Описывается идентификация трех миРНК, которые экспрессируются в ответ на дифференцировку ECs из плюрипотентных стволовых клеток. Мы описали, что преобразование миРНК с помощью Dicer необходимо для эндотелиальной дифференцировки, доказав, что нокдаун Dicer существенно снижает дифференцировку hESC в EC. Мы анализировали ранние стадии детерминации клона EC и транскриптом миРНК, чтобы идентифицировать, что miR-99b, -181a и -181b специфически активируются во время дифференцировки. Более того, мы описали, что увеличение миРНК с помощью переноса генов может потенциировать способность эндотелиальной дифференцировки в hESC линии, которая обычно вызывает относительно бедную дифференцировку в ECs. Наконец, мы продемонстрировали, что трансплантация hESC-ECs, избыточно экспрессирующих или miR-99b или -181b в мышцы иммунодефицитных мышей, подверженных ишемии задних конечностей, способствовало неоваскуляризации и восстановлению кровотока.

В отношении дифференцировки in vitro из плюрипотентных стволовых клеток, роль миРНК была установлена в исследованиях с использованием Dicer- или Drosha-дефицитных мышиных ESCs. Dicer- или Drosha-дефицитные ESCs были неспособны генерировать зрелые миРНК, это впоследствии мешало дифференцировке [23, 42, 43]; однако это ещё не было описано для hESCs. Здесь мы впервые продемонстрировали, что LV-обусловленный нокдаун Dicer устраняет потенциал плюрипотентных hESCs дифференцироваться в клон EC (Fig. 2), подчеркнув, что канонический биогенез зрелых миРНК скорее всего необходим для успешной эндотелиальной дифференцировки. Мы также установили, что нокдаун Dicer супрессирует продукцию NO в hESC, направляющую в EC клон (Fig. 3). Это согласуется с нашими предыдущими данными, показавшими специфичное для дифференцировки увеличение экспрессии EC маркерного гена, конкордантно с функциональным EC фенотипом in vitro и in vivo и способностью продуцировать и отвечать на NO стимулятор [11]. Недавние дополнительные исследования показали, что устранение Dicer способно предупредить дифференцировку ES в направлении др. клонов [44-48]. Мы сфокусировались на дифференцировке hES-EC, но очень возможно, что супрессия Dicer будет нарушать дифференцировку плюрипотентных клеток человека подобно мышиным ESCs.

Мы полагаем, что клон-специфические миРНК д. подвергаться преобразованию и вносить вклад в основную регуляцию самых ранних стадий спецификации и детерминации клонов. Ранее мы продемонстрировали, что экспрессия ассоциированных с ангиогенезом зрелых миРНК (miR-126, -130a, -133a, -133b и -210) присутствует в 10-дневных уже дифференцированных функциональных hES-ECs [11]. Помня это мы попытались идентифицировать миРНК, экспрессируемые на более ранних стадиях детерминации клонов в EC. Мы дифференцировали hESCs в направлении клона EC, используя наш ранее описанный безсывороточный протокол [11]. Этот протокол обходит необходимое образование эмбриоидных тел при этом клетки дифференцируются униформно, тем самым предоставляется уникальная возможность анализа миРНК компонента на ранней стадии детерминации клона без необходимости истощять клетки от др. зародышевых клонов. По сравнению с предыдущими исследованиями мы идентифицировали экспрессию ассоциированных с плюрипотентностью кластеров миРНК 302 и 372/373 , присутствующих в наших плюрипотентных образцах hESC [12, 13]. Мы также выяви ли существенную потерю ассоциированных с дифференцировкой miR-302a-d, -372 и -373 в согласии с предыдущими исследованиями [12, 13]. Мы идентифицировали и оценили экспрессию miR-99b, -181a и -181b на ранних стадиях дифференцировки EC из трех плюрипотентных линий hESC. miR-99b является межгеной миРНК и транскрибируется в кластере с miR-125a и Let7e. Это согласуется с нашими предыдущими находками, что члены семейства Let7 индуцируются после направленной дифференцировки в ECs [11]. Более того, мы также идентифицировали miR-125a-5p как экспрессируемую на высоком уровне на ранней стадии спецификации клона EC lineage (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token = vtsdd sqskeiwcvc&acc=GSE33675). miR-181a и -181b, как полагают, экспрессируются с двух геномных шпилечных локусов, miR-181a/b-1 и -181a/b-2 (www.mirbase.org). Зрелые последовательности идентичны независимо от расщепления с помощью Dicer из pre-miR-181a/b-1 или -2. Микро РНК miR-181a и -181b обе являются внутригенными, но гены, в которых они находятся, обладают пока неизвестной функцией. Затем мы подтвердили экспрессию miR-99b, -181a, и -181b во взрослых SVECs человека, с отсутствием заметных различий, наблюдаемых в уровнях экспрессии зрелой miR-99b во взрослых ECs и в SA461 hES-ECs , дифференцированных на 10-й день (Supporting Information Fig. S3A). Мы наблюдали достоверно меньше miR-181a и -181b между 10-дневными дифференцированными hES-ECs и взрослыми SVECs, хотя уровни на 10-й день легко определялись с помощью Northern blot анализа (Supporting Information Fig. S3A). Идентификация miR-99b [49], -181a [50] и -181b [19] согласуется с предыдущими данными профилирования miR , осуществленными в ECs, но к нашему сведению ни одна не была ассоциирована с дифференцировкой из плюрипотентности к эндотелиальному клону. miR-181b была также ранее идентифицирована как экспрессируемая в CD34⁺ клетках во время гематопоэтической дифференцировки из плюрипотентных клеток [51]. CD34 экспрессируется в мезодерме и в ранних ECs [52], предоставляя дальнешие доказательства роли miR-181b в детерминации ранних стадий и дифференцировке в EC. Кроме того, мы продемонстрировали, что имеется очень низкая экспрессия miR-99b, -181a и -181b в клетках, которые дифференцировались в направлении нейрального (эктопического) или гематопоэтического (мезодермального) клонов; однако, они наиболее значительно усиливались в клетках, направляющихся в сторону EC клона (Fig. 4). Итак. остается возможность, что miR-99b, -181a и -181b экспрессируются также в определенной степени в клетках мезодермального происхождения, напр., гематопоэтических клетках, благодаря общему предшественнику, который развивается в HSC и EC [53]. Однако, это подчеркивает, что до некоторой степени miR-99b, -181a и -181b могут действовать. чтобы способствовать клеточному циклу и характерной прогрессии дифференцировки из плюрипотентного состояния, как это отмечалось для miR-195 и -372 [54].

Мы предполагаем определить, может ли модуляция miR-99b, -181a или -181b оказывать какое-либо влияние на способность к дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в направлении клона EC. Избыточная экспрессия pre-miR последовательности для miR-99b, -181a и -181b вызывает достоверное увеличение зрелых miR-99b, -181a и -181b, соотв., тем самым демонстрируя эффективный процессинг pre-миРНК (Supporting Information Fig. S4). Увеличение miR-99b и -181a способно существенно увеличивать сосудистые EC маркерные гены, Pecam1 и VE Cadherin, на уровне транскрипции в обоих линиях hESC (Fig. 6). Не выявлено дополнительных преимуществ, наблюдаемых при избыточной экспрессии всех трех миРНК в комбинации. Более того, мы сообщаем, что после анализа популяции клеток, экспрессирующих оба белка, и способности продуцировать NO, мы отметили, что наблюдается повышенная реакция на избыточную экспрессию миРНК для всех трех миРНК, включая miR-181b, которая не вызывает достоверной реакции на уровне мРНКl, в H1 hESC линии, если сравнивать с SA461 клетками (Fig. 5). Это обнадеживает, т.к. мы наблюдали также существенное отличие в базовой линии эффективности hESC линий в приобретаемый эндотелиальный фенотип (экспрессия одного или обоих маркеров), с H1 клетками, оказывающимися более непокорными. чем SA461 клетки, когда проходят через наш протокол дифференцировки EC (Fig. 5), в соответствии с предыдущим исследованием, проверявшим гетерогенность дифференцировки между линиями [55]. Мы подтверждаем. что экспрессия только одного маркера не дает убедительной демонстрации EC клона, но это может сказываться на пропорции клеток, которые всё ещё дифференцируются, чтобы стать терминально дифференцированными, bona fide EC. В самом деле в нашей предыдущей работе [11], мы сообщали, что % клеток SA461, экспрессирующих оба маркера, возрастает с 14 дня до 21 дня дифференцировки, это согласуется с данными, полученными в данной работе. Более того, остается возможным, что мы неспособны улучшить эффективность дифференцировки SA461 hES из-за высокого базового уровня дифференцировки EC (что определяется по клеткам, экспрессирующим один или более EC маркеров и значениям MFI), тогда как относительно H1 клеток остается потенциал усиления дифференцировки, в этом случае за счет модуляции экспрессии миРНК . Следовательно, вполне возможно, что существует способность к окончательной дифференцировке EC независимо от фона hES. Поэтому мы полагаем, что линии плюрипотентных стволовых клеток, которые более устойчивы к протоколу дифференцировки, могут получать преимущества от модуляции миРНК, чтобы усиливать эффективность дифференцировки, но для этого необходим анализ др. линий для подтверждения. Кроме того, мы наблюдали достоверное улучшение терапевтического ангиогенеза у модельных мышей с периферической ишемией после трансплантации hESC-ECs, дифференцировавшихся в течение 14 дней, которые избыточно экспрессировали или miR-99b или -181b, но, что интересно, не miR-181a (Fig. 7). Это обусловленное миРНК усиление эффективности неоангиогенеза может быть комбинацией прямого клеточного эффекта трансплантированных клеток и miR-обеспечиваемых проангиогенных паракринных механизмов. Эти результаты показывают, что избыточная экспрессия каждой из индивидуальных миРНК способна усиливать сосудистый эндотелиальный фенотип, но но не все они вызывают достоверную реакцию на уровне транскрипта, белка и функции, указывая тем самым, что их способ действия в EC биологии чрезвычайно сложен. Исследования нокдауна также неспособны выявить роль miR-99b, -181a и -181b, при достоверном снижении, наблюдаемом в отношении сосудистых эндотелиальных маркеров на уровне транскриптов и снижении продукции NO , но при этом отсутствует эффект на клеточной популяции, экспрессирующей эндотелиальные маркерные белки (Supporting Information Fig. S5).

Предыдущие исследования не предоставили доказательств, что одиночная миРНК, обладает кардинальной ролью в выборе судьбы EC, несмотря на демонстрацию дифференциально экспрессируемых миРНК во время эндотелиальной дифференцировки in vitro [24, 25]. Мы полагаем, что спецификация клеток во время более поздних стадий развития может контролироваться с помощью миРНК. Напр., miR-126 не нужна для эндотелиальной дифференцировки [27], , как было установлено, ингибирует эритропоэз в CD34⁺ клетках. сохраняя потенциал развития в направлении или EC клона или клона гематопоэтических клеток [51], указывая, что миРНК могут негативно регулировать дальнейшую спецификацию клона. Это также было недавно продемонстрировано на ECs, при этом miR-181a непосредственно воздействует на Prox1, ключевой регулятор характеристик лимфатических EC, [56, 57], а избыточная экспрессия miR-181a направляет развитие лимфатических ECs в направлении фенотипа кровеносных сосудов [50].

Это согласуется с данными , представленными здесь, что нокдаун miR-181a индуцирует экспрессию Prox1, а избыточная экспрессия усиливает экспрессию генов, специфичных для артерий, EphrinB1, EphrinB2, Jagged2 и Hey2 [58], а ингибирует экспрессию Prox1 [56] (Fig. 6). Это увеличение экспрессии артериальных генов вообще-то неожиданно, принимая во внимание, что мы не наблюдали достоверного улучшения терапевтического ангиогенеза при избыточной экспрессии miR-181a в hES-ECs. Стратегии избыточной экспрессии и нокдауна для miR-99b и -181b не способны определить подобный паттерн; однако, вполне возможно, что эти miRs могут принимать болешее участие в функции hES-ECs. Мы наблюдали улучшение в hES-EC в отношении продукции NO в более поздние временные точки дифференцировки при избыточной экспрессии miR-99b и-181b, чем -181a (Fig. 5). Это может в свою очередь выявить более мощную реакцию in vivo, в принципе объясняющую значительное улучшение неоангиогенеза. Равным образом остается возможность, что экспрессия этих миРНК увеличивается как следствие эндотелиальной дифференцировки, и что их роль в клеточной спецификации остаетя полностью объясненной. Чтобы понять функциональную роль этих или любой из впоследствии идентифицированных миРНК в детерминации эндотелиальной судьбы, необходимо идентифицировать и оценить гены мишени, участвующие в онтогенетической спецификации. Имеется несколько предполагаемых мишеней для миРНК miR-99b, -181a и -181b; однако, большинство из этих мишеней экспериментально не оценены. Наше исследование не предназначено для идентификации мишеней для miR-99b, -181a и -181b , поскольку большинство из предсказываемых мишеней не экспрессируется в плюрипотентных, мезодермальных или ECs клетках и их предшественниках. Возможно, что повышенная экспрессия этих и др. миРНК служит ингибированию индукции генов, которые могут облегчать развитие или дифференцировку в альтернативные зародышевые слои или мезодермальные клоны клеток.