Роль Myomesin

Making Muscle Elastic: The Structural Basis of Myomesin Stretching. Tskhovrebova L, Trinick J (2012) PLoS Biol 10(2): e1001264. doi:10.1371/journal.pbio.1001264
Skeletal and cardiac muscles are remarkable biological machines that support and move our bodies and power the rhythmic work of our lungs and hearts. As well as producing active contractile force, muscles are also passively elastic, which is essential to their performance. The origins of both active contractile and passive elastic forces can be traced to the individual proteins that make up the highly ordered structure of muscle. In this Primer, we describe the organization of sarcomeres—the structural units that produce contraction—and the nature of the proteins that make muscle elastic. In particular, we focus on an elastic protein called myomesin, whose novel modular architecture helps explain elasticity.	Мышечные волокна возникают за счет слияния дифференцирующихся клеток, чтобы сформировать длинные многоядерные клетки. Ядра мигрируют к периферии, чтобы освободить пространство для параллельно расположенных миофибрилл-сотен или даже тысяч миофибрилл на клетку -состоящих из серии повторяющихся единиц, саркомеров, каждый длиной ~2 µm (Figure 1). Figure 1. Schematics of sarcomere and M-band structure derived from electron microscopy of muscle [1],[2]. (a) Relaxed sarcomere. (b) After isometric contraction causing tension in the M-band and sliding between thick filaments; (c) M-band model showing M-bridges connecting thick filaments, as well as additional links connecting M-bridges. Саркомеры являются действительно удивительными своей почти кристаллиновой упорядоченностью, в комбинации со способностью к эластической деформации. В центре каждого саркомера расположенные бок-о-бок ряды биполярных толстых филамент формируются по большей части из ~300 молекул двигательного белка миозина. Ряды толстых филамент гексогональной формы на поперечном срезе (Figure 1c) и связаны между собой в средине с помощью соединяющих белков, формирующих M-полосу. Существует от трех до пяти регистров M-мостиков в каждой M-полоске, разделенных интервалами ~20-nm [1]-[5], в зависимости от типа мышцы. Вставленные между толстыми филаментами с обеих сторон ряды тонких филамент состоят в основном из актина, которые поперечно связаны с помощью белков Z-полоски (Figure 1a). Мышечное сокращение происходит, когда тонкие филаменты проникают дальше в массив толстых филамент за счет повторяющихся взаимодействий миозина с актином, в результате происходит сокращение саркомера. Elastic Proteins Эластичность саркомеров зависит в основном от вспомогательных цитоскелетных белков, чья модулярная архитектура и гибкость делает возможной обратимые растяжения с помощью сил. Один из таких белков, titin (также известный как connectin), крупнейший из известных полипептидов, обладает длиной, достаточной для одиночной молекулы, чтобы занять пространство между M- и Z-полосками, соединяющими ряды толстых и тонких филамент продольно (Figure 1). C-конец titin расположен в M-полоске, из которой он идет вдоль толстой филаменты до её конца. Между концом толстой филаменты и Z-полоской, titin формирует эластичные соединения. Эти соединения помогают толстым филаментам оставаться на равном удалении между Z-полосками во время активных и пассивных изменений длины саркомера. Без этого центрирующего механизма развивается дисбаланс сил между противоположными половинами толстых филамент во время сокращения [6]. Механизм эластичности титина является иерархическим, используется как пластичность молекулы, так и её способность обратимо расправляться. Укорочение саркомера, как полагают, обеспечивается силой молекулы сворачиваться и как результат развивается восстанавливающая сила. Увеличение саркомера в длину сначала расправляет титин и затем вытягивает его неструктуированные регионы. Растяжение увеличивает натяжение и тенденцию возвратиться в компактную форму. Сокращение саркомера или пассивное растяжение также продуцирует боковые силы, ведущие к экспансии или компрессии решеток толстых [7]-[10] и тонких филамент [7],[11]-[15], необходимых для поперечной эластичности как M- так и Z-полос. X-ray дифракция живых покоящихся мышц показывает, что пространственные изменения толстых филамент обратно пропорциональны квадратному корню длины саркомера [16]. Изометрическое сокращение (когда силы продуцируются, но укорочения не происходит) расширяет решетку толстых филамент за счет радиальной силы ~1 nN на толстую филаменту, или ~10 pN на миозин (в скелетных мышцах лягушек) [15]. Это показывает, что силы расширяющие ряды толстых филамент высоки и должны вызывать напряженность в M-полоске и растягивать M-мостики. Во время продолжительного изометрического сокращения толстые филаменты, центрированные с помощью титина могут оказаться неспособными, что приводит к потере регистра между филаментами и к расширению и смазыванию М-полос (Figure 1b) [6]. Четкость границ M-полос восстанавливается во время расслабления, демонстрируя эластичность M-мостиков. M-мостики образуются принципиально из изоформ семейства myomesin [17],[18] (see reference [19] for review), которые являются членами сверхсемейства иммуноглобулинов [20]. Myomesins являются главными продуктами одного и того гена [17],[18],[21]; однако один член семейства M-белков кодируется независимо [22]. Они в основном локализуются в центре M-полоски, и только один обнаруживается на её краю [23]. Изоформы в разных мышцах также зависят от типа волокон [24],[25]. Myomesins состоят в основном из двух типов доменов, immunoglobulin (Ig, C2-set) и fibronectin (type III, Fn3) [17],[18],[26],[27], оба имеют ~100 остатков и являются β-структурами с 7 или 8 нитями, формирующими два слоя в виде сэндвича. Имеется 7 Ig и 5 Fn3 доменов в каждой молекуле, расположенных как Ig-Ig-Fn3-Fn3-Fn3-Fn3-Fn3-Ig-Ig-Ig-Ig-Ig. Их N-концы также обладают уникальными последовательностями, который варьируют у разных изоформ. Миозин соединяется как с myomesin, так и M-белком вблизи их N-концов: в myomesin связывание обеспечивается уникальной последовательностью [28], тогда как в M-белке оно осуществляется посредством двух Ig доменов, сопровождающих уникальную последовательность [29]. Myomesin димеризуется за счет своего С-терминального Ig домена, и этот конец-в-конец димер, как полагают, формирует одиночный M-мостик [30]. Как myomesin, так и M-белок взаимодействуют с мышечного типа muscle-type creatine kinase (MM-CK) посредством своих центральных Fn3 доменов, это согласуется с присутствием этого энзима в M-полоске [31]. Др. компоненты, по-видимому, усиливают связывание myomesin/M-белка с толстыми филаментами, поскольку взаимодействие только между миозином и M-белком не образует стабильного комплекса [32]. Myomesin Extensibility Хотя несколько моделей расположения M-мостиков было предложено, исходя из электронной микроскопии мышц (Figure 1c) [1],[2],[5], картирования сайтов связывания и паттернов мечения антителами [25],[33], и само-взаимодействия внутри myomesin [30],[34], молекулярная архитектура M-полоски остается неизвестной. Однако при любом расположении M-мостиков механические свойства индивидуальных компонентов, таких как myomesins, могут быть определены по способности M-полоски противостоять деформации. Электронная микроскопия подтверждает гибкость M-белков [35],[36], возможно возникающей в результате внутридоменовой подвижности. Это указывает на то, что пассивное скручивание и раскручивание может обеспечивать низкоэнергетической адаптацией к слабым силам. Недавние механические эксперименты с одиночными молекулами показали, что эмбриональные изоформы обладают дополнительными в 100 остатков длиной уникальные последовательности [37] скорее всего для увеличения растяжимости [38],[39]. Однако, т.к. взрослые изоформы лишены сходных уникальных последовательностей, то границы и механизмы растяжимости myomesin в мышцах взрослых остаются неясными. Исследование Pinotsis et al. в данном номере PLoS Biology [40] адресовано этому вопросу. Они приходят к выводу, что α-спиральные междоменовые линкеры в myomesin являются критическими: их быстрое разворачивание позволяет более чем в двое увеличить длину, тогда как β-структурные домены и их взаимодействия сохраняются. Pinotsis и коллеги исследовали растяжимость myomesinв комбинированных структурных и механических исследованиях C-терминального сегмента из 5 доменов, My9-My10-My11-My12-My13 (My9-My13; в котором Ig-My13 домен ответственен за димеризацию). Основной использованной техникой была X-ray кристаллография, которая обычно обеспечивает ~0.3 nm разрешение, которое позволяет детально исследовать структуру упакованного полипептида в соответствии с последовательностью. Кристаллизация затруднена для крупных, гибких белков, однако т.к. Pinotsis et al. использовали стратегию "divide-and-conquer" для кристаллизации и исследовали три перекрывающихся двух- и трех-доменовые фрагменты My9-My13. Как и ожидалось [34],[41], возникающие в результате структуры показали, что все 4 линкерных соединения Ig доменов являются α-спиралями в 4 или 6 витков. Они назвали новое модулярное расположение IgH, подчеркивая связь между β-структурой Ig доменов и α-спиральными линкерами. IgH единица (представленная одним Ig доменом и одним спиральным линкером) довольно ригидна и придает в результате приблизительно спиральную общую форму My9-My13 димеру, который приблизительно длиной в 36 nm. Модель, сконструированная из X-ray структур была независимо оценена с помощью ЭМ и small angle X-ray solution scattering (SAXS). Электронная микроскопия с использованием техники негативного окрашивания имеет разрешение приблизительно в 2 nm и этого достаточно для детализации, которая позволяет распознать формы индивидуальных белков. Для помощи интерпретации формы, maltose-связывающий белок (~40 kDa) был слит с N-концом My9-My13, это давало в результате характерную добавочную массу на концах картинки димера. Определение формы улучшалось с помощью усреднения 2,000 изображений димеров, которое выявляло форму сходную с той, что была сконструирована из кристаллических структур. Ab initio моделирование SAXS данных также подтвердило приблизительно спиральный димер длиной ~36 nm, что согласуется с кристаллографической и электронно-микроскопической моделями, но также подтвердило степень пластичности. Мутации в линкерах подтвердили их важность для поддержания общей формы молекулы. Чтобы исследовать механику myomesin, проводили растягивание одиночной молекулы димера My9-My13 путем использования atomic force spectroscopy (AFM). Для этого димеры были адсорбированы на nickel-nitrilotriacetic acid (NTA) поверхности с помощью poly-His тэгов на их N-концах. Эластичность была изучена с помощью консольного зонда из AFM, чтобы абсорбировать свободные концы димера и натянуть на него. Кривые сила-растяжение выявили паттерн пиков в виде зубцов пилы, каждый пик отражает расправление β-структурного домена, которое сходно с таковым, наблюдаемым при натяжении титина. Интересным отличием в кривой сила-растяжение My9-My13 стало, однако, плато, которое предшествовало серии серии зубчатых пиков. Длины плато и относительно низкая сила, при которой они наблюдалось согласуется с расправлением α-спиральных линкеров между Ig доменами. Повторяющиеся растягивания и расслабления подтверждают, что расправление линкеров происходит быстро и близко к равновесию и что этот механизм может более чем вдове увеличивать длину My9-My13 без расправления Ig доменов. Исследование Pinotsis et al. является хорошим примером подхода divide-and-conquer для детального изучения структуры и механики в сложных белковых структурах. Новые данные обогатили наше знание механики модулярных белков, формирующих цитоскелет мышц. Они подтвердили простой механизм того, как M-полоса абсорбирует тянущие силы поперечных и продольных движений между толстыми филаментами и удерживает их в регистре. Необходимо отметить, что исследованный фрагмент myomesin составляет менее половины молекулы и поэтому не может отражать его полный механический потенциал. Схемы расположения myomesin подтверждают, что эластичность M-полоски скорее всего обеспечивается более чем My9-My13. Существуют скорее всего иерархические события, начинающиеся с выправления молекул и затем сопровождаемые расправлением разных регионов в зависимости от их относительной механической прочности, как это наблюдается при базирующейся на титине эластичности саркомеров. Важным предварительным условием для глубокого понимания эластичности саркомеров является также более высокое разрешение описания саркомеров, достаточно детальное, чтобы распознать форму белка, благодаря чему мы сможем протестировать модели, выведенные из исследований компонентов молекулы.

Мышечные волокна возникают за счет слияния дифференцирующихся клеток, чтобы сформировать длинные многоядерные клетки. Ядра мигрируют к периферии, чтобы освободить пространство для параллельно расположенных миофибрилл-сотен или даже тысяч миофибрилл на клетку -состоящих из серии повторяющихся единиц, саркомеров, каждый длиной ~2 µm (Figure 1).

Figure 1. Schematics of sarcomere and M-band structure derived from electron microscopy of muscle [1],[2]. (a) Relaxed sarcomere. (b) After isometric contraction causing tension in the M-band and sliding between thick filaments; (c) M-band model showing M-bridges connecting thick filaments, as well as additional links connecting M-bridges.

Саркомеры являются действительно удивительными своей почти кристаллиновой упорядоченностью, в комбинации со способностью к эластической деформации. В центре каждого саркомера расположенные бок-о-бок ряды биполярных толстых филамент формируются по большей части из ~300 молекул двигательного белка миозина. Ряды толстых филамент гексогональной формы на поперечном срезе (Figure 1c) и связаны между собой в средине с помощью соединяющих белков, формирующих M-полосу. Существует от трех до пяти регистров M-мостиков в каждой M-полоске, разделенных интервалами ~20-nm [1]-[5], в зависимости от типа мышцы. Вставленные между толстыми филаментами с обеих сторон ряды тонких филамент состоят в основном из актина, которые поперечно связаны с помощью белков Z-полоски (Figure 1a). Мышечное сокращение происходит, когда тонкие филаменты проникают дальше в массив толстых филамент за счет повторяющихся взаимодействий миозина с актином, в результате происходит сокращение саркомера.

Elastic Proteins

Эластичность саркомеров зависит в основном от вспомогательных цитоскелетных белков, чья модулярная архитектура и гибкость делает возможной обратимые растяжения с помощью сил. Один из таких белков, titin (также известный как connectin), крупнейший из известных полипептидов, обладает длиной, достаточной для одиночной молекулы, чтобы занять пространство между M- и Z-полосками, соединяющими ряды толстых и тонких филамент продольно (Figure 1). C-конец titin расположен в M-полоске, из которой он идет вдоль толстой филаменты до её конца. Между концом толстой филаменты и Z-полоской, titin формирует эластичные соединения. Эти соединения помогают толстым филаментам оставаться на равном удалении между Z-полосками во время активных и пассивных изменений длины саркомера. Без этого центрирующего механизма развивается дисбаланс сил между противоположными половинами толстых филамент во время сокращения [6]. Механизм эластичности титина является иерархическим, используется как пластичность молекулы, так и её способность обратимо расправляться. Укорочение саркомера, как полагают, обеспечивается силой молекулы сворачиваться и как результат развивается восстанавливающая сила. Увеличение саркомера в длину сначала расправляет титин и затем вытягивает его неструктуированные регионы. Растяжение увеличивает натяжение и тенденцию возвратиться в компактную форму.

Сокращение саркомера или пассивное растяжение также продуцирует боковые силы, ведущие к экспансии или компрессии решеток толстых [7]-[10] и тонких филамент [7],[11]-[15], необходимых для поперечной эластичности как M- так и Z-полос. X-ray дифракция живых покоящихся мышц показывает, что пространственные изменения толстых филамент обратно пропорциональны квадратному корню длины саркомера [16]. Изометрическое сокращение (когда силы продуцируются, но укорочения не происходит) расширяет решетку толстых филамент за счет радиальной силы ~1 nN на толстую филаменту, или ~10 pN на миозин (в скелетных мышцах лягушек) [15]. Это показывает, что силы расширяющие ряды толстых филамент высоки и должны вызывать напряженность в M-полоске и растягивать M-мостики. Во время продолжительного изометрического сокращения толстые филаменты, центрированные с помощью титина могут оказаться неспособными, что приводит к потере регистра между филаментами и к расширению и смазыванию М-полос (Figure 1b) [6]. Четкость границ M-полос восстанавливается во время расслабления, демонстрируя эластичность M-мостиков.

M-мостики образуются принципиально из изоформ семейства myomesin [17],[18] (see reference [19] for review), которые являются членами сверхсемейства иммуноглобулинов [20]. Myomesins являются главными продуктами одного и того гена [17],[18],[21]; однако один член семейства M-белков кодируется независимо [22]. Они в основном локализуются в центре M-полоски, и только один обнаруживается на её краю [23]. Изоформы в разных мышцах также зависят от типа волокон [24],[25].

Myomesins состоят в основном из двух типов доменов, immunoglobulin (Ig, C2-set) и fibronectin (type III, Fn3) [17],[18],[26],[27], оба имеют ~100 остатков и являются β-структурами с 7 или 8 нитями, формирующими два слоя в виде сэндвича. Имеется 7 Ig и 5 Fn3 доменов в каждой молекуле, расположенных как Ig-Ig-Fn3-Fn3-Fn3-Fn3-Fn3-Ig-Ig-Ig-Ig-Ig. Их N-концы также обладают уникальными последовательностями, который варьируют у разных изоформ. Миозин соединяется как с myomesin, так и M-белком вблизи их N-концов: в myomesin связывание обеспечивается уникальной последовательностью [28], тогда как в M-белке оно осуществляется посредством двух Ig доменов, сопровождающих уникальную последовательность [29]. Myomesin димеризуется за счет своего С-терминального Ig домена, и этот конец-в-конец димер, как полагают, формирует одиночный M-мостик [30]. Как myomesin, так и M-белок взаимодействуют с мышечного типа muscle-type creatine kinase (MM-CK) посредством своих центральных Fn3 доменов, это согласуется с присутствием этого энзима в M-полоске [31]. Др. компоненты, по-видимому, усиливают связывание myomesin/M-белка с толстыми филаментами, поскольку взаимодействие только между миозином и M-белком не образует стабильного комплекса [32].

Myomesin Extensibility

Хотя несколько моделей расположения M-мостиков было предложено, исходя из электронной микроскопии мышц (Figure 1c) [1],[2],[5], картирования сайтов связывания и паттернов мечения антителами [25],[33], и само-взаимодействия внутри myomesin [30],[34], молекулярная архитектура M-полоски остается неизвестной. Однако при любом расположении M-мостиков механические свойства индивидуальных компонентов, таких как myomesins, могут быть определены по способности M-полоски противостоять деформации. Электронная микроскопия подтверждает гибкость M-белков [35],[36], возможно возникающей в результате внутридоменовой подвижности. Это указывает на то, что пассивное скручивание и раскручивание может обеспечивать низкоэнергетической адаптацией к слабым силам. Недавние механические эксперименты с одиночными молекулами показали, что эмбриональные изоформы обладают дополнительными в 100 остатков длиной уникальные последовательности [37] скорее всего для увеличения растяжимости [38],[39]. Однако, т.к. взрослые изоформы лишены сходных уникальных последовательностей, то границы и механизмы растяжимости myomesin в мышцах взрослых остаются неясными. Исследование Pinotsis et al. в данном номере PLoS Biology [40] адресовано этому вопросу. Они приходят к выводу, что α-спиральные междоменовые линкеры в myomesin являются критическими: их быстрое разворачивание позволяет более чем в двое увеличить длину, тогда как β-структурные домены и их взаимодействия сохраняются.

Pinotsis и коллеги исследовали растяжимость myomesinв комбинированных структурных и механических исследованиях C-терминального сегмента из 5 доменов, My9-My10-My11-My12-My13 (My9-My13; в котором Ig-My13 домен ответственен за димеризацию). Основной использованной техникой была X-ray кристаллография, которая обычно обеспечивает ~0.3 nm разрешение, которое позволяет детально исследовать структуру упакованного полипептида в соответствии с последовательностью. Кристаллизация затруднена для крупных, гибких белков, однако т.к. Pinotsis et al. использовали стратегию "divide-and-conquer" для кристаллизации и исследовали три перекрывающихся двух- и трех-доменовые фрагменты My9-My13. Как и ожидалось [34],[41], возникающие в результате структуры показали, что все 4 линкерных соединения Ig доменов являются α-спиралями в 4 или 6 витков. Они назвали новое модулярное расположение IgH, подчеркивая связь между β-структурой Ig доменов и α-спиральными линкерами. IgH единица (представленная одним Ig доменом и одним спиральным линкером) довольно ригидна и придает в результате приблизительно спиральную общую форму My9-My13 димеру, который приблизительно длиной в 36 nm.

Модель, сконструированная из X-ray структур была независимо оценена с помощью ЭМ и small angle X-ray solution scattering (SAXS). Электронная микроскопия с использованием техники негативного окрашивания имеет разрешение приблизительно в 2 nm и этого достаточно для детализации, которая позволяет распознать формы индивидуальных белков. Для помощи интерпретации формы, maltose-связывающий белок (~40 kDa) был слит с N-концом My9-My13, это давало в результате характерную добавочную массу на концах картинки димера. Определение формы улучшалось с помощью усреднения 2,000 изображений димеров, которое выявляло форму сходную с той, что была сконструирована из кристаллических структур. Ab initio моделирование SAXS данных также подтвердило приблизительно спиральный димер длиной ~36 nm, что согласуется с кристаллографической и электронно-микроскопической моделями, но также подтвердило степень пластичности. Мутации в линкерах подтвердили их важность для поддержания общей формы молекулы.

Чтобы исследовать механику myomesin, проводили растягивание одиночной молекулы димера My9-My13 путем использования atomic force spectroscopy (AFM). Для этого димеры были адсорбированы на nickel-nitrilotriacetic acid (NTA) поверхности с помощью poly-His тэгов на их N-концах. Эластичность была изучена с помощью консольного зонда из AFM, чтобы абсорбировать свободные концы димера и натянуть на него. Кривые сила-растяжение выявили паттерн пиков в виде зубцов пилы, каждый пик отражает расправление β-структурного домена, которое сходно с таковым, наблюдаемым при натяжении титина. Интересным отличием в кривой сила-растяжение My9-My13 стало, однако, плато, которое предшествовало серии серии зубчатых пиков. Длины плато и относительно низкая сила, при которой они наблюдалось согласуется с расправлением α-спиральных линкеров между Ig доменами. Повторяющиеся растягивания и расслабления подтверждают, что расправление линкеров происходит быстро и близко к равновесию и что этот механизм может более чем вдове увеличивать длину My9-My13 без расправления Ig доменов.

Исследование Pinotsis et al. является хорошим примером подхода divide-and-conquer для детального изучения структуры и механики в сложных белковых структурах. Новые данные обогатили наше знание механики модулярных белков, формирующих цитоскелет мышц. Они подтвердили простой механизм того, как M-полоса абсорбирует тянущие силы поперечных и продольных движений между толстыми филаментами и удерживает их в регистре. Необходимо отметить, что исследованный фрагмент myomesin составляет менее половины молекулы и поэтому не может отражать его полный механический потенциал. Схемы расположения myomesin подтверждают, что эластичность M-полоски скорее всего обеспечивается более чем My9-My13. Существуют скорее всего иерархические события, начинающиеся с выправления молекул и затем сопровождаемые расправлением разных регионов в зависимости от их относительной механической прочности, как это наблюдается при базирующейся на титине эластичности саркомеров. Важным предварительным условием для глубокого понимания эластичности саркомеров является также более высокое разрешение описания саркомеров, достаточно детальное, чтобы распознать форму белка, благодаря чему мы сможем протестировать модели, выведенные из исследований компонентов молекулы.

Making Muscle Elastic: The Structural Basis of Myomesin Stretching. Tskhovrebova L, Trinick J (2012) PLoS Biol 10(2): e1001264. doi:10.1371/journal.pbio.1001264

Making Muscle Elastic: The Structural Basis of Myomesin Stretching.
Tskhovrebova L, Trinick J
(2012) PLoS Biol 10(2): e1001264. doi:10.1371/journal.pbio.1001264