известные и неизвестные суммированы в BOX 2). Затем будут рассмотрены механизмы, с помощью которых метилирование ДНК может осуществлять свои эффекты - напр., путем изменения связывания белка.

Transcription start sites


Patterns at CpG island transcription start sites. Большинство CGIs остается неметилированным в соматических клетках. Если гены с CGIs в своих TSS активны, то их промоторы обычно характеризуются nucleosome-depleted regions (NDRs) в TSS, и эти NDRs часто фланкированы нуклеосомами, содержащими вариант гистона H2A.Z, и маркированный триметилированием гистон H3 по лизину 4 (H3K4me3)30 (FIG. 1). Уровни экспрессии генов контролируются с помощью транскрипционных факторов31. CGI промоторов могут быть репрессированы с помощью различных механизмов, таких как репрессия, обеспечиваемая с помощью белков Polycomb. Напр., гены, кодирующие основные регуляторы эмбрионального развития, такие как myogenic differentiation 1 (MYOD1) или paired box 6 (PAX6), супрессируются с помощью Polycomb комплекса как в ESCs, так и дифференцированных клетках, которые не экспрессируют этих генов; они содержат нуклеосомы в TSS и маркированы с помощью H3K27me3, который обычно ассоциирует с неактивными генами32.
Однако некоторые репрессированные гены не имеют в промоторах метилированные CGIs. Метилированные промоторные CGIs обычно ограничены генами, которые находятся в долговременной стабилизации репрессированного состояния. Примеры включают импринтированные гены,гены, расположенные на неактивной Х хромосоме, и гены, которые экспрессируются исключительно в зародышевых клетках и которые, по-видимому, непригодны для экспрессии в соматических клетках. Стабилизация супрессии метилирования ДНК в CGIs может длиться более 100-лет жизни и не будет оказывать эффекта на существование

Box 1 | Measuring DNA methylation genome-wide Several approaches have been developed over the past few years to map 5-methylcytosine (5mC) patterns on a genome-wide scale, and their strengths and weaknesses have recently been compared89. These methods include enzymatic digestion with methylation-sensitive restriction enzymes and capture of 5mC by methylated DNA-binding proteins followed by next-generation sequencing. Methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) is another approach in which extracted DNA is cleaved, denatured and precipitated using an antibody to 5mC, and then the precipitated fragments are sequenced35. Methods based on the treatment of DNA with bisulphite have become very popular. Bisulphite treatment converts unmethylated Cs to Us, which are subsequently amplified as Ts by PCR. Microarrays, such as the Illumina 450K array, have been used extensively to analyse bisulphite-treated DNA. Reduced representation bisulphite sequencing is an approach in which DNA is cleaved by methylation-sensitive restriction enzymes before bisulphite treatment. The most comprehensive coverage at single-base level is obtained by shotgun sequencing of bisulphite-treated DNA. A potential problem with the use of bisulphite sequencing is the fact that it cannot distinguish between 5mC and 5-hydroxmethylcytosine, which has recently been found in DNA. The current data may therefore have to be revisited in the future to accommodate this fact90. Although biases can be introduced by all of these approaches, analysing the data in conjunction with genetic polymorphisms such as SNPs can provide a calibration of expected to observed results, thus validating the results.


CGIs, поскольку любое событие деаминирования внутри этих регионов в соматических клетках не будет проходить посредством зародышевой линии в последующие поколения. Мы всё ещё не совсем понимаем, почему минимальное количество CpG островков становится метилированным, тогда как большинство - нет.
Patterns at non-CpG-island TSSs. В противоположность генам с CGIs в своих TSSs, происходят значительные флюктуации в уровнях метилирования промоторов генов, которые бедны CpG в TSS. Гены с отсутствием CGI в TSSs, которые экспрессируются в примордиальных зародышевых клетках, оказываются неметилированными в TSS, тогда как гены, которые исключительно экспрессируются в ESCs или ткане-специфические гены часто обнаруживают метилирование в спермиях, но не ооцитах или в экспрессирующих соматических клетках33. Хорошо известны примеры генов, кодирующих OCT4 и NANOG транскрипционные факторы, которые важны для поддержания состояния стволовых клеток. Недавнее исследование подтвердило, что OCT4 и NANOG промоторы могут подвергаться активному деметилированию с помощью AID11,22 и/или с помощью TET3 (REF. 27). Некоторые тканеспецифические гены, однако, обнаруживают метилирование в спермиях и в ESCs и обнаруживают деметилирование только в специфических тканях, в которых эти гены экспрессируются34.
Одно геномное исследование постулировало, что не существует обратного взаимоотношения между метилированием non-CGIs и экспрессией35, но повторный анализ данных подтвердил, что такое взаимоотношение между экспрессией и метилированием фактически очевидно по всему геному36. Несмотря на длительное исследование CGIs, мы всё ещё не знаем деталей роли метилировании в контроле non-CGI TSSs.
Does methylation silence transcription initiation? Принимая во внимание наблюдения метилирования в некоторых репрессированных TSSs, описанные выше, каковым же является функциональное взаимоотношение между метилированием ДНК и инициацией транскрипции? Существует неопровержимое доказательство, что метилированные CGIs в TSSs не могут инициировать транскрипцию после того, как ДНК была собрана на нуклеосомах37-39. Однако вопрос, что возникает первым молчание или метилирование дискутировался долго. Ранние эксперименты Lock et al.40 чётко показали, что метилирование гена Hprt на неактивной Х хромосое происходит после как хромосома оказывается инактивированной. Др. словами метилирование появляется, чтобы служить в качестве 'замка', чтобы укрепить ранее достигнутое состояние молчания X-сцепленных генов. Хотя большинство CGIs аутосомных генов остается неметилированным в соматических клетках, небольшое количество их (менее 10%) оказывается метилированным в нормальных клетках и тканях7, но время de novo метилирования в отношении молчания не было изучено глубоко. Как упоминалось выше, недавние находки относительно роли DNMT3A в дифференцировке гематопоэтических стволовых клеток вызывают сомнения относительно универсальности давней модели 'запирания' 18. Поскольку авт. этого исследования показали, что метилаза важна для дифференцировки достаточно коротко живущих типов клеток, то безусловно возможно, что метилирование ДНК выполняет более инструктивную роль в инициации скорее, чем в закреплении молчания.
Геномные исследования раковых клеток, однако, показали, что гены с CGI в промоторах, которые уже замалчиваются с помощью Polycomb комплексов, значительно более склонны, чем др. гены, становиться метилированными при раке: т.е. состояние молчание предшествует метилированию36,41-43. Следовательно, очень возможно, что молчание, предшествующее метилированию, является общим механизмом, но данные всё ещё недостаточно созрели, чтобы быть безошибочными. Помимо альтераций в самих CpG островках, тканеспецифические изменения происходят в 'окаймлении', окружающем их44. Однако значение этих альтераций неясно. Доказательства относительно времени метилирования ДНК согласуются с идеей, что метилирование добавляет дополнительный уровень стабильности эпигенетическому состоянию. Интересно, что это не обязательно для этих целей у некоторых видов, включая Drosophila melanogaster и дрожжи.
The relationship between transcription and de novo methylation. Причины, почему метилирование ДНК, по-видимому, не используется в качестве инициального механизма молчания теперь только начинают проясняться. Пионерская работа Ooi et al.12 показала, что процесс метилирования de novo в клетках, экспрессирующих DNMT3L (которая является каталитически неактивным гомологом DNMT3A и DNMT3B) достигается за счет тетрамерного комплекса из двух молекул DNMT3A2 и DNMT3L и нуждается в нуклеосомах. Активные TSSs истощены по нуклеосомам и поэтому лишены этого субстрата для метилирования de novo. Недавно мы непосредственно тестировали роль нуклеосом в запуске метилирования de novo, исследуя кинетику замалчивания OCT4 в клетках эмбриональной карциномы, индуцированных к дифференцировке с помощью ретиноевой кислоты45 (FIG. 2). Эти эксперименты показали, что дистальный энхансер OCT4 и промотор NANOG вследствие дифференцировки, сначала

Box 2 | Known and unknown features of DNA methylation in mammals This box summarizes the key points regarding our knowledge and lack of knowledge of DNA methylation in mammals.

Known
oMost CpG islands (CGIs) are not methylated when located at transcription start sites (TSSs).
oCGI methylation of the TSS is associated with long-term silencing (for example, X-chromosome inactivation, imprinting, genes expressed predominantly in germ cells and some tissue-specific genes).
oCGIs in gene bodies are sometimes methylated in a tissue-specific manner.
oNon-CGI methylation is more dynamic and more tissue-specific than CGI methylation.
oMethylation blocks the start of transcription not elongation (note that this is different in the fungus Neurospora crassa).
oMethylation of transposable elements silences these elements but allows the host gene to undergo transcriptional elongation.
oGene body methylation contributes to cancer?causing somatic and germline mutations53.

Unknown
oDoes non-CGI methylation silence genes (that is, is it a cause or a consequence)?
oThe function of methylation in the context CHG (where H is A, C or T).
oThe roles of active and passive demethylation in activating genes.
oThe function of 'shore' methylation.
oDoes gene body methylation control splicing?
oThe role of 5-hydroxymethylation in the brain and other tissues.
oThe role of methylation in enhancer or insulator function.
oDoes silencing always precede methylation?


предоставляют нуклеосомы и затем это сопровождается рекрутированием DNMT3A на эту нуклеосому и затем происходит метилирование de novo. Происходит ли сходная последовательность событий в клетках, которые не экспрессируют DNMT3L пока неизвестно. Более того, Ooi et al.12 показали, что метилирование de novo не происходит на нуклеосоме, несущей H3K4me2 или H3K4me3 метки, которые ассоциируют с активными генами. Нуклеосомы, фланкирующие истощенную по нуклеосомам точку старта, часто содержат, как гистоновую метку H3K4me3 , так и гистоновый вариант H2A.Z, оба из которых обнаруживают строгую отрицательную корреляцию с метилированием ДНК46,47. Появление H3K4me3 метки у мышей возможно поддерживается присутствием CXXC finger protein 1 (CXXC1; также известного как CFP1), который рекрутирует H3K4 метилтрансферазу в регион, гарантируя тем самым, что +1 и -1 нуклеосомы будут содержать метки, которые несовместимы с метилированием ДНК de novo48. Неметилированное состояние островка CpG также, по-видимому, гарантируется присутствием TET1 белка, которые обнаруживается в высокой пропорции TSSs промоторов с высоким содержанием CpG. Возможно, TET1 превращает любой 5mC, который может быть в этом регионе в 5-hydroxymethylcytosine49. Молекулярная анатомия активных CGIs может , следовательно, объяснить, почему существует резистентность ек метилированию (FIG. 1).
Конечно не все CGI-промотеры генов экспрессируются в ESCs и многие супрессированы с помощью Polycomb комплекса, так почему же они не метилируются de novo? Ответ, по-видимому, заключается в том факте, что они содержат антагонистические H3K4me3 (REF. 12) и H2A.Z метки46,47 и также связаны с помощью TET1, это должно гарантировать, что они останутся свободными от 5mC. Интересно, что эта защита, по-видимому, разрушается во время иммортализации50 и эти CGIs становятся высоко чувствительными к метилированию de novo, которое возрастает после онкогенной трансформации41-43.
Эта модель предсказывает, чем выше уровень экспрессии, тем менее вероятно то, что CGI окажутся метилированными de novo. Прямые доказательства, подтверждающие это предсказание, получены в нескольких важных работах, которые показали, что моноаллельное метилирование CGIs преимущественно происходит на аллеле, которые экспрессируется не столь высоко. Напр., Hitchins et al.51 показали, что аллель гена MLH1, содержащий вариант одного нуклеотида в промоторе, которые был менее активным, чем более распространенный аллель в экспериментах по трансфекции, обнаруживал большую склонность становиться метилированным в соматических клетках в семьях с раковыми опухолями. Др. словами, менее активный аллель являлся тем аллелем. которые с большей охотой приобретает метилирование de novo. Альтернативный сценарий был продемонстрирован Boumber et al.52, которые установили, что аллель RIL (также известный как PDLIM4) обладает полиморфизмом в промоторе, который создает дополнительный сайт связывания для транскрипционного фактора SP1 или SP3. оказался значительно менее склонным становиться метилированным de novo, чем аллель без этого полиморфизма. Добавочный SP1 сайт, следовательно, обеспечивает резистентность этого аллель я метилированию de novo, хотя авт. не смогли продемонстрировать, что сайт связывания добавочного транскрипционного фактора усиливает генную экспрессию.

Gene body methylation


Большинство тел генов бедны CpG, они экстенсивно метилируются и содержат множественные повторяющиеся и мобильные элементы. Метилирование сайтов CpG в экзонах генов является основной причиной мутационных переходов C->T, приводящих к мутациям, вызывающим болезни, в зародышевой линии и к мутациям вызывающими рак в соматических клетках53. Важно понять, что хотя многие CGIs локализованы в промоторах генов, CGIs существуют также внутри ле генов54 и в лишенных генах частях. Хотя их функции остаются неизвестными, Adrian Bird предположил, что эти регионы могут представлять собой 'орфановые промоторы', которые могут быть использованы на ранних стадиях развития и избегают метилирования в зародышевой линии, так что в них высокая плотность CpG поддерживается55.
Метилирование тела гена не связано с репрессией. Давно известно, что метилирование ДНК является свойством транскрибируемых генов56. Экстенсивные позитивные корреляции между активной транскрипцией и метилированием тела гена, как было подтверждено на активной Х хромосоме57 и при shotgun bisulphite секвенировании геномов растений и животных3,5,58. Большинство тел генов не содержат CGIs, и когда CGIs размещены во внутригенных регионах, то они за редким исключением59, остаются неметилированными. Однако недавние эксперименты55,60 изменили это понимание: напр., около 34% из всех внутригенных CGIs метилированы в головном мозге человека60. Роль этого метилирования, которое является тканеспецифическим, неясна. Это занимательно, особенно из-за того, что TSSs остаются в основном не метилированными. Внутригенные CGIs могут быть также сайтами преимущественного метилирования de novo в раковых опухолях61.
Даже если CGIs в теле гена оказываются сильно метилированными, это не блокирует элонгацию транскрипции. Это происходит несмотря на тот факт, что метилированные CGIs маркированы с помощью H3K9me3 и связаны с methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2), которые являются особенностями хроматина, которые ассоциированы с репрессированной транскрипцией, когда они присутствуют в TSS62. Это ведет к кажущемуся парадоксу, согласно которому метилирование в промоторе обратным образом скоррелировано с экспрессией, тогда как метилирование в теле гена позитивно скоррелировано с экспрессией54. Т.о., у млекопитающих инициация транскрипции, но не элонгация транскрипции, по-видимому, чувствительны к молчанию, вызываемому метилированием ДНК. Напротив, метилирование цитозина в CpG и др. контекстах последовательностей у Neurospora crassa блокирует элонгацию, но не инициацию4. Следовательно, не просто присутствие 5mC метки само по себе управляет своим взаимоотношением с транскрипцией, а скорее интерпретацией метки в определенном геномном или клеточном контексте.
Possible functions of gene body methylation. Какова функция метилирования в теле гена вне CGIs? Первоначально полагали, что такое метилирование является, прежде всего, механизмом для замалчивания повторяющихся элементов ДНК, таких как ретровирусы, LINE1 элементы, Alu элементы и др., и были получены доказательства, подкрепляющие эту идею63. Метилирование блокирует инициацию транскрипции этих элементов, тогда как в то же самое время позволяют транскрибироваться гену хозяину, пропуская их. Было предположено, что процесс элонгации транскрипции д. сам по себе стимулировать метилирование ДНК и что H3K36me3, который обычно ассоциирует с элонгацией, но не инициацией, может участвовать в рекрутировании DNMTs64. Однако геномные исследования показали, что могут существовать альтернативные функции метилирования ДНК в теле гена. Эта работа показала, что экзоны метилированы сильнее, чем интроны, а переходы в степени метилирования происходят на границах экзон-интрон, тем самым подтверждается роль метилирования в регуляции сплайсинга65. В самом деле, данные по геномному позиционированию нуклеосом показывают, что экзоны также обнаруживают более высокие уровни присутствия нуклеосом по сравнению с интронами66 и нуклеосомы являются преимущественными местами метилирования ДНК67. недавнее исследование подтвердило, что связывание CTCF (который может регулироваться с помощью метилирование ДНК; см. ниже) может приводить к приостановке RNA polymerase II (RNAPII) и поскольку кинетика движения RNAPII влияет на сплайсинг, это может связывать метилирование ДНК со сплайсингом68. Эти наблюдения подтверждают ранее нераспознанную роль метилирования ДНК на транскрипционном уровне, возможно приводя в результате к альтернативному сплайсингу. Поэтому кажется вполне возможным, что метилирование ДНК в теле гена будет иметь последствия помимо распознаваемой функции в замалчивании внутригенных повторяющихся последовательностей ДНК.
When is a body a start site? Часто предполагается, что TSSs и тело гена являются двумя отдельными геномными характеристиками. Однако большинство генов имеет, по крайней мере, два TSSs, так что нижестоящие сайты старта находятся внутри 'тел' транскрипционных единиц вышестоящих промоторов. Эти альтернативные промоторы могут быть CGIs или non-CGIs, или могут существовать комбинации вышестоящих non-CGI и нижестоящих CGI, или наоборот. Эти альтернативные места старта осложняют интерпретацию экспериментов по связи экспрессии с метилированием, поскольку зонды, которые используются, для измерения экспрессии часто определяют результат со всех промоторов, даже если только один может быть активным в данном типе клеток. Метилирование нижестоящего промотора д. только блокировать транскрипцию с этого промотора - это д. позволять элонгацию транскрипта, который исходит из вышестоящего промотора62 - приводя к кажущемуся диссонансу между метилированием и экспрессией. В самом деле, метилирование ДНК может быть прекрасным механизмом для контроля за использованием альтернативного промотора60.

Other regulatory sites


Methylation at enhancers. Энхансеры располагаются на различных расстояниях от промоторов и являются ключевыми элементами контроля генной экспрессии в развитии и клеточной функции. Они в основном бедны CpG и статус их метилирования был исследован путем анализа всего метилома (у растений и млекопитающих)3,5,69. В целом эти регионы обнаруживают тенденцию меть довольно вариабельное метилирование. В самом деле, Stadler et al.70 идентифицировали энхансеры в геноме мыши на базе того, что они являются регионами, которые метилированы не на 100% или не метилированы и назвали их 'low-methylated regions' (LMRs). Принимая во внимание, что цитозин может быть или полностью метилирован или не метилирован, 'варьирующее метилирование' является результатом усреднения этих бинарных состояний. Это может указывать на то, что CpG сайты находятся в динамическом состоянии и что в данный момент некоторые метилированы, а др. нет, благодаря конкуренции событий метилирования и деметилирования. Альтернативно, статус метилирования ДНК каждого CpG может не аккуратно поддерживаться во время клеточных делений и состояние LMR может быть обусловлено неэффективным наследованием. В разных субнаборах T клеток, Schmidl et al.71 также нашли большие количества дифференциально метилированных регионов (DMRs) внутри энхансеров специфичных для дифференцировки генов. В терминах функции это исследование показало, метилирование этих CpG сайтов может быть результатом снижения активности энхансера.
Идея, что статус метилирования энхансера и функция энхансера тесно связаны подтверждается несколькими наблюдениями белков, которые модулируют метилирование в этих регионах. Напр., анализ связывания глюкокортикоидного рецептора с дистальными регуляторными элементами показал. что CpGs могут становиться деметилированными и что энхансер может быть активирован в присутствии этого рецептора72. Сходные находки были описаны более 25 тому назад Saluz et al.73, которые продемонстрировали деметилирование перекрывающихся сайтов связывания для oestradiol и glucocorticoid рецептора у петухов, на которых воздействовали эстрадиолом. Кроме того, 5-hydroxymethylcytosine и TET белки могут быть обнаружены в этих элементах74-78. Однако, взаимоотношение между метилированием CpG и связыванием транскрипционного фактора довольно сложное (see below), и следует пройти ещё длинный путь, чтобы понять механизмы, с помощью которых метилирование бедных CpG энхансеров участвует в регуляции этих регионов.
Methylation at insulators. Инсуляторы могут быть определены как элементы, которые блокируют взаимодействия между энхансером и промотором. Наиболее хорошо изученными примерами являются последовательности ДНК, связываемые с помощью белка CTCF, который соединяется с мотивом отчасти с гетерогенной последовательностью. Хорошо изученным случаем является связывание CFCF с сайтом внутри импринтированного IGF2-H19 локуса, в котором присутствие или отсутствие связывания CTCF контролирует взаимодействия энхансер-промотор. Было показано, что метилирование сайта связывания CTCF в этом локусе блокирует связывание CTCF, так что метилирование ДНК играет важную роль в контроле этого локуса79. Более недавнее исследование сходным образом показало, что связывание CTCF с экзоном 5 гена, кодирующего CD45, ингибируется метилированием ДНК, приводя к эффектам сплайсинга68. Однако, глобальное исследование мышиных ESCs и дифференцированных клеток подтвердило, что связывание CTCF внутри бедных CpG регионах в целон не зависит от статуса метилирования сайтов связывания, но скорее всего связывание само по себе инициирует локальное деметилирование70. Следовательно, возможно, что отсутствует универсальное правило для этих эффектов метилирования по CTCF сайтам (которые обнаруживают тенденцию быть дегенеративными) и связывания? В этой связи важно отметить, что имеется семь потенциальных сайтов связывания CTCF в промоторе H19 человека и только один из них обнаруживает дифференциальное parent-of-origin метилирование80.

Possible mechanisms


Механизмы, с помощью которых неактивные CGI промотора удерживаются стабильно в репрессированном состоянии за счет метилирования ДНК изучен довольно подробно7. Метилированный промотор имеет нуклеосомы в TSS81, которые несут репрессивную метку H3K9me3 и которые стабилизированы с помощью белков, соединяющихся с метилированной ДНК, которые в свою очередь рекрутируют гистоновую деацетилазу в этот регион82. Вопрос о причинной связи изменений, связанных с метилированием, с состоянием экспрессии неактивного гена из non-CGI промоторов является предметом существенных противоречий м вопрос пока не решен адекватно. Поскольку транскрипционные факторы могут строго соединяться с метилированными последовательностями ДНК, приводя в результате к пассивному

Box 3 | DNA methylation and disease Methylation of cytosine strongly increases the rate of C>T transition mutations and is thought to be responsible for about one-third of all disease-causing mutations in the germline91. In somatic cells, gene body methylation is a major cause of cancer gene mutations in tumour suppressor genes, such as TP53, which encodes p53 (REF. 53). The transcriptional start sites of many genes encoding tumour suppressors, such as retinoblastoma-associated protein 1 (RB1), MLH1, p16 and BRCA1, among others, lie within CGIs. Factors that reduce expression of these genes increase the likelihood of de novo methylation and irreversible silencing. These gene promoters have been found to be extensively methylated in a large number of tumours, such as retinoblastoma, colon, lung and ovarian cancers51,92,93. The methylation changes are present in tumours before they are placed into culture but become enhanced during passaging in vitro94. In general, the tumour genome is hypomethylated, yet the potential role of methylation of CpG-poor promoters, enhancers, insulators, repetitive elements and gene bodies in cancer is almost completely unknown. The relevance of DNA methylation to human cancer has become even more evident with the identification of mutations in NMT3A95 and isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and IDH2 in leukaemias96. Several diseases, such as fragile X syndrome97 and immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies syndrome98, also have a demonstrable link to DNA methylation. The new discoveries discussed in this Review are stimulating efforts to assess the contribution of DNA methylation to cancer and other human diseases.


деметилированию этих регионов83, однако не всегда ясно являются ли изменения, связанные с метилированием, результатом транскрипции или они стабилизируют транскрипционно некомпетентные состояния. Метилирование non-CGI регионов может оказывать непосредственное влияние на связывание транскрипционных факторов с сайтами мишенями. В самом деле, известно с некоторых пор, что связывание MYC с соотв. последовательностью непосредственно ингибируется за счет присутствия 5mC84, тогда как связывание SP1 не обнаруживает подобной взаимосвязи85. Однако, метилирование сайтов связывания транскрипционных факторов - напр., в laminin beta 3 (LAMB3), runt-related transcription factor 2 (RUNX2)34 или Oct4 (REF. 86) промоторах - может снижать экспрессию генов в экспериментах с трансфекцией.
Сравнительно недавно геномные исследования подтвердили, что связывание транскрипционного фактора может испытывать строгое влияние со стороны метилирования CpG сайтов внутри их распознающей последовательности87. Эти эксперименты подчеркивают взаимоотношение причина-следствие между метилированием CpG в TSS и репрессией гена, но всё ещё существуют вопросы относительно возможных механизмов. Напр., неожиданным наблюдением стала находка нами, что ESCs человека почти всегда не содержат OCT4, связанного с сайтом мишенью для OCT4, когда имеет место метилирование ДНК внутри 100 пн на каждой из сторон последовательности мишени45. Поскольку последовательность распознавания OCT4 не содержит CpG последовательности, то трудно постулировать механизм, который мог бы объяснить эту строгую корреляцию между метилированием CpG вблизи сайта и отсутствием связывания. Тем не менее, тот факт, что метилирование CpG сайтов, фланкирующих сайт связывания OCT4, является прирожденно более вариабельным, чем в CGIs, соседние области д. быть более плодотворны для исследований в будущем и были в основном пропущены вплоть до сегодня.

Conclusions


Whole-genome approaches have given us a detailed view of the methylome and have shown that methylation patterns beyond TSSs are far more dynamic than was previously appreciated. Now that we have these global patterns, we need to resolve their potential roles and mechanisms — methylated sites beyond TSSs clearly are not simply ‘passengers’ as had been previously assumed (FIG. 1). Compared to CGIs at TSSs, which are gener- ally unmethylated and seem mostly to be methylated to ensure long-term silencing, the patterns of modification in the CpG-depleted regions of the genome are more interesting. Although we clearly do not understand the detailed mechanisms by which methylation of enhanc- ers, insulators and gene bodies influence the binding and function of regulatory proteins, there seems to be little doubt that this is crucial to development, differentia- tion and indeed cellular viability. However, some species are able to survive without methylation, yet mammals require three DNMTs; finding out why this is the case will help to explain its function. The identification of the TET genes and the localization of the TET proteins to regulatory regions is highly suggestive of a dynamic turnover of 5mC, which is consistent with it having a control function in gene expression.
The potential involvement of methylation beyond CGI promoters in human disease has been largely overlooked because of the focus on abnormal CGI methylation in cancer. Future work that aims to pro- vide detailed maps of epigenomes in normal and dis- eased states is crucial to our understanding of many human diseases (BOX 3). This will be essential if we are to develop strategies and drugs to target the epigenome and to treat these diseases88.
Сайт создан в системе uCoz