Посещений:
МИКРОКОМПАРТМЕНТЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ

Попытки искусственного создания

Designing biological compartmentalization
Anna H. Chen, Pamela A. Silver
Trends in Cell Biol. Volume 22, Issue 12, December 2012, Pages 662–670

Intracellular organization is a key factor in cell metabolism. Cells have evolved various organizational systems to solve the challenges of toxic pathway intermediates, competing metabolic reactions, and slow turnover rates. Inspired by nature, synthetic biologists have utilized proteins, nucleic acids, and lipids to construct synthetic organizational systems that mimic natural systems. Many of these systems have been applied to metabolic pathways and shown to significantly increase the production of industrially and commercially important chemicals. Further engineering and characterization of synthetic organizational systems will allow us to better understand native cellular strategies of spatial organization. Here, we discuss recent advances and ongoing efforts in designing and characterizing synthetic compartmentalization systems to mimic natural strategies and increase metabolic yields of engineered pathways.



Compartmentalization benefits natural and engineered systems


Биологическая сложность нуждается в разной степени организации. Клетки нуждаются в пространственной организации, чтобы осуществлять различные ферментативные реакции и процессы, необходимые для поддержания жизни [1]. Это достигается посредством компартментализации, физического разделения биологических реакций. Примеры компартментализации включают с мембранами связанные органеллы, бактериальные микрокомпартменты2,3, мультиэнзимные комплексы и др.4,5.
Вдохновленные природой synthetic биологи недавно провозгласили стратегии, воспроизводящие клеточные организационные системы. Эти синтетические системы были преимущественно сконструированы в отношении путей метаболической инженерии, используя способность клеток продуцировать индустриально6,7 или фармакоцептически пригодные8,9 соединения.

The need for intracellular organization


Клетки извлекают множество преимуществ из компартментализации (Figure 1a). Bo-первых, некоторые энзимы, такие как ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (RuBisCO) [13], страдают от медленного оборота, это приводит к несбалансированному притоку или путям с бутылочным горлышком. Опора на такие энзимы может нуждаться в становлении локальных концентрационных градиентов субстратов. Это будет повышать скорости реакций, чтобы поддерживать адекватный путь притока[14]. Во-вторых, диффузия непостоянных промежуточных образований через клеточную мембрану приводит к их потере из клетки [15]. В-третьих, биосинтетические пути могут генерировать токсические промежуточные образования, которые ингибируют рост, такие как сероводород, накапливающийся во время метаболизма серы у бактерий [16]. Наконец, метаболиты могут участвовать во многих конкурентных реакциях, снижая их доступность для любого из одиночных путей. Напр., malonyl-CoA, промежуточное образование, которое потребляется при продукции жирных кислот и фосфолипидов\. но также используется в биосинтезе polyketides и flavonoids [17].



Figure 1. Compartmentalization: nature's solution to various challenges. (a) Nature faces many challenges when conducting the chemical reactions of the cell. (1) Differing enzyme kinetics may result in flux imbalances. (2) Intermediates may be lost through the cell membrane. (3) Toxic intermediates can result in growth inhibition. (4) Competing reactions can divert flux through undesired pathways. (b) Compartmentalization systems specifically solve challenges 1-4, respectively, by: (1) creating areas of local concentrations to favor reaction kinetics; (2) sequestering intermediates; (3) reducing toxicity; and (4) reducing competition. (Adapted from [11].)

Nature's solutions


Сталкиваясь с этими затруднениями, природа разработала стратегию компартментализации (Figure 1b), такую как крупные комплексы энзимов10,18,19 и органеллы2,20, чтобы организовать пространственно метаболизм. У эукариот компартментализация в форме связанных с мембранами органелл всеобща. Пероксисомы, напр., энкапсулируют реакции, которые генерируют или потребляют перекись водорода, токсическое промежуточное образование при разложении органических субстратов в оксидативных реакциях [21].
Вплоть до недавнего времени прокариоты обычно рассматривались как лишенные внутренней организации [22]. Однако, исследователи недавно выявили разные типы бактериальных микрокомпартментов, которые делят внутреннее пространство бактериальной клетки на участки специализированных функций2,23. У cyanobacteria и др. аутотрофных прокариот, carboxysomes энкапсулируют RuBisCO и carbonic anhydrase, энзимы, участвующие в скорость-ограничвающей ступени цикла Calvin24,25 (Figure 2a). Эти белковые микрокомпартменты являются прежде всего 'carbon-concentrating mechanism' у этих бактерий. Они помогают преодолевать медленную скорость оборота RuBisCO путем предоставления высоких локальных концентраций углекислоты для энзимов26,27.



Figure 2. Protein scaffolds: utilizing nature's building material for functional complexes. Nature compartmentalizes reactions via enzyme complexes. Proteins often serve as scaffolds, bringing together pathway enzymes and increasing flux. (a) Bacterial microcompartments are protein structures that encapsulate reactions [2]. Carboxysomes contain ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (RuBisCO) and carbonic anhydrase. The shell comprises pentamers and hexamers, some of which contain pores that are thought to regulate substrate transport (left). Carboxysomes spatially align in the cell [51] (right). Heterologous expression of microcompartments and further engineering of targeting and transport has the potential for making microfactories that may be capable of encapsulating various reactions. (Left: reprinted from [46] with permission from the authors. Right: image courtesy of David F. Savage, Berkeley, CA, USA). (b) Inspired by natural functional complexes, synthetic protein scaffolds were created [40]. Eukaryotic protein-protein interaction domains (GBD, SH3, PDZ) were expressed as a single polypeptide, creating a synthetic scaffold. Modular protein domain-ligand interactions were used to colocalize three enzymes of the mevalonate pathway: AtoB, HMGS, and HMGR. The stoichiometries of the enzymes could be controlled by changing the numbers (x, y, z) of each of the scaffold domains. Scaffolds balance metabolic flux, sequester a toxic intermediate, HMG-CoA, and create a high local concentration of intermediates, effectively mimicking nature's strategies of compartmentalization. (c) Scaffolds are hypothesized to oligomerize into large complexes that resemble metabolite microdomains, trapping intermediates in the interior and quickly converting them to product before they escape [11].

Два др. бактериальных белковых микрокомпартмента защищают клетку от токсических промежуточных образований альдегида. Микрокомпартмент утилизации ethanolamine utilization (Eut) секвестрирует acetaldehyde, изменчивое и токсическое промежуточное производное пути утилизации ethanolamine [28]. Сходным образом, микрокомпартмент 1,2-propanediol utilization (Pdu) энкапсулирует propionaldehyde, минимизируя его токсичность [29]. Эти и многочисленные др. бактериальные микрокомпартменты обнаруживаются приблизительно в 400 микробных геномах[2].
Др.метод компартментализации в природе это мультиэнзимные комплексы, которые непосредственно связывают энзимы, участвующие в определенном пути. В идеале это приводит к канализации субстрата, процессу, с помощью которого промежуточные образования прямо переносятся между активными сайтами из двух энзимов, которые катализируют последовательные реакции данного пути [30]. Канализация субстрата предупреждает потерю промежуточных образований и минимизирует конкурентные перекрестные реакции. Классический пример это tryptophan synthase, мультиэнзимный комплекс, который катализирует последние две реакции биосинтеза L-tryptophan18,31. Промежуточное образование, indole, переносится с одного активного сайта на следующий без высвобождения в окружающую среду. Это благоприятно для клетки не только потому, что индол является реактивным и легко теряется через клеточную мембрану, но и потому, что в отсутствие индола tryptophan synthase катализирует дегидратацию серина в pyruvate с 5% долей от формирования триптофана [32]. Др. мультиэнзимные комплексы обнаруживаются в природе, включая polyketide synthase [33], carbamoyl phosphate synthetase [34] и cellulosomes [35], которые могут функционировать сходным образом за счет повышения кинетики реакции и снижения потери промежуточных образований.

Synthetic compartmentalization


Целью метаболической инженерной разработки является оптимизация данного биосинтетического пути, чтобы увеличить продукцию определённого субстрата7, 36. Многие из этих путей содержат одни и те же токсические промежуточные образования, конкурентные реакции и несбалансированный приток (flux imbalances), обнаруживаемые в природе10,14. Следовательно, synthetic биологи получают вдохновение от природы, чтобы конструировать системы синтетической компартментализации.

Compartmentalization by tethering using protein scaffolds


Природные белки и межбелковые взаимодействия используются для построения функциональных мультимерных комплексов. В некоторых случаях, некаталитические каркасные белки используются для сборки таких комплексов. Одним из примеров такого каркасного белка является Ste5, который избирательно сводит вместе MAPKK Ste7 и её субстрат MAPK Fus3, способствуя фосфорилированию в этом сигнальном каскаде и отвергая конкурентные субстраты [37]. Др. пример образования каркаса, который организует белковые субъединицы в cellulosome и способствует разложению целлюлозы [35]. Бактериальные микрокомпартменты, крупные ансамбли представлены тысячами белковых субъединиц, функционирую также как организационные устройства в клетке. Попытки воспроизвести механизмы образования каркаса из природных белков включают энзимы поперечных свзей [38], энзимы обездвиживания на твердом субстрате in vitro [39], и энзимы непосредственно для слияния [10].
Созданные природой ферментативные комплексы, синтетические белковые каркасы, способные локализовать совместно энзимы и повышать титр продуктов, были созданы [40] (Figure 2b). Домены межбелковых взаимодействий эукариот были слиты, чтобы сформировать каркасы. Каждый из доменов избирательно рекрутировал энзимы, слитые с соотв. пептидными лигандами, локализуя их совместно на каркасе.
белковые каркасы были протестированы в разных путях и было выявлено увеличение титров. Путь mevalonate, напр., продуцирует токсические промежуточные образования и страдает от дисбаланса потока, обусловленного разными скоростями оборота энзимов. Образование каркасов увеличивает урожая продукта в 77 раз [40]. Путь glucaric acid также был усилен каркасом, это вызывало 5-кратное увеличение по сравнению с наивысшим базовым титром в 0.6 g/L [41]. Этот путь нуждается в высоких уровнях промежуточного myoinositol, чтобы управлять кинетикой myoinositol oxygenase. Финальный пример, это продукция биологического водорода, которая страдает от конкурентных реакций и нуждается в тесном контакте двух участвующих энзимов. Этот путь усиливается примерно в 5 раз каркасным белком [42]. В принципе, эти синтетические белковые поддержки могут воспроизводить природные стратегии компартментализации ни обнаруживаются в мультиэнзимных комплексах, сглаживая тем самым проблемы, иногда обнаруживаемые в искусственных метаболических реакциях.
Степень увеличения выхода, обусловленная каркасами, зависит от стехиометрии поддержки. Природа использует события удвоения генов и эволюцию межбелковых взаимодействий, события, которые оперируют на длинной временной шкале, для изменения соотношения каждого з энзимов в мультиэнзимных комплексах. Синтетические каркасы сходным образом, позволяют нам строить и тестировать множество разных энзимных стехиометрий, но в короткий промежуток времени, чтобы определить оптимальное соотношение для продукции интересующих соединений. Варьирующие количества каждого из доменов взаимодействия в каркасе, как было установлено, драматически влияет на титры продукта [40]. Т.о., конструирование стехиометрий и геометрий синтетических белковых каркасов может приводить к более эффективным механизмам компартментализации.
Хотя точный механизм, с помощью которого белковые каркасы увеличивают выход продукта, неизвестен, но предполагается, что каркасы могут формировать комплексы более высокого порядка благодаря олигомеризации энзимов [11] (Figure 2c), подобно естественно возникающим микродоменам метаболитов, таких как Ca2+ или микродоменов цАМФ43,44. Если верно, что промежуточные образования, синтезированные внутри комплексов, будут бысто потребляться прежде, чем они отправятся в клеточную среду, это д. снижать их токсичность. Это позволит белковым каркасам сблизить более тесно бактериальные микрокомпартменты.

Compartmentalization using protein encapsulation


Бактериальные микрокомпартменты довольно закрыты для окружающих условий с белковыми порами, которые, скорее всего, регулируют транспорт субстрата в и из напоминающей белок оболочки (Figure 2a) [45]. Эта стратегия эффективно изолирует реакционные промежуточные образования от остальной клеточной среды и может создавать высокие локальные концентрации субстратов, увеличивая тем самым урожай продукта.
Микрокомпартменты были экспрессированы гетерологически и были использованы для энкапсуляции чужеродных путей. Как таковые эти микрокомпартменты обладали потенциалом увеличивать пути тока, деля их пригодными для метаболического инженеринга. Напр., carboxysomes из cyanobacteria (Figure 2a) были гетерологически экспрессированы в Escherichia coli и инкапсулированный RuBisCO оказался функциональным in vitro [46]. Микрокомпартменты Eut и Pdu от Salmonella экспрессировались также в E. coli 47,48.
Множество затруднений остается прежде совершения гетерологической экспрессии микродоменов при метаболическом инженеринге. Целевое помещение чужеродных энзимов в микрокомпартменты это область только начинаемых исследований, а локализация последовательностей была обнаружена для Pdu и Eut микрокомпартментов47,49. Однако, хотя ассоциации между белками оболочки carboxysome и др. белковыми компонентами были установлены [50], целенаправленное помещение новых энзимов в carboxysome остается не совсем понятной [46]. Др. затруднением является выяснение механизма транспорта субстрата через оболочку микрокомпартмента. В carboxysomes, диффузия небольших молекул через оболочку очевидна, но поры, которые, как полагают, осуществляют активную регуляцию проходящих субстратов, выявлены в кристаллических структурах [45]. Гетерологически экспрессируемые микрокомпартменты, выделенные из их нативного клеточного окружения, могут помочь лучше понять эти механизмы.
Пространственная организация микрокомпартментов может регулироваться внутри клетки, наделяя клетку др. механизмом оптимизации метаболических процессов. Напр., carboxysomes располагаются вдоль главной оси клетки [51] (Figure 2a, right) и появляются бактериальный цитоскелетный компонент ParA, необходимый собственно для выстраивания. Точное взаимодействие между цитоскелетом и бактериальным микродоменом остается неизвестным. Это знание делает возможным дизайн и конструкцию новых синтетических цитоскелетных каркасных устройств. Путем индукции полимеризации и деполимеризации цитоскелетных белков в ответ на доступные субстраты или др. сигналы окружающей среды, мы будем способны контролировать пространственную организацию и количества компартментов, закрепленных на этом синтетическом цитоскелете. Это может позволить динамическую регуляцию метаболических реакций в синтетических микрокомпартментах.
Др. бактериальная микрокомпартмент-подобная энкапсуляция сконструирована недавно. Капсида lumazine synthase от Aquifex aeolicus была гетерологически экспрессирована у E. coli [52]. Lumazine synthase, это энзим, катализирующий синтез riboflavin, формирующего icosahedral ансамбли, которые не энкапсулируют обычно др. энзимы. Однако электростатические взаимодействия были искусственно созданы, способные энкапсулировать токсичный энзим, HIV protease. Направленная эволюция была использована для отбора капсид с более высокой способностью нагружаться. Кроме того, состояние сборки lumazine synthase контролировалось с помощью искусственно создаваемых точковых мутаций, которые изменяли четвертичную структуру капсид, меняя тем самым размер и структуру капсид, без нарушения вторичной или третичной структуры [53]. Способность изолировать токсичность от цитоплазмы использует поддающиеся расчету системы компартментализации, что важно для метаболического инженеринга. Это делает возможной экспрессию гетерологических путей, которые могут быть токсичными или даже летальными для клетки.
В целом белковые ансамбли были использованы эффективно для организации метаболических реакций и увеличения выхода продуктов. До сих пор, однако, такое увеличение было небольшим. Следовательно, сегодняшней задачей является дальнейшее увеличение продукции до уровней достаточно высоких для индустриального применения. Для этого механизм действия каркасов д. быть исследован более тщательно. Кроме того, каркасы дю быть применимы только к немногим избранным путям для проверки принципа. Необходимо лучше понять локализацию для синтетических каркасов.

Compartmentalization using nucleic acids


ДНК и РНК нанотехнологии DNA and RNA это область исследований, которая обещает многое для медицины и индустрии54-56. Короткие нити ДНК или РНК могут укладываться в различные структуры или собираться в димерные или мультимерные строительные блоки (Figure 3c). Эти строительные блоки могут затем полимеризоваться в различные 3D структуры in vitro, включая простые структуры, такие как листы, а также более сложные структуры, такие как трубки и капсулы57,58 (Figure 3a). Т.о., ДНК и РНК нанотехнологии могут быть использованы для построения комплексов, которые структурно будут воспроизводить естественно организованные системы, такие как энзимные каналы и бактериальные микрокомпартменты.



Figure 3. Nucleic acid scaffolds: mimicking the diverse geometries found in nature. (a) DNA and RNA nanotechnology can produce many different structures in vitro, including tubes and sheets [86]. Although nucleic acids are not frequently used in nature for scaffolding, the ease with which synthetic biologists can design and build these structures make them a versatile tool for building synthetic scaffolds that can mimic various natural compartmentalization strategies of different geometries. (Adapted, with permission, from [86].) (b) Synthetic RNA scaffolds were designed in silico and expressed in vivo[75]. Binding between RNA aptamers and protein adapters facilitated recruitment of enzymes to the scaffold. Hydrogenase and ferredoxin, components of a hydrogen production pathway, were scaffolded and pathway output was increased. (c) Single strands of RNA with aptamers dimerize and these building blocks polymerize into 2D sheets and nanotubes. Polymerization domains are protected with hairpins before dimerization to prevent self-binding and assure order of assembly. The versatile architectures of RNA nanostructures in vivo allow the mimicking of various natural compartmentalization systems.

Структуры из нуклеиновых кислот могут также функционально воспроизводить природные организационные системы. Т.о., белки смогут доставляться непосредственно на каркасы. Некоторые мультиэнзимные системы были успешно организованы, используя нуклеиновые кислоты in vitro. NADH-flavin mononucleotide (FMN) oxidoreductase и luciferase, энзимы, которые катализируют две последовательные ступени, были собраны на ДНК каркасе, используя streptavidin-biotin сцепления, и объединенная энзиматическая активность возрастала по сравнению энзимами, не собранными на каркасе [59]. Glucose oxidase (GOX) и horseradish peroxidase (HRP) были иммобилизованы посредством ковалентной конъюгации на ДНК олигонуклеотидах и увеличивали реактивность в обеих системах на каркасах по сравнению с просто энзимами бел каркасов [60]. Др. энзимные каскады были организованы с использованием крупных супрамолекулярных ДНК каркасов [61] и ДНК origami [62] при этом реактивность зависела от относительного позиционирования энзимов на каркасе.
Хотя традиционные in vitro ансамбли ДНК или РНК наноструктуры базируются на физиологически неподдерживаемых температурах и нуждаются в медленном остывании, чтобы денатурировать и закалять (anneal) конструируемые нити корректно [63], недавно были разработаны изотермальные стратегии для ДНК и РНК64-66. Это открывает путь для применения in vivo РНК и ДНК каркасов.
Был сконструирован ДНК каркас в форма плазмиды. Он рекрутирует энзимы посредством доменов цинковые пальчики, которые соединяются со специфическими мотивами на каркасе [67]. Некоторые энзимы были протестированы с использованием этой системы, включая пути для продукции resveratrol, 1,2-propanediol и mevalonate. Их выход увеличивается как функция от архитектуры каркаса также как и в случает белковых каркасов.
Каркасы с более сложной геометрией были сконструированы, используя соотв. некодирующие (nc)RNA (Figure 3b,c). В качестве строительного материала РНК имеют несколько преимуществ. Благодаря тому, что взаимодействия спаривания оснований в РНК (и ДНК) были хорошо изучены68,69, вторичные и третичные структуры нуклеиновых кислот могут быть предсказаны in silico70-72 с нанометровой точностью [57] и довольно легко сконструированы [55]. РНК могут также экспрессироваться в больших количествах с помощью искусственно преобразованных клеток и могут стабильно существовать вне ядра в клетках эукариот, делая их переносимыми в широкий круг хозяев. Кроме того, РНК могут рекрутировать белки, слитые с адапторами посредством РНК aptamers, которые могут быть использованы для связи с высокой специфичностью с различными лигандами73,74.
Одиночные молекулы РНК (приблизительно в 100 оснований) могут укладываться в линейный дискретный каркас. который воспроизводит природные мультиэнзимные комплексы [75] (Figure 3b). Молекулы РНК представлены множественными отличающимися aptamer мотивами, которые могут рекрутировать белки, а также комплементационные регионы, которые формируют каркас (Figure 3b). Этот каркас относительно легко строится и характеризуется и пригоден для экспрессии специфических стехиометрий из энзимов в цепь [75]. Увеличение, которое может позволить продукцию в индустриально осуществимых титрах, также возможно; многочисленные РНК aptamer домены могут быть соединены в одиночную молекулу РНК. Таким способом почти 100 белков будет рекрутироваться в цепь для визуализации экспериментов [76], хотя это еще не было адаптировано к целям метаболического инженеринга.
РНК нанотрубки были построены, используя короткие однонитчатые строительные блоки, которые полимеризуются in vivo [75] (Figure 3c). При этом направленность загрузки энзимов не была специфицирована; так что энзимы были закреплены как внутри, так и снаружи нанотрубок. Однако загрузка энзимов внутрь избирательна, как было установлено, in vitro[77]. Если такая избирательная загрузка будет осуществляться и in vivo? то модифицированная версия этого 1D каркаса будет действовать подобно пипетке, предупреждая промежуточные образования от утечки и повышая урожай продукта. Др. архитектура каркаса, 2D лист, была сконструирована с использованием сходной стратегии и урожай продукта стал наивысшим при использовании такого каркаса (Figure 3c). Хотя не существует таких аналогичных систем в природе, этот 2D каркас, скорее всего, будет функционировать по увеличению количества соседей любого из энзимов в тесной близости, делая возможным исследование количественного эффекта совместной локализации дополнительных белков в двух измерениях; напр., путем рекрутирования из на мембрану.
В качестве демонстрации осуществимости, [FeFe]-hydrogenase и ferredoxin, энзимы, использованные для биологической продукции водорода [78], были рекрутированы РНК каркасы. Этот путь пригоден для тестирования ложа (bed), поскольку оно страдает от конкурентных реакций и нуждается в энзимах в тесной близости [42]. Продукция водорода возрастала как функция архитектуры каркаса.
ДНК и РНК каркасы делают возможным метаболический инженеринг, чтобы воспроизводить множество разных стратегий, используемых природой для канализации субстрата и снижения конкуренции для усиления пути тока. In vitro работы предоставляют широкий диапазон тестируемых архитектур и функциональностей, которые воспроизводят различные естественные системы компартментализации. Эта способность конструировать точную геометрию каркаса является основным преимуществом каркасов из нуклеиновых кислот по сравнению с белковыми и липидными системами компартментализации, где предсказание и конструирование структуры остаются затруднительными. Однако переход от in vitro к in vivo очень затруднителен для каркасов из нуклеиновых кислот и не всегда возможен из-за множества ограничений, таких как изотермальная сборка. Специфический контроль над архитектурой каркасов и способность конструировать искусственные формы с РНК и ДНК изотермно in vivo являются следующими критическими ступенями в использовании этой технологии для повышения продукции. В случае успеха РНК и ДНК могут быть даже использованы для построения поддержек в архитектурах, которые не встречаются в природе. Хотя эффекты таких структур на груз клеточного метаболизма и общение в нативных системах могут быть проблематичными, но возникают интересные возможности метаболического инжениринга преодолеть природную способность продуцировать пригодные соединения.
РНК каркасы сегодня обнаруживают преимущества перед ДНК и др. типами каркасов тем, что величина экспрессии каркасов может контролироваться. Однако эффект экспрессии высоких количеств нуклеиновых кислот на клеточный рост и жизнеспособность изучены недостаточно и титрация экспрессии каркасов пока еще не осуществлена.
В общем поддержки из нуклеиновых кислот ещё предстоит продемонстрировать, поскольку они пока были использованы только для немногих избранных путей. Дальнейшее использование каркасов из нуклеиновых кислот буде нуждаться в генерации дополнительных ортогональных РНК aptamers или доменов цинковые пальчики. Использование РНК каркасов с их разнообразной архитектурой для разных путей позволит не только дальнейшее улучшение технологии, но м также позволит тестирование механизмов действия каркасов. Напр., эффект образования поддержек, как полагают, выше для неспособных к диффузии промежуточных образований по сравнению с диффундирующими промежуточными образованиями, если локальная высокая концентрация промежуточных образований является важным действующим фактором. В целом, РНК каркасы способны стать разносторонними, поддающимися планированию каркасами, которые смогут воспроизводить натуральные системы отличающихся геометрий, создавать компартменты для разных метаболических путей и увеличивать продукцию возможно, превышающие природную способность.

Compartmentalization using lipids


Липиды часто образуют мембраны и широко используются для энкапсуляции реакций в природе. Липидные пузырьки и масляные эмульсии были использованы для создания широкого разнообразия реакций in vitro, таких экспрессия генов [79], секвенирование и эволюция новых энзимов [80]. Даже само-реплицирующиеся липидные системы были созданы: протоколы, которые способны катализировать РНК реакции и процессинг 'food' мицелл [81]. Хотя эти системы эффективны для энкапсуляции реакций, доставка специфических энзимов в синтетические липидные пузырьки остается затруднительной из-за сигналов локализации или др. специфических механизмов доставки в липидные пузырьки, которые неизвестны.
Др. стратегия компартментализации использует естественно существующие связанные с мембранами органеллы. В отличие от липидных пузырьков многие связанные с мембранами органеллы имеют хорошо изученные механизмы локализации [82]. Одно исследование связано с доставкой methyl halide transferase в дрожжевые вакуоли и увеличением продукции methyl iodide production [83]. Наблюдаемое увеличение, скорее всего, было обусловлено добавлением доступа к кофактору и секвестрацией halogenated продуктов. Также путь доставки компонентов продукции terpenoid с митохондрии существенно увеличивал урожайность [84]. Преимущество этой системы в том, что она делает возможным инженеринг эукариотических клеток, таких как коммерчески важных дрожжей.
Системы липидной компартментализации остаются относительно мало исследованной областью синтетической биологии, поскольку они обнаруживают существенную слабость по сравнению с каркасами из нуклеиновых кислот и белков. Напр., контроль архитектуры компартментов и стехиометрия энкапсулированных энзимов затруднителен. Др. существенные затруднения для использования in vivo устройств для липидной компартментализации включают секрецию финальных продуктов и в случает использования нативных органелл, потенциальные взаимодействия с метаболизмом хозяина. Наилучшее понимание этих факторов и исследований природных систем липидной компартментализации могут дать результаты, которые могут информировать о развитии синтетических липидных компартментов.

Using synthetic scaffolds to understand the limitations of natural systems


Исследование искусственно созданных каркасов может дать нам новую информацию о функции и принципах конструкции естественных стратегий компартментализации. Напр., архитектура каркасов и стехиометрия энзимов, как полагают, являются важным путем увеличения продукции40,75. С помощью путей образования каркасов с известными стехиометриями и отличающейся архитектурой, может оказаться возможной проверка ограничений нативных систем и даже их улучшения.
Нокаут нативного компартмента, замещение его синтетическим и изучение возникающих в результате эффектов на клетку может позволить нам устранять биологические функции. Это может помочь выяснить функции и ограничения нативных систем. Напротив, исследование гетерологической экспрессии натуральных компартментов и целенаправленная доставка позволят нам установить компоненты, которые необходимы и достаточны для собственно функционирования. Механизмы локализации, сборки и пропускания субстрата могут быть установлены в результате такх исследований.
Кроме того, хорошо изученные примеры систем естественно компартментализации представлены в основном белковыми и липидными мембранами. Синтетические системы показали. напр., что нуклеиновые кислоты м. функционировать в качестве каркасов. Однако РНК и ДНК не используются так широко в качестве материалов для образования каркасов в природе. Дрожжевая telomerase один из немногих известных примеров, когда РНК служит в качестве гибкого каркаса для белковых субъединиц [85]. Принимая во внимание эти находки способности синтетических РНК служить подпорками, может оказаться, что пока ещё не открыты функции ncRNA, которые составляют 80% от общей РНК, в создании каркасов. Синтетические каркасы в этом случае могут помочь нам вычленить организационные функции материала, из которого могут состоять каркасы.

Concluding remarks


Cells have evolved strategies for regulating and maintaining proper metabolic flux. Synthetic biologists have taken inspiration from nature and developed synthetic systems that solve some of the same problems. From direct mimicry using proteins to more novel solutions using nucleic acids, synthetic biologists have devised promising strategies for increasing metabolic production of industrially useful chemicals. However, some major challenges remain (Box 1). For example, scaffolds must be applicable to various pathways outside the test pathways chosen in the proof-of-principle studies conducted so far. Further increases in yields must be obtained before scale up to industrially relevant quantities can be achieved. Utilizing multiple types of scaffold in the same system, if feasible, may help accomplish this, because improvements may be made orthogonally by each scaffold. In addition, the effect of such high levels of production on cell growth must be minimized. To overcome these challenges, a better understanding of scaffold mechanism of action and enzyme localization must be achieved. If these efforts prove successful, scaffolds can be widely applied as an orthogonal novel method of increasing yields in metabolic engineering efforts. In addition, implementing and studying synthetic systems will help us understand the native biological organization of the cell.

Box 1. Outstanding questions

• What is the mechanism by which scaffolds operate to increase yield? Do they form higher order structures?
• How can we predictably engineer scaffold architecture and control assembly?
• For what pathways are different scaffolds most useful? Is there a pathway size limitation? Does the diffusability of intermediate substrates influence the effectiveness of scaffold action?
• How do substrates enter and exit synthetic compartments? How are enzymes localized?
• How can we further improve yields using synthetic scaffold technologies? How do we scale up the existing technologies to industrial scale production? • Are there other undiscovered natural scaffolding systems that utilize proteins, nucleic acids, and lipids? How does biological organization function natively?