Как регуляция генов предопределяет судьбу, самообновление и дифференцировку стволовых клеток это центральный вопрос биологии стволовых клеток. В отношении этого вопроса проделано множество усилий, посвященных передаче сигналов в нишах, эпигенетической и транскрипционной регуляции активности генов в стволовых клетках. В противоположность генной регуляции на посттранскрипционном уровне, трансляционная и посттрансляционная регуляция, остаются в основном не исследованными. Начинает выявляться ключевая регуляторная роль микроРНК (miRNAs) в контроле функции стволовых клеток и развитии животных путем сети модулирования регуляции генов. miRNA, впервые открытые у Caenorhabditis elegans, являются семейством малых некодирующих РНК, существующих у разных организмов, которые связываются с 3' untranslated region (3' UTR) мРНК посредством неполностью комплементарных последовательностей, чтобы регулировать их трансляцию и стабильность.^1-3 В геноме человека гены miRNA составляют приблизительно 4% от генов и регулируют экспрессию более чем трети белок-кодирующих генов специфическим для мишени способом на посттранскрипционном уровне.⁴

THE BIOGENESIS AND REGULATORY MECHANISM OF miRNAs

miRNAs продуцируются в несколько ступеней в ядерном и цитоплазматическом компартментах. В каноническом пути биогенеза miRNA (Figure 1, left panel), первичные miRNA транскрипты (pri-miRNAs) генерируются с помощью RNA polymerase II и затем разрезаются на приблизительно в 70-нуклеотидов предшественники-miRNAs (pre-miRNAs) в ядре с помощью микропроцессорного комплекса, состоящие из RNAse III энзима. наз. Drosha и dsRNA связывающего белка DiGeorge syndrome Critical Region Gene 8 (DGCR8).^5,6 Pre-miRNAs затем переносятся с помощью Exportin 5 в цитоплазму, где они далее разрезаются др. RNAse III энзимом, наз. Dicer по сайту на 22nt от места разреза Drosha в зрелый miRNA дуплекс.^5,7 Dicer находится в комплексе, который состоит из dsRNA связывающего белка (transactivating region binding protein) TRBP, PACT (protein activator of PRK) и Loquious (Loqs). Этот комплекс далее разделяет две нити РНК из miRNA/miRNA* дуплекса, инкорпорирует одну нить РНК (miRNA) в Ago и высвобождает др. нить (miRNA*), которая обычно становится предметом деградации.^8-10 miRNA-содержащий Ago затем собирается в miRNA-induced silencing complex (miRISC), который распознает мРНК мишень посредством неполной комплементарности последовательностей между miRNA и мРНК мишенью. Нуклеотиды 2-8 в miRNAs являются критическими для распознавания мишени посредством совершенной комплементарности с мишенью и они наз., 'seed motif'.^11,12 Одиночная miRNA может распознавать множественные мишени, регулируя позитивно несколько сотен разного вида мРНК. Кроме того, множественные miRNAs могут действовать одновременно на одну и ту же мРНК мишень. Такой комбинационный способ действия позволяет нескольким сотням miRNAs модулировать экспрессию тысяч видов мРНК на посттрансляционном уровне. Такая регуляция очевидно достигается благодаря снижению эффективности трансляции и/или снижению стабильности мРНК.¹³ недавно, Bartel с сотр. установили, что понижение уровней мРНК обеспечивает большую часть (~80%) снижения продукции белков.¹⁴ Figure 1. Three different pathways of microRNA (miRNA) biogenesis: the canonical pathway (left panel), the microprocessor-independent pathway (middle panel), and the Dicer-independent pathways (right panel) (for details, see text).

Помимо канонического пути имеются независимые от микропроцессора и Dicer пути (Figure 1, middle panel). В независимом от микропроцессора пути (Figure 1, middle panel), функция разрезания с помощью Drosha замещается тремя разными механизмами (1) с помощью spliceosome для пути mirtron; (2) с помощью Dicer для snoRNA-, tRNA и shRNA-производных предшественников; и (3) с помощью tRNase Z для tRNA-производного пути.^15-20 недавно, Dicer-независимые miRNAs были открыты у рыбок данио и млекопитающих.^21,22 В этом пути (Figure 1, right panel), активность по разрезанию РНК Ago2 обеспечивает созревание pre-miR-451. miR-451 является уникальной тем. что её 5'-конец определяется рассечением с помощью Drosha, тогда как её 3'-конец гибкий и простирается за пределы области петли шпильки с длиной в пределах 20-30 нуклеотидов. Более того, 1-5 нематричные уридиновые остатки были также обнаружены на 3'-конце более длинных считываемых последовательностей (reads), указывая что продукты расщепления с помощью Ago2 подвергаются uridylation и затем состригаются с помощью нуклеазы. Эти альтернативные пути иллюстрируют способность клеток использовать широкие вариации механизмов, чтобы генерировать miRNAs и чтобы осуществлять регуляцию генов (Table 1). Table 1. List of microRNAs involved in стволовых клеток regulation Germ Layer Process miRNA Regulatory Mechanism ESC ESC maintenance and differentiation miR-145 Represses c-Myc, Sox2, Oct4, and Klf431,32 miR-134, miR-296, and miR-470 Regulate Oct4, Sox2, and Nanog33–35 miR-200c, miR-203, and miR-183 Regulate Sox2 and Klf433–35 miR-195 Represses WEE1, an inhibitory kinase in G2-to-M transition that blocks the G2 cyclin B-Cdk complex42 miR-290 and miR-302 Suppress cyclin E-Cdk2 upstream inhibitors in mESCs, therefore enabling the unrestricted G1-to-S transition and short cell cycle36,40 miR-290 family miRNAs Suppresses Rbl2, a transcriptional repressor of Dnmts40,43 iPS generation miR-302 Regulates Dnmt and enhance iPS generation49 miR-302b and miR-372 Promote reprogramming of human fibroblast to iPS50 Germline Germline development bantam miRNA Represses primordial germ cell differentiation and regulates germline стволовых клеток as an extrinsic factor56–58 miR-7 and miR-278 Target dacapo, a cyclin-dependent kinase inhibitor and control G1/S transition59–61 Ectoderm Neurogenesis miR-9a Inhibits excess sensory organ precursors production by targeting Sens in Drosophila63,64 miR-124a Promotes dendritic branching through unknown targets in Drosophila65 miR-9 Promotes the neuronal differentiation and suppresses neuronal стволовых клеток self-renewal by repressing TLX and is subjective to TLX transcriptional regulation68 miR-9 Inhibits the astrocytic fate69 miR-9* and miR-124 Promotes direct conversion of human fibroblasts to neuron, through BAF70 Mesoderm Hematopoiesis miR-155, miR-24a, and miR-17 Inhibit multipotent progenitor differentiation into myeloid lineage73 miR-150 Inhibits pro-B to pre-B transition74 miR-223 Targets transcription factors NFI-A and C/EBPa and controls granulocytic differentiation75 miR-155 Controls T cell and B cell differentiation and regulates B cell polyclonal expansion76 Osteogenesis miR-125b Inhibits BMP4-mediated mesenchymal стволовых клеток differentiation to osteoblasts in mice79 miR-141 and miR-200a Suppress preosteoblast differentiation through targeting transcription factor Dlx580 miR-2861 Stimulates BMP2-induced osteoblast differentiation by maintaining the expression level of Runx281 Chondrogenesis miR-199a* Inhibits early stage of chondrogenesis and production of cartilage oligomeric matrix protein and collagen by inhibiting Smad1 posttranscriptionally82 Skeletal muscle development miR-1 and miR-26a Stimulates skeletal muscle through targeting epigenetic factors, Hdac4 and Ezh283–85 Smooth muscle cells development miR-145 Promotes neural crest стволовых клеток differentiation into smooth muscle cells, through targeting transcription factors Klf4, myocardin, and Elk186

THE ROLE OF miRNAs IN PLURIPOTENT STEM CELLS

ESCs происходят из inner cell mass (ICM) эмбрионов млекопитающих на стадии бластоциста. Они обладают двумя уникальными свойствами: способностью дифференцироваться в любые типы клеток плода и взрослых (плюрипотентность) и способностью реплицироваться в течение многих поколений (самообновление). Эти свойства являются устойчивыми за счет деликатных регуляторных механизмов, включая передачу внеклеточных сигналов, эпигенетическое программирование и эпигенетическую регуляцию. Состояние хроматина в ESC в основном открытое, следовательно, оно доступно для транскрипционной активации, тогда как специфические эпигенетические регуляторы контролируют состояние хроматина локально, чтобы блокировать активацию генов. специфичных для дифференцировки. В этом контексте хроматина, ESC основные транскрипционные факторы (Oct4, Sox2, Nanog, etc.) вместе с разнообразными сигнальными путями управляют плюрипотентностью ESC.^23,24 Кроме того, молекулярная программа, лежащая в основе плюрипотентности и самообновления ESC всё более оказывается связанной с miRNAs.

miRNA Expression in ESCs

Профиль экспрессии miRNA отличается в ESC, большинство микроРНК, концентрирующихся в ESC обладают общей 5'-проксимальной AAGUGC сигнатурой.^19,25-28 У человека miR-371 (гомолог семейству miR-290) и miR-302 семейства представляют собой большую часть ESC-специфичных miRNAs. Кроме того, эти miRNAs обнаруживают тенденцию транскрибироваться совместно в виде полицистронных транскриптов и обладают общей вышестоящей транскрипционной регуляцией с помощью набора основных транскрипционных факторов стволовых клеток.²⁹ Уровни этих miRNAs снижаются. когда ESCs дифференцируются, это указывает на снижение их функции в дифференцированных клетках.³⁰

Заинтригованные различающимися паттернами экспрессии, исследователи изучали роль miRNAs в регуляции самообновления и дифференцировки ESC. Эти исследования выявили следующие три механизма miRNAs в становлении и поддержании стволовости ESC (Figure 2), в то же время в управлении дифференцировкой ESC в разные клоны. Figure 2. Three different mechanisms through which microRNAs (miRNAs) regulate the proliferation, self-renewal, and differentiation of embryonic стволовых клеток (ESCs) (for details, see text).

miRNAs Regulate the Expression of Core Transcriptional Factors of ESCs

ESCs чтобы дифференцироваться соответственно, miRNAs д. супрессировать экспрессию основных транскрипционных факторов ESC (Figure 2, left branch). Напр., miR-145 репрессирует c-Myc, Sox2, Oct4 и Klf4.^31,32 В мышиных ESCs (mESCs), Oct4, Sox2 и Nanog регулируются с помощью miR-134, miR-296 и miR-470, тогда как Sox2 и Klf4 кооперативно модулируются с помощью miR-200c, miR-203 и miR-183.^33-35 Общей темой для miRNAs и транскрипционного аппарата плюрипотентности ESC является двойная негативная петля. С одной стороны, упомянутые выше miRNAs репрессируют экспрессию транскрипционных факторов плюрипотентности на посттранскрипционном уровне. С др. стороны, транскрипционные факторы плюрипотентности в ответ вызывают молчание промоторных регионов этих miRNAs посредством совместной оккупации белками группы Polycomb и в результате H3K27me3.²⁹

miRNAs Regulate the ESC Cell Cycle

ESCs обладают значительно более коротким клеточным циклом. Напр., клеточный цикл mESCs составляет 12 ч вместо приблизительно 24 ч в соматических клетках. Ключом к пониманию такого типа короткого клеточного цикла является укороченная G1 фаза, при которой G1-S переход не встречает препятствий благодаря постоянно активному комплексу cyclin E-Cdk2.³⁶ Глобальное истощение miRNAs в Dgcr8 и Dicer1 мутантных mESCs вызывает дефекты пролиферации.^37-39 В частности, DGCR8-дефицитные mESCs обнаруживают накопление клеток, арестованных в G1 фазе, указывая на функцию miRNAs в обеспечении постоянной активации комплекса cyclin E-Cdk2, тем самым способствуя G1--S переходу. Эта активация комплекса cyclin E-Cdk2 с помощью miRNAs интенсивно исследовалась, это выявило, что miR-290 и miR-302 супрессируют стоящие выше ингибиторы cyclin E-Cdk2 комплекса [включая Cdkn1a, retinoblastoma-like 2 protein (Rbl2 и Lats2] в mESCs, тем самым делая возможным неограниченный G1--S переход и короткий клеточный цикл^36,40 (Figure 2, middle branch).

Такая функция в регуляции клеточного цикла законсервирована также в hESCs, где супрессированы checkpoint гены G1--S перехода Cdkn1a и Cdkn1c с помощью miR-372 и miR-92a, соотв.^41,42 miR-372 принадлежит к семейству miR-371, которое гомологично мышиному семейству miR-290, указывая. что такая супрессия checkpoint клеточного цикла высоко консервативна. Более того, G2--M переход регулируется с помощью miRNAs также. miR-195 репрессирует WEE1, ингибиторную киназу G2--M перехода, которая блокирует G2 cyclin B-Cdk комплекс.⁴²

Один из интересных способов действия это конвергенция многих miRNAs на одном пути. Примечательно. что miR-290 и miR-302 обладают одним и тем же мотивом распознавания мишени.³⁶ Такой общий мотив позволяет множественным miRNAs влиять на множественные стоящие выше ингибиторы cyclin E-Cdk2 комплекса, способствуя тем самым ходу митоза в обход checkpoint G1--S перехода.

miRNAs Control Epigenetic Programming in ESCs

ESCs относительно открытым хроматином, возможно в качестве уникального свойства. лежащего в основе их плюрипотентности и самообновления. Во врея дифференцировки определенные регионы на хроматине подвергаются de novo метилированию ДНК и обеспечивают собственно дифференцировку. У Dicer-нулевых ESCs с глобальным истощением miRNA, уровни метилтрансфераз ДНК снижены, это ставит под угрозу метилирование ДНК de novo. Это указывает на то, что функция miRNA заключается в эпигенетической регуляции (Figure 2, right branch).^40,43 Так, Oct4 замалчивается неполностью и обратимо из-за дефектов метилированиия ДНК. Такое нарушение молчания Oct4 может прекрасно объяснить неспособность к дифференцировке Dicer-нулевых ESCs. Трансфекция miR-290 семейством показала частичное восстановление метилирования ДНК за счет восстановления уровней Dnmt3a и Dnmt3b, но не Dnmt1. Такое восстановление, обеспечиваемое с помощью семейства miR-290 за счет miRNAs, супрессирующих свои непосредственные мишени, Rbl2, транскрипционный репрессор Dnmts. В частности, после трансфекции кластера miR-290 , восстанавливается метилирование промотора Oct4.^40,43 Одним из наименее изученных вопросов это могут ли miRNAs также влиять на форму гистонового кода, чтобы регулировать самообновление и дифференцировку ESC.

miRNAs Control the Generation of iPS Cells

Группа Yamanaka's установила, что фибробласты могут быть репрограммированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) путем экспрессии Sox2, Oct4, Klf4 и c-Myc.⁴⁴ Комбинация Sox2, Oct4, Lin28 и Nanog также вызывала репрограммирование в iPSC.⁴⁵ Поскольку мы получаем всё больше и больше информации о механизмах, лежащих в основе соматического репрограммирования, роль miRNAs в регуляции этого процесса начинает исследоваться. miRNAs регулируют соматическое репрограммирование на двух разных уровнях, клеточной пролиферации и эпигенетическом репрограммировании. На уровне клеточной пролиферации специфичные для клеточного цикла ESC miRNAs miR-291-3p, miR-294 и miR-295 могут замещать c-Myc , чтобы облегчить Sox2-, Oct4- и Klf4-индуцированное соматическое репрограммирование со сходной эффективностью.⁴⁶ Учитывая тот факт, что эти miRNAs находятся под контролем c-myc и др. репрограммирующих транскрипционных факторов и эти miRNAs не только способны к дальнейшему усилению эффективности соматического репрограммирования в присутствии c-myc, скорее всего. что эти miRNAs являются нижестоящими эффекторами c-myc-обеспечиваемого пути клеточной пролиферации.^13,29

Помимо замещения c-Myc, miRNAs могут способствовать репрограммированию посредством эпигенетической регуляции. Уже известно, что пониженная активность Dnmt ведет к повышению эффективности генерации iPS.^47,48 miR-302, обильно экспрессируется в ESCs, как недавно было показано, чтобы регулировать Dnmt и усиливать генерацию iPS.⁴⁹ В клетках волосяных фолликулов избыточная экспрессия miR-302 до уровней. сравнимых с таковыми в hESCs ведет к супрессии AOF2, стабилизатора для Dnmt1. Следовательно, индуцированная экспрессия miR-302 способствует глобальному деметилированию ДНК и в свою очередь способствует генерации iPS. В соответствии с этим, miR-302b и miR-372, как было установлено, способствуют репрограммированию фибробластов человека в iPS, благодаря воздействию на множественные мишени и регуляции клеточного цикла, эпителиально-мезенхимному переходу, эпигенетической регуляции и везикулярному транспорту.⁵⁰ Кроме того, как обсуждалось ранее miR-290 семейство супрессирует репрессор Dnmt, способствуя тем самым активности Dnmt. Поэтому интересно бы проверить, смогут ли antagomirs к miR-290 семейству усиливать эффективность соматического репрограммирования.

THE ROLE OF miRNAs IN TISSUE STEM CELLS

Стволовые клетки располагаются в разного типа взрослых тканей и являются самообновляющимися клетками предшественниками, отвечающими за установление и/или поддержание ткани хозяина. Современные исследования miRNAs выявили их роль в эктодермальных и мезодермальных тканях. Здесь мы используем систему зародышевых стволовых клеток (GSC) , чтобы проиллюстрировать регуляцию с помощью miRNA ткани стволовых клеток у Drosophila и C. elegans, поскольку зародышевая линия представляет наиболее изученные miRNAs в стволовых клетках в модельной системе низших. Затем мы рассмотрим одну эктодермальную ткань (нервную систему) млекопитающих и тири мезодермальные ткани (кровь. мышцы и кость) млекопитающих , в которых роль miRNAs хорошо известна.

miRNAs Regulate Germline Development

Гаметогенез чрезвычайно активный процесс, управляемый с помощью GSCs в гонадах, за исключением оогенеза у млекопитающих. В настоящее время мало известно о роли miRNAs в зародышевой линии C. elegans и млекопитающих . Однако, оварии Drosophila представляют мощную платформу для выяснения роли miRNA в регуляции GSCs. Во время оогенеза Drosophila, GSC располагаются на переднем кончике оварий в непосредственном контакте со своими клетками ниш, наз. cap клетками и делятся асимметрично, чтобы давать дочернюю GSC и дифференцирующуюся клетку, наз. cystoblast. Дочерняя GSC остается прикрепленной к cap клеткам. тогда как цистобласт подвергается дальнейшей оогенной дифференцировке.⁵¹ Как было установлено, miRNA играет роль в регуляции делений и поддержании GSC , при этом была показана важность для оогенеза дрозофилы Loquacious, Dicer-1 и Ago-1.^52-55 Точнее сказать, bantam miRNA, как было установлено, существенна для поддержания GSC, где bantam репрессирует дифференцировку примордиальных зародышевых клеток и регулирует GSCs в качестве внешнего фактора.^56-58 Кроме того, miR-7 и miR-278, как было установлено, регулируют клеточный цикл GSCs. Истощение miR-278 заставляет GSCs делиться медленнее, тогда как истощение miR-7 ведет к аномальной прогрессии клеточного цикла. Эти две microRNAs нацелены на 3' UTR dacapo мРНК, которая кодирует циклин-зависимый киназный ингибитор, который управляет G1/S переходом.^59-61 Эти результаты иллюстрируют общераспространенную тему, конвергируют ли множественные miRNAs, чтобы регулировать один и тот же путь для тонкой регулировки онтогенетического процесса (Figure 4(b)).

miRNAs Regulate Neurogenesis

Нейрогенез стартует с нейральных стволовых клеток и нейральных клеток предшественников, давая новые нейроны и поддерживая клетки во время как эмбрионального развития, так и в поддержании взрослой нервной системы (Figure 3). ВЫ нервной системе недавние успехи выявили несколько miRNAs, важных для нейрального развития у многих модельных организмов. У рыбок данио истощение материнского и зиготического Dicer вызывает тяжелые морфологические дефекты, включая неполное закрытие нервной трубки, указывая тем самым, что miRNAs регулируют морфогенез головного мозга.⁶² У Drosophila, miR-9a ингибирует избыток продукции предшественников сенсорных органов путем влияния на Sens,^63,64 , тогда как miR-124a способствует ветвлению дендритов сенсорных нейронов путем регуляции неизвестных мишеней.⁶⁵

Figure 3. The function of microRNA (miRNAs) in regulating the proliferation, self-renewal, and differentiation of adult tissue стволовых клеток. Individual miRNAs are indicated by numbers next to the process regulated by them. Red numbers indicate miRNAs that promote proliferation and self-renewal, whereas green numbers indicate miRNAs that promote differentiation (for details, see text).

Изучение miRNAs в нейрогенезе млекопитающих сегодня сфокусировано на miRNAs, которые обнаруживают обильную или исключительную экспрессию в головном мозге или быстро увеличивающуюся экспрессию после дифференцировки ESCs в нейральные стволовые клетки. Последние включают miR-9 и miR-124. Соотв. нуклеотидные последовательности этих двух miRNAs высоко консервативны.⁶⁶

miRNA может регулировать разные мРНК мишени на разных стадиях нейрогенеза. Напр., miR-9 стимулирует деления и ограничивает миграцию происходящих из ESC нейральных предшественников путем регуляции своей мишени Stathmin в hESCs.⁶⁷ Во время последней дифференцировки мультипотентных нейральных стволовых клеток, miR-9 способствует нейрональной дифференцировке и супрессирует самообновление нейральных стволовых клеток путем подавления уровня экспрессии своей мишени, TLX, высоко консервативного ядерного рецептора (Figure 3).⁶⁸ Напротив, miR-9 также является предметом регуляции с помощью TLX, т.к. промоторный регион miR-9 оккупируется с помощью TLX и корепрессора HDAC⁵. Такая регуляторная петля обратной связи используется для гарантии деликатной регуляции ключевых игроков в процессе развития. Такая петля обратной связи ставит новые вопросы о последовательности действия miR-9 и транскрипционного фактора TLX. Поскольку и miR-9 и TLX сосуществуют во время нейрональной дифференцировки, то было бы интересно определить временную последовательность экспрессии miR-9 и TLX, чтобы определить регулирует ли miR-9 первой TLX или vice versa. Помимо способствования нейрональной дифференцировке, miR-9 также ингибирует судьбу астроцитов.⁶⁹ Кроме того, miR-9 и miR-124 действуют сочетано, чтобы контролировать нейрогенез в ESCs.^67,69 Обе miRNAs вносят вклад в снижение уровня STAT3 фосфорилирования, ингибируя тем самым судьбу астроцитов во время нейральной дифференцировки.

Недавно, miR-9* и miR-124, как было установлено, управляют непосредственно превращением фибробластов человека в нейроны посредством SWI/SNF-like BAF хроматин-ремоделирующих комплексов (SWI/SNF: SWItch/Sucrose NonFermentable; BAF: Brgl-associated factor). Это указывает на то, что miRNA может контролировать клеточные клоны посредством эпигенетической регуляции.⁷⁰

Итак, выявляются три общих принципа, лежащие в основе miRNA-обеспечиваемой регуляции (Figure 4): (1) miRNAs действуют в качестве тонкой настройки онтогенетического переключения стадио- и ткане-специфическим образом (Figure 4(a)), (2) разные miRNAs конвергируют. чтобы контролировать одни и те же сигнальные пути путем регуляции одного или нескольких компонентов одновременно (Figure 4(b)), и (3) miRNAs и ключевые онтогенетические регуляторы формируют петли обратной связи, чтобы гарантировать деликатный контроль фундаментальных биологических процессов (Figure 4(c)). Эти способы регуляции с помощью miRNA повторно проявляются как общие темы в др. тканях. Однако, не существует параллельных или исключительных способов действия. Часто, функция тонкой настройки miRNAs достигается посредством или воздействия на сигнальные пути и/или формирования петель обратной связи с др. типа онтогенетическими регуляторами, такими как эпигенетические факторы или транскрипционные факторы. Figure 4. Three different modes of microRNA (miRNA) regulation in стволовых клеток proliferation, self-renewal, and differentiation (for details, see text).

miRNAs Regulate Hematopoiesis

Гематопоэз, инициируемый с помощью мультипотентных гематопоэтических hematopoietic стволовых клеток (HSC) и дающий все типы кровяных клеток, является многоступенчатым процессом и и регулирует процессы пролиферации и дифференцировки. Мало известно о функции miRNA в гематопоэзе Drosophila. Во время гематопоэза у млекопитающих транскрипционные факторы обнаруживают дифференциальные паттерны экспрессии в гематопоэтических стволовых клетках и у разных предшественников, где они контролируют экспрессию генов, которые в свою очередь регулируют спецификацию и дифференцировку клонов от этих стволовых клеток и предшественников. Все больше недавних исследований обнаруживают, что miRNAs также обладают профилем клон-специфической экспрессии и контролируют самообновление и дифференцировку стволовых клеток, посредством отличного механизма-посттранскрипционной регуляции. Упомянутые выше свойства miRNA-обеспечиваемой регуляции делают их преимущественными кандидатами на роль ключевых регуляторов гематопоэза.

Общераспространенным свойством регуляции с помощью miRNA гематопоэза является то, что miRNAs обладают разными профилями стадио- и клон-специфичной экспрессии и функциями⁷¹ (Figure 3). Базируясь на биоинформатике, определении профилей miRNA и реверсивном генетическом анализе, роль miRNAs в регуляции гематопоэза становится всё чётче. Напр., miR-181 и miR-128 сильно обогащены в ранних HSCs, и поддерживают качественные особенности стволовых клеток, ограничивая дифференцировку HSCs во все гематопоэтические клоны. С одной стороны, miR-223 способствует дифференцировке HSCs.⁷² Следовательно, miRNAs с противоположными эффектами действуют вместе на тот же самый путь дифференцировки HSC, чтобы обеспечить тонкую регуляцию. В качестве др. примера такой антагонистической регуляции, miR-155, miR-24a и miR-17 ингибируют дифференцировку мультипотентных клеток предшественников в миэлоидный клон, тогда как miR-146 и miR-181 ингибируют и способствуют дифференцировке в лимфоидный клон, соотв. Такая регуляция также происходит во время терминальной дифференцировки. miR-181a, концентрируется в CD4⁺CD8⁺ двойных позитивных клетках, способствуя T-клеточной позитивной селекции,⁷³, тогда как miR-150 действует в качестве блокатора, ограничивая переход pro-B в pre-B.⁷⁴

Вторым общим свойством регуляции с помощью miRNA гематопоэза является петля обратной связи между miRNAs и транскрипционными факторами, при этом miRNAs модулируют уровни экспрессии транскрипционных факторов или ингибиторов и стабилизируют транскрипционные факторы. Напротив, транскрипционные факторы связывают гены miRNA и регулируют их транскрипцию. Напр., во время гранулопоэза взаимодействие между miR-223 и транскрипционными факторами NFI-A и C/EBPa выявляет тонкий и сочетанный контроль дифференцировки гранулоцитов.⁷⁵ NFI-A соединяется с промотором pre-miR-223 и репрессирует экспрессию miR-223, тогда как при ретиноевой кислотой (RA)-индуцированной дифференцировке, C/EBPa оттесняет на второй план NFI-A для той же промоторной области и позитивно регулирует экспрессию miR-223. Замещение NFI-A с помощью C/EBPa и возникающая в результате дифференцировка гранулоцитов также поддерживается регуляцией петли обратной связи miR-223, которая супрессирует экспрессию NFI-A на посттранскрипционном уровне.

Третьим общим свойством является то, что одна miRNA может регулировать несколько разных клонов. Напр., miR-155 контролирует дифференцировку как T , так и B клеток. С одной стороны, miR-155 регулирует поликлональную экспансию B клеток, как демонстрирует избыточная пролиферация pre-B cell клеток в Eµ-miR-155.⁷⁶ С др. стороны, miR-155 важна для дифференцировки T клеток в Treg и Th1, поскольку miR-155 нокаутные мыши обнаруживают уменьшение Treg клеток, иммунодефицит и угрожающее жизни воспаление.^77,78 Такое один-ко-многим отношение между miRNAs и биологическим процессом сопровождается комбинационной регуляцией miRNAs, чтобы гарантировать аккуратный и тонкий контроль пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.

miRNAs Control Bone and Muscle Development

Формирование кости (остеогенез) состоит из серии событий дифференцировки, начинающийся с мультипотентных мезенхимных стволовых клеток и приводящий к развитию кости. Детерминация мезенхимных стволовых клеток в костный клон обеспечивается транскрипционными факторами Dlx5, Runx2, и фактором роста bone morphogenetic proteins (BMP). Недавнее исследование показало взаимодействие между miRNAs и этими ключевыми регуляторами. Напр., miR-125b ингибирует BMP4-обеспечиваемую дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в остеобласты мыши,⁷⁹ тогда как miR-141 и miR-200a супрессируют дифференцировку преостеобластов посредством воздействия на транскрипционный фактор Dlx5 (Table 1).⁸⁰ В противоположность этим miRNAs, miR-2861 обнаруживает стимулирующий эффект на BMP2-индуцированную дифференцировку остеобластов, частично за счет поддержания уровня экспрессии Runx2.⁸¹ Интересно, что эта роль обеспечивается посредством воздействия miR-2861 на эпигенетический фактор, HDAC5, который ускоряет деградацию Runx2.

miRNAs также играет роль в хондрогенезе, который инициируется с помощью дифференцировки мезенхимных стволовых клеток а хондрогенные предшественники. BMP-2 ранняя чувствительная мишень miRNA, miR-199a*, ингибирует ранние стадии хондрогенеза и продукцию хрящевых олигомерного матричного белка и коллагена, преимущественно посредством посттранскрипционного ингибирования Smad1.⁸²

Подобно кости, скелетные и кардиальные мышцы происходят из мезодермальных предшественников. Развитие скелетных мышц является предметом стимуляции miRNAs (miR-1, miR-26a, miR-206 и miR-214) и ингибирования miRNAs (miR-133, miR-221 и miR-222). Так, miR-1 и miR-26a осуществляют такую регуляцию посредством воздействия на эпигенетические факторы, Hdac4 и Ezh2, соотв.^83-85 Во время развития кардиальных мышц позитивная и негативная регуляторные петли обратной связи сосуществуют. В позитивной петле обратной связи транскрипционный фактор MEF2 активирует экспрессию miR-1, которая затем подавляет эпигенетическую репрессию HDAC в отношении MEF2, это еще больше увеличивает экспрессию MEF2. Эта позитивная петля обратной связи может гарантировать быстрый и продолжительный контроль развития кардиальных мышц. С др. стороны, негативная петля обратной связи делает возможной точную и тонкую регуляцию, при этом miR-133 супрессирует транскрипционный фактор SRF, который активирует экспрессию miR-133. Следовательно, механизм петли обратной связи делает возможным точный контроль ключевых биологических процессов. В отличие от кардиальных и скелетных мышц гладкие мышцы продуцируются из производных эктодермы стволовых клеток нервного гребня. Недавно, miR-145, как было установлено, необходима для дифференцировки стволовых клеток нервного гребня в гладкомышечные клетки посредством воздействия на транскрипционные факторы Klf4, myocardin и Elk1.⁸⁶

THE THERAPEUTIC ROLES OF miRNAs

Учитывая сложную и тонко-настраиваемую природу регуляции с помощью miRNA экспрессии генов, её деградация может приводить к различным болезням, включая рак. В самом деле, профили экспрессии miRNA часто обнаруживаются в опухолевых клетках.^87,88 Более того, определенные miRNAs обладают онкогенными или супрессирующими опухоли свойствами.⁸⁹ Следовательно, miRNAs обнаруживают многообещающий потенциал в качестве инструмента для диагностики, прогноза и лечения рака. Растут доказательства, указывающие, что профиль экспрессии miRNA может быть использован для отличия между нормальной и опухолевой тканью и между разными субтипами рака.^90-92 Точнее говоря, в исследованиях рака груди 9 miRNAs обладают различительной силой, чтобы классифицировать базальный в противовес просветному подтипу рака.⁹³ Помимо диагностики miRNAs также имеют прогностическое значение. Напр., miR-21 обладает предсказательной силой в отношении агрессивности рака груди, тогда как высокий уровень miR-155 и низкий let-7a ассоциированы с плохим прогнозом.^94,95 Исходя из этого было бы интересно проверить, могут ли эти miRNAs также предсказывать у пациентов реакцию на лечение. Более того, miRNAs также используются для лечения рака. Доставка с помощью вируса let-7 и miR-26a мышам, страдающим от рака легкого и рака печени, снижает опухолевый рост благодаря воздействию на онкогены или регуляторы клеточного цикла, соотв.^96-98 Как водно по успехам этого исследования, miRNAs обнаруживают уникальные преимущества при раке, возможно из-за низкого риска побочных эффектов и широкого влияния на гены мишени. Однако вирусная доставка miRNA также имеет свои ограничения. Во-первых, система вирусной доставки накладывает риск побочных эффектов, включая иммунную реакцию, интеграцию вируса в геном и цитотоксичность. Во-вторых, такая доставка минимальна, если вообще происходит, из-за клеточной специфичности мишеней, поэтому могут повреждаться как раковые клетки, так и нормальные клетки. Единственным возможным подходом устранения этих недостатков это разработка доставки в опухолевые клетки с помощью липосом, которые обладают Transferrin (Tf), чтобы находить Tf-рецепторами обогащенные опухолевые клетки. ⁹⁹

The microRNA regulation of stem cellsXiao Albert Huang, Haifan Lin Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology Volume 1, Issue 1, pages 83–95, January/February 2012

The microRNA regulation of stem cells
Xiao Albert Huang, Haifan Lin
Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology Volume 1, Issue 1, pages 83–95, January/February 2012