Посещений:
РАЗВИТИЕ И РЕГЕНЕРАЦИЯ МЫШЦ
Предшественники и стволовые клетки
|
Making skeletal muscle from progenitor and stem cells: development versus regenerationChen-Ming Fan, Lydia Li, Michelle E. Rozo, Christoph Lepper Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology | WIREs Dev Biol 2012. doi: 10.1002/wdev.30. |
For locomotion, vertebrate animals use the force generated by contractile skeletal muscles. These muscles form an actin/myosin-based biomachinery that is attached to skeletal elements to affect body movement and maintain posture. The mechanics, physiology, and homeostasis of skeletal muscles in normal and disease states are of significant clinical interest. How muscles originate from progenitors during embryogenesis has attracted considerable attention from developmental biologists. How skeletal muscles regenerate and repair themselves after injury by the use of stem cells is an important process to maintain muscle homeostasis throughout lifetime. In recent years, much progress has been made toward uncovering the origins of myogenic progenitors and stem cells as well as the regulation of these cells during development and regeneration. WIREs Dev Biol 2012. doi: 10.1002/wdev.30
Рисунки и Табл. | см. Оригинал статьи
|
У человека более 600 анатомически различаемых групп скелетных мышц. Несмотря на их сложность по форме и функции, каждая мышечная группа дает от сотен до тысяч фундаментальных структурных единиц наз. мышечными волокнами. Мышечное волокно уникально по своей конституции, т.к. оно является многоядерным синцитием, содержащим десятки - сотни ядер, возникшим в результате слияния клеток дифференцированных одиночных мышечных клеток, миоцитов. Предшественники, которые дают эти дифференцированные миоциты предмет данного обзора. Стволовые клетки, которые репарируют поврежденные миофибриллы или регенерируют новые миофибриллы после травмы у взрослых, также рассмотрены.
CELL ORIGIN AND LINEAGE OF MYOGENIC PROGENITORS AND STEM CELLS
The Embryonic Origin of Skeletal Muscles and their Progenitors
Скелетные мышцы всего туловища и конечностей возникают из временных эмбриональных мезодермальных структур, называемых сомитами (Figure 1). Сомиты являются мезодермальными единицами, фланкирующими с обеих сторон спинной мозг, впервые обнаружены Marcello Malpighi у эмбрионов кур.1 Эмбрионы кур стали первой экспериментальной системой для изучения развития скелетных мышц с 1970s.2 В частности эксперименты с химерами курица-перепел,3 в которых хирургически комбинировали клетки донора и хозяина, которые было можно различать по морфологии ядрышек или специфичным для перепела антигенам, продемонстрировали сомитное происхождение мускулатуры конечностей.4,5 Дорсальная эпителиальная порция сомита, дермомиотом, содержи миогенные предшественники.6 Более того, мышцы конечностей и вентральной стенки тела происходят только от 'латеральной' половины сомита, тогда как дорсальные аксиальные мышцы происходя от 'медиальной' половины.7 Фокальное мечение сомитных клеток флюоресцентной краской также использовали для оценки морфологии возникающих миогенных клеток.8,9 Наблюдение вживую таких меченных клеток показало, что клетки вблизи медиальной и латеральной границ (или 'губ') дермомиотома, представляют собой первую волну миогенных клеток.10 Вклад в миогенез центральной порции дермомиотома не будет рассматриваться в данном исследовании.
En1 специфически экспрессируется в центральной части дермомиотома мыши. Используя экспрессию loxP-recombination-based LacZ репортера для маркирования и отслеживания посредством Enz gene-directed Cre (En1-Cre) активности, Atit et al.11 показали, что маркированные клетки центрального дермомиотома (день эмбриогенеза 9.5; E9.5) становятся треугольным доменом под дермомиотомом день спустя (на E10.5). Клетки потомки оказывают ся инкорпорированными не только в мышцы дорсальной части туловища, но и также в межлопаточном коричневом жире и дорсальной части дермы E16.511 (Table 1). Исследование химер курица-перепел показали, что эмбриональные мышцы и их предшественники имеют одно и то же сомитное происхождение.12 Повторное исследование подтвердило, что судьбы мышц туловища и дермы происходят из клеток центральной части дермомиотома,13 хотя куры не имеют коричневого жира для сравнения. Gros et al.13 далее показали путем наблюдения вживую, что клетки центрального дермомиотома, экспрессирующие green fluorescent protein (GFP), делятся вертикально (относительно плоскости эпителия) , при этом одна дочерняя клетка перемещается внутрь, это объясняет треугольные домен, наблюдаемый в En1-Cre меченных сомитах. Используя knock-in аллели репортерного гена двух генов. экспрессирующихся в дермомиотоме, Pax3 и Pax7 (кодирующих родственные транскрипционные факторы), Relaix et al.14 пришли к заключению, что вертикально делящиеся клетки были в самом деле Pax3+Pax7+ клетками центральной части дермомиотома, которые дают новую популяцию внутренних клеток. Т.к. Pax3;Pax7 двойные мутанты неспособны генерировать дополнительные миогенные клетки после первой волны миогенеза, то Pax3+Pax7+ клетки представляют собой вторичных предшественников для непрерывной экспансии мышечной массы (Figure 1).
Table 1. Cre-mediated lineage tracing of skeletal muscles
Клетки центрального дермомиотома не вносят вклада в мышцы вентральной стенки тела или конечностей. Эти две популяции происходят из латеральной половины сомитов,7 преимущественно латеральной части дермомиотома. Этот регион экспрессирует высокие уровни Pax3, а мыши, мутантные только по Pax3, лишены этих мышц.15 Поскольку Pax3 также экспрессируется в пресомитной мезодерме,16,17 то отслеживание Pax3-Cre-обусловленного клона показывает, он не достигает места назначения мышечных предшественников в конечностях и вентральной стенке тела, особенно в латеральном дермомиотоме18 (Table 1). Трансгенная линия, наз. M-Cre, была использована, чтобы помочь определить латеральную часть дермомиотома как источник мышечных предшественников конечностей.18 Однако непрерывное Cre-обусловленное отслеживание клонов метит все клетки, экспрессирующие Cre 'в любой момент времени' прежде испытательного момента времени, тем самым отрицается временная специфичность. Поскольку гены часто обладают динамическими паттернами экспрессии, анализ конституитивных наблюдений, базирующихся на отслеживании Cre клонов, д. включать все паттерны экспрессии прежде момента времени испытания для аккуратной интерпретации.
Индуцибельные tamoxifen формы Cre, Cre-ER слитая и её улучшенные версии Cre-ERT и Cre-ERT2, открывают возможности для контролируемого во времени маркирования клеток. 19 Используя Pax7-Cre-ERT2 аллель для отслеживания индуцибельных клонов, было установлено, что Pax7-экспрессирующие клетки, маркированные в разные моменты времени вносят вклад в разные наборы клеточных судеб и разные мышечные группы 20 (Table 1). Когда клетки центральной части дермомиотома были маркированы на ст. E9.5, они вносили вклад в три судьбы, выявляемые с помощью En1-Cre и En1-Cre-ERT исследований. 11 Pax7 + клетки, маркированные на ст. E10.5 вносят вклад в мышцы вентральных и проксимальных частей верхних конечностей и коричневый жир, но мало в дерму. Маркированные на ст. E11.5 клетки не вносят вклада в дерму, но они отслеживаются в мышцах дистальных частей передних и задних конечностей и в меньшей степени в коричневом жире. На E12.5, Pax7-производные клетки оказываются ограниченными миогенным клоном и обнаруживаются в даже наиболее дистальных мышцах конечностей. Как три выбранные судьбы сегрегируют из простого эпителия (дермомиотома) и как Pax7 + клетки приобретают судьбу, ограниченную миогенным клоном, является фундаментальным вопросом детерминации судьбы, который пока экспериментально не решен.
Myogenic Specification and Differentiation
Миогенная дифференцировка активно исследовалась.21,22 Клонирование MyoD изменяет ландшафт миогенного поля.23 Принудительная экспрессия этого транскрипционного фактора может превращать различные типы культивируемых клеток в клетки с миогенной судьбой, заслуживает тем самым репутации мастера регулятора миогенеза. MyoD имеет три родственных члена этого семейства, Myf5, Myf6 (также наз. Mrf4) и Myogenin.24 Их экспрессия в основном ограничивается миогенными клонами. Экспрессия MyoD и Myf5 предшествует дифференцировке миоцитов и определяет миогенный домен (Figure 1). Myogenin экспрессируется в миоцитах перед из слиянием в миофибриллы. Экспрессия Myf6 также обнаруживается в последних. Myf5 мутанты лишены инициального миотома, но этот дефект компенсируется и мутанты в конечном счете развиваются с незначительными мышечными дефектами.25 Одиночные мутанты по MyoD или Myf6 также жизнеспособны и не обнаруживают тяжелых мышечных дефектов при рождении.26,27 Однако, тройные мутанты Myf5/Myf6/MyoD обнаруживают сильно редуцированные эмбриональные мышцы.28 Myogenin мутантны не обнаруживают дефектов в миогенной спецификации и дифференцировке, но дефектны по слиянию миоцитов в туловище и конечностях.29 MyoD;Myf6 двойные мутанты также дефектны по слиянию миоцитов.30 Важно, что тройные мутанты MyoD;Myf6;Myogenin лишены какого-либо слияния миоцитов, несмотря на нормальную экспрессию Myf5 .30 очевидно, что Myf5 действует преимущественно на ранней ступени спецификации, а Myogenin на более поздней ступени слияния миоцитов, тогда как MyoD и/или Myf6 могут участвовать в обеих ступенях semi-redundant способом. Функция и регуляция этих 4-х генов сложна и не всегда одна и та же у разных исследователей. Тем не менее эмбриональный миогенез обнаруживает замысловатые взаимодействия между этими myogenic regulatory factors (MRFs).
Неожиданно, Myf5-Cre маркированные клетки вносят вклад в коричневый жир, 31 помимо мышц и детерминированных миогенных предшественников, 32 подтверждая, что его экспрессия не детерминирует клетки к миогенной дифференцировке (Table 1). Однако, Myf5-Cre knock-in конструкция использует конституитивный Cre и экзогенный polyA сигнал, это мешает использованию эндогенного 3'UTR и регуляции miRNA. Поэтому несовсем ясно, происходит ли 'аберрантная' или 'непредусмотренная' экспрессия Cre на ст. ранних предшественников. Напр., Myf5-Cre экспрессируется в пресомитной мезодерме, где белок Myf5 обычно не обнаруживается. 33 Поэтому неудивительно, что Myf5-Cre также управляет мечением клонов в хряще и дермисе. Если субпопуляция Myf5 + клеток в самом деле мультипотентна, то важно определить их временное и пространственное распределение. Напротив, MyoD-Cre34 и Myogenin-Cre33 , как было установлено, маркируют только миогенные клоны (Table 1).
Muscle Progenitors in the Perinatal Period
Источник Pax7+ клеток представляет собой крупный вкладчик в миофибриллы в течение первых 3 недель после рождения, исхоя из контролируемого во времени мечения и отслеживания мышц задних конечностей с использованием Pax7-Cre-ERT2 аллеля.37 В др. мышечных группах, особенно в большей части туловища и диафрагмальных мышц, миогенные предшественники также экспрессируют Pax3.38 Являются ли все Pax7+ клетки миогенных предшественников, обнаруживаемые в перинатальный период, производными эмбриональных Pax7+ клеток, не может быть установлено с определенностью, поскольку tamoxifen-индуцированная эффективность мечения у эмбрионов низка.20 Недавно сообщалось, что перинатальные Pax7+ клетки могут возникать из PW1+Pax7- мышечных интерстициальных клеток.39 Используя CD34 и Sca1 поверхностные антигены для fluorescent-activated cell sorting (FACS), исследователи описали приблизительно фракцию в 56% из CD34+Sca1high, экспрессирующую PW1, но не Pax7, и эти клетки могут генерировать мышцы и Pax7+ клетки после трансплантации взрослым животным. Поскольку эти клетки никогда не экспрессируют Pax3 во время эмбриогенеза (не маркированы у Pax3-Cre мышей), они, по-видимому, не сомитного происхождения. Однако, по крайней мере, некоторые эмбрионально и перинатально маркированные Pax7+ клетки, могут вносить непосредственный вклад в стволовые клетки взрослых мышц.20,37 Относительные вклады эмбриональных в противовес перинатальным de novo Pax7+ клеткам в формирование мышечных волокон и стволовые клетки взрослых мышц сегодня неясны.
Хотя Pax7 мутантные мыши не обнаруживают различимых дефектов эмбриональных мышц (если не скомбинированы с мутацией Pax3 ), но Pax7 всё же важен для перинатального миогенеза. Pax7 мутанты рождаются с нормальным количеством клеток, активно транскрибирующих локус Pax7 в мышцах задних конечностей (37). Их количество снижается в последующие недели; , следовательно, выживающие мутантные взрослые обладают незначительными количествами сателлитных клеток и оказываются под чрезвычайной угрозой при регенерации поврежденных мышц.40,41 Митотический дефект,40 клеточная гибель,42 и сниженный миогенный потенциал41 участвуют в потере сателлитных клеток. Отслеживание индуцибельных клонов мутантных клеток показало, что они инкорпорируются в миофибриллы с большой готовностью и в течение более длительного периода по сравнению с контрольными клетками.37 Т.о., Pax7, скорее всего, поддерживает размер пула предшественников путем уравновешивания тенденции дифференцироваться. Как действует Pax7, как его экспрессия регулируется и как количество Pax7+ клеток контролируется во время этого периода это критические вопросы относительно становления нормального пула мышечных стволовых клеток.
Поскольку Pax7 + клетки постоянно инкорпорируются в миофибриллы во время перинатального периода, можно предсказать, что их дифференцировка зависит от семейства генов MyoD. Однако, как упоминалось выше, Myf5, MyoD и Myf6 одиночные мутанты могут развиваться до взрослого периода с относительно нормальными скелетными мышцами, преимущественно из-за перекрывания между этими генами. Интересно, что MyoD-Cre, как было установлено, обнаруживает прямое мечение клонов перинатальных Pax7 + мышечных предшественников с высокой скоростью. 34 Myf5-Cre также управляет маркировкой постнатальных Pax7 + клеток. 32 Т.к. ни один из белков не был обнаружен в мышечных стволовых клетках, то эти knock-in Cre гены д. транскрибироваться в мышечных предшественниках и стволовых клетках когда-нибудь в истории их продукции. Играют ли эти два гена перекрывающуюся роль в этом процессе. неизвестно. Систематические комбинации инактивации условных генов среди Myf5, MyoD, Mrf4 и Myogenin во время перинатального периода д. помочь в определении их роли, относительно тех ролей в эмбриогенезе с помощью соотв. мутаций в зародышевой линии.
Adult Myogenic Stem Cells in Injury-Induced Skeletal Muscle Regeneration
У взрослых скелетные мышцы обладают потрясающей способностью к репарации после обширных повреждений, которые являют пример полного восстановления ткани после перерубания всей скелетной мышцы.43 Регенеративный потенциал ткани сохраняется в течение свыше 50 токсином индуцированных повреждений и циклов регенерации.44 Такая регенеративная способность в основном приписывается мышечным стволовым клеткам эндогенным по отношению к скелетным мышцам. Одним из таких типов клеток являются сателлитные клетки, которые впервые идентифицированы Alexander Mauro точно 50 лет тому назад с использованием трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) в мышце tibialis anticus лягушек (i.e., tibialis anterior).45 Эти клетки были названы по их физической локализации: прикрепленные к сарколемме и под базальной ламиной 'окружающие' мышечное волокно. В тот же год в экспериментах in vitro с миобластами, полученными после ферментативного переваривания ткани скелетных мышц было установлено, что моноядерные мышечные предшественники должны давать многоядерные миофибриллы путем слияния.46,47 Соответствуют ли in vitro изолированные миобласты TEM-выявленным сателлитным клеткам in vivo оставалось неопределенным. Годы спустя элегантные трансплантационные эксперименты, в которые ядра сателлитных клеток импульсно метили tritiated thymidine, передавались в мышечные ядра, демонстрируя, что сателлитные клетки могут пролиферировать и дифференцироваться в мышечные волокна после повреждений, вызванных трансплантацией.48 Дальнейшему прогрессу в области сателлитных клеток препятствовало отсутствие специфических молекулярных маркеров сателлитных клеток.
Открытие Pax7, специфически экспрессируемого в клетках, ассоциированных со скелетными мышцами, которые напоминают сателлитные клетки значительно ускорило исследования в этой области.49 EM исследования ножных мышц лягушек выявило Pax7 иммунореактивность в сателлитных клетках.50 Сходным образом мы установили иммунореактивность Pax7 и β-gal ферментативную активность, управляемую Pax7-Cre-ERT2; LacZ репортером в сателлитных клетках передних тибиальных мышцах мышей с помощью TEM (Figure 2). Эти находки предоставили доказательства, что Pax7+ клетки являются bona fide сателлитными клетками, описанными Alexander Mauro. Однако, Pax7 не единственный маркер, используемый для идентификации сателлитных клеток. Напр., Myf5nLacZ knock-in аллель управляет активностью β-gal в крупной популяции сателлитных клеток. Трансплантации одиночных мышечных волокон вместе с миофибриллами ассоциированными клетками от Myf5+/nLacZ мышей в иммунодефицитные и облученные дистрофичные мышцы давали сотни генетически маркированных мышечных ядер и сателлитных клеток.51 Montarras et al.38 получили сходные результаты посредством трансплантации Pax3+ клеток, выделенных с помощью FACS на базе экспрессии флюоресцентного репортерного гена из Pax3 локуса. Недавно установлена возможность изоляции клеток предшественников из взрослых мышц посредством FACS, используя комбинацию позитивного и негативного отбора маркеров клеточной поверхности.32,52,53 Будучи трансплантированными в массу дистрофической мышцы иммунодефицитных мышей, эти различные популяции клеток умело вводили мышечные ядра в миофибриллы, а также сателлитные клетки в хозяйские ниши мышечных волокон. Важно, Sacco et al.52 выявили все клетки, сортируемые с помощью CD45-Sca1-CD34+β1integrin+ критерия, позитивного для Pax7, с помощью обратной транскрипции в одиночной клетки полимеразной цепной реакции и трансплантации таких одиночных клеток, приводивших к генерации новых мышечных и стволовых клеток, это удовлетворяет 'золотому стандарту' демонстрации их стволовости.54 Остается определить, все ли или только некоторые in vitro определенные компетентные к трансплантации популяции мышечных стволовых клеток содержат Pax7+ клетки.
Приведенные выше доказательства для разных источников мышечных стволовых клеток базируются на выделении in vitro и последующей трансплантации. Используя Pax7-Cre-ERT2 мышей для маркировании и отслеживания клонов клеток, специфичных для взрослых, Lepper et al.37 предоставляли прямые доказательства in vivo , что Pax7+ сателлитные клетки является основным источником мышечных стволовых клеток: после индуцированных токсином повреждений передней тибиальной мышцы, клон-метящие Pax7+ клетки потомки вносили мощный вклад во все регенерирующие миофибриллы и в самообновление, чтобы восполнить пул покоящихся сателлитных клеток.37 Хотя это однозначно демонстрирует, что Pax7+ клетки являются основным источником мышечных стволовых клеток при острой вызванной повреждениями регенерации мышц, важно также определить роль этих клеток в др. физиологических контекстах, включая долговременное поддержание скелетной мышечной ткани, вызванный упражнениями рост мышц и болезни мышечного истощения. Более того, критическим вопросом является, являются ли Pax7+ клетки исключительным источником мышечных стволовых клеток. Как новые миофибриллы образуют синцитий путем слияния множественных миоцитов, только маркирование клонов Pax7+ клеточной популяции не может быть использовано для исключения влияния со стороны др. клеточных источников внутри тех же самых миофибрилл, обусловленные диффузией клонального трассера. В самом деле, многочисленны базирующиеся на трансплантациях исследования описывают несколько разных Pax7- типов клеток, вносящих вклад в миофибриллы и компартмент сателлитных клеток.55 Чтобы определить физиологическое значение этих клинически важных клеток для лечения болезней мышечной дегенерации, важно оценить роль их посредством прямого отслеживания клонов и/или генетического устранения Pax7+ сателлитных клеток, чтобы выяснить, сохраняется ли какая-нибудь способность к миогенезу у взрослых.
Совершенно неожиданно tamoxifen-индуцированная специфичная для взрослых инактивация только Pax7 (посредством Pax7-Cre-ERT2 аллеля 37) или Pax3 и Pax7 одновременно (посредством широко экспрессируемого Cre-ERT аллеля 56) не вызывала очевидного дефекта в регенерации индуцированных повреждениями мышц. Условный мутантные Pax7 клетки не только способны регенерировать эффективно миофибриллы, но и также могут пролиферировать, повторно занимать архитектурные ниши сателлитных клеток и поддерживать дополнительные раунды регенерации мышц. Какова же функция Pax7 в сателлитных клетках взрослых? Компенсируют ли др. транскрипционные факторы их роль в функции сателлитных клеток взрослых, остается открытым вопросом. Хотя сходная линия сравнения функции генов на разных стадиях миогенеза, так, MyoD мутанты развиваются с относительно нормальными эмбриональными мышцами, но регенерация мышц у взрослых нарушена из-за дефектов пролиферации и дифференцировки миобластов. 57,58 Myf5 мутанты также формируют мышцы нормально, но дефектны по регенерации мышц, из-за нарушений пролиферации миобластов. 59,60 Напротив, поскольку Myogenin необходим для слияния эмбриональных миоцитов, то эта функция Myogenin несущественна для постнатального периода. 61 Вместо этого Myogenin контролирует разные транскрипционные программы, 61 , в частности, реакцию на денервацией обусловленную мышечныю атрофию .62 Значение такого временного переключения функций миогенных генов может лежать в фундаментальных различиях между развитием и регенерацией.
SIGNALING DURING MYOGENESIS
Myogenic Induction by Wnt Proteins
У эмбрионов спинной мозг и поверхностная эктодерма, окружающие сомиты, необходимы и достаточны для индукции миогенеза17,63-65 Некоторые гены Wnt экспрессируются в этих двух тканях. Совместное культивирование пресомитных клеток и клеток, продуцируюющих избирательно Wnt белки, вызывает экспрессию Pax3 и Pax7,66 , а также Myf5 и MyoD.67,68 В соответствии с этим, Wnt1;Wnt3a (оба обычно экспрессируются в дорсальной части спинного мозга) двойные мутантные эмбрионы обнаруживают пониженную экспрессию Pax3 и Myf5 в медиальной части демомиотома.69 Потенциал миогенной индукции Wnt генов, экспрессируемых поверхностной эктодермой не был протестирован генетически. In vitro фармакологические исследования показали, что Wnts активируют Ga-adenylyl cyclase-protein kinase A сигнальный каскад, чтобы фосфорилировать транскрипционный фактор CREB, который. в свою очередь, активируе миогенные гены. Соотв., как инактивация в зародышевой линии Creb , так и доминантная негативная избыточная экспрессия Creb в сомитах ведет к тяжелой редукции экспрессии Pax3, Myf5 и MyoD in vivo.68 Кроме того, путь protein kinase C, который может быть активрован посредством передачи сигналов Ga, также участвует в миогенной индукции путем модулирования активности Pax3 и экспрессии MyoD.70
Канонческий Wnt/β-catenin путь также играет роль в миогенезе. Инактивация β-catenin в клетках пресомитной мезодермы ведет к дезорганизации сомитов из-за дефектов сегментации,71 это опровергает твердое заключение о его роли в первичной волне миогенезеа.35En1-Cre управляемая инактивация β-catenin в центральной части дермомиотома ведет к увеличению в домене миогенных клеток за счет дермальных клеток, указывая на ингибирующую роль β-catenin во время вторичной волны миогенеза.11 Напротив, инактивация β-catenin с помощью Pax7-Cre вызывает только незначительные дефекты в архитектуре мышц, представленные изменениями в распределении субтипов мышечных волокон.35 Т.к. и Pax7 и En1 экспрессируются в центральной части дермомиотома, то расхождение, скорее всего, отражает разное время экспрессии и/или эффективности Cre между двумя аллелями. Анализ роли β-catenin посредством инактивации гена ослажняется ещё дефектами адгезии сопровождающих клеток. Инактивация BCL9, который регулирует ядернeю активность β-catenin's, но не его адгезивную фуннкцию , должна в принципе элиминировать этот вопрос. Пока условная инактивация BCL9 с помощью Myf5-Cre, не вызывала онтогенетических дефектов.72 Время активности Myf5-Cre и perdurance BCL9 белка могут маскировать потенциальную роль канонического пути в эмбриональном миогенезе.
Роль передачи сигналов Wnt в регенеративном миогенезе у взрослых многогранна (Figure 3). Избирательная комбинация Wnt5a, 5b, 7a и 7b превращает клетки, находящиеся в мышцах CD45+Sca1+ (т.e., клетки побочных популяций), в экспрессирующие Pax7,64, указыая тем самым, что клетки CD45+Sca1+ являются источником de novo Pax7+ стволовых клеток для регенерации мышц. Хотя эти Wnt гены первоначально были описаны как активирующиеся во время регенерации,73 последующая переоценка не подтвердила этого заявления.74 Т.о., физиологическое занчение клеток побочных популяций и происодит ли их превращение в Pax7+ клетк in vivo пока неизвестно. С др. стороны, FGF6 и FGFR4 экспрессируются во время ранней фазы регенеративной реакции,74,75, а у Fgf6 и Fgfr4 мутантов обнаруживается нарушение регенерации мышц,75,76 это подтверждает важность передачи сигналов FGF для искуссной репарации мышц.
Для симметричных делений Pax7+ мышечных стволовых клеток, как было установлено, Wnt7a использует путь клеточной полярности (PCP) : доставка гена Wnt7a посредством электропортации в мышцы вызывает увеличение количества мышечных стволовых клеток и соотв. мышеную гипертрофию, а PCP компонент Vangl-2 скорее всего, является эффектором, обеспечивающим его функцию.77 Хотя ядерная локализация β-catenin задокументирована в культивируемых пролиферирующих миобластах,он может действовать во временных амплифицирующихся предшественниках скорее, чем в самообновляющихся стволовыхы клетках.78 Ядерная локализация β-catenin также обнаруживается в дифференцирующихся миогенных клетках.72 Важно, что инактивация BCL9 или фармакологическое вмешательство в ативность β-catenin in vivo вызывает задуржку миогенной дифференцировкки, но не нарушает пролиферации предшественников во время регенерации, доказывая, что канонический путь участвует в ступени дифференцировки.72,79 Wnt3a, как было установлено, использует также канонический путь для ускорения слияния in vitro C2C12 модельных миобластов.80 Т.к. слияние миоцитов непосредственно следует за дифференцировкой, то разделение Wnt/β-catenin функций на этих двух ступенях в несинхронизированных популяциях клеток может быть затруднено.
Наконец, активация пути Wnt/β-catenin также индуцирует фиброз мышц и т.о., участвует в уменьшении функции мышц с возрастом. Доставка гена Wnt3a посредством внутримышечной электропортации ведет к фибротической аккумуляции. 77 In vitro, рекомбинантный Wnt3a вызывает прямое превращение миобластов в фибробласты. 79 Важно, репортер транскрипции β-catenin активируется с возрастом, но не в молодых мышцах после повреждения, а истощение Wnt белков посредством расстворимых Frz рецепторов может омолаживать старые миобласты, чтобы предупредить фиброгенез. 72 Поскольку Wnt действует локально, чтобы устранять превращение стареющих мышечных стволовых клеток в клетки с фиброгенной судьбой, TGFβ1, как было установлено, является кандидатом на роль системныого фактора, который может ослаблять активацию мышечных стволовых клеток 81,82 , поскольку уровни TGFβ1 увеличаются у старых людей и мышей. 83 Большинство из упомянутых выше эффектов Wnt и TGFβ1 у взрослых и при регенерации старых мышц базируются в первую очередь на культуре in vitro или избыточной экспрессии in vivo, фарамакологических и RNAi исследованиях; генетические доказательства ещё предстоит получить.
Maintenance of Myogenic Progenitors and Stem Cells by Notch Signaling
Путь передачи сигналов рецептор-лиганд Notch-Delta, как было установлено, служит средством для регуляции различных стволовых клеток и клеток предшественников и их дифференцировованных дочерних клеток. Delta-like 1 (Dll-1) мутантные эмбрионы имеют нормальные количества Pax3+ и Pax7+ клеток; со временем количества этих клеток уменьшаются.84 Сходным образом, условная инактивация в сомитах RBP-J?, транскрипционного медиатора передачи сигналов Notch, также ведет к постепенному истощению Pax7+ клеток.85 Поэтому в середине и в на позднем эмбриогенезе и Dll-1 и условные RBP-J? мутанты имели сильно редуцированную мускулатуру. Эти данные подтверждают позитивную роль в передаче сигналов Notch в контроле размера пуля миогенных предшественников.
Одним из выдающихся негативных регуляторов передачи сигналов Notch является Numb. Асимметричное распределение Numb во время клеточных делений помогает предопределить разные онтогенетические пути для дочерних клеток путем дифференциального воздействия на активности Notch.86 Курьезно, вызываемая экспрессия Numb-GFP слитого белка у эмбрионов мышей87 приводила к увеличению пула предшественников, что выглядит не согласующимся с позитивной ролью передачи сигналов Notch в поддержании предшественников. Поскольку этот особый Numb-GFP трансген не вызывает подавления экспрессии репортера Notch, то всё ещё остается нерешенным вропрос, как Numb действует, регулируя количество эмбриональных мышечных предшественников. Когда было отслежено распределение белка Numb in vitro вживую на постнатальных миобластах, или выделенных массово88 или в форме диссоциированных миофибрилл,89, то было установлено как асимметричное, так и симметричное распределение во время клеточного деления. Пропорция асимметрично сегрегируемого Numb в дочерние клетки снижается во ходе последовательных делений, что возможно отражает отсутствие in vivo регуляторов в культуре. Пока Shinin et al.89 предположили, что Numb расходится совместно с предшественником, Conboy et al.88 предположили, что Numb ассоциирует с дифференцирующейся дочерней клеткой. Пока точная роль Numb в миогенном клоне не решена.
Без исследования локализации Numb, симметричные и асимметричные деления сателлитных клеток могут наблюдаться в культивируемыъ миофибриллах и ассоциированных с ними сателлитных клетках, выделенными от Myf5-Cre; yellow fluorescent protein (YFP) репортерных мышей.32 В этой экспериментальной парадигме, YFP использован в качестве индикаитора для субпопуляции сателлитных клеток в определенный момент времени экспрессии Myf5 (Pax7+YFP+), по сравнению с только экспрессирующими Pax7 (Pax7+YFP-).32 Выявлено два типа клеточных делений. Тип 1, симметричные деления в плоскости (относительно плоскости миофибрилл) дающие большинство дочерних клеток или обе поддерживающие судьбу Pax7+YFP- стволовых клеток. или обе обнаруживающие экспрессию Myf5 (Pax7+YFP+). Тип 2, асимметричные деления в апикально-базальной плоскости в основном дают клетки с разными судьбами: клетку, которая отделяется прочь от базальной ламины, обнаруживает экспрессию Myf5 (Pax7+YFP+), тогда как базальная сестринская клетка остается в компартменте сателлитных клеток и не экспрессирует Myf5 (Pax7+YFP-). Более того, клетка. которая остается расположенной базально обладает повышенными уровнями Notch3, тогда как апикальная клетка экспрессирует Dll-1, подтверждая, что активация Notch3 с помощью Dll-1 позитивно отбирает базальные клетки, чтобы поддерживать их судьбу стволовых клеток . Однако, в ответ на повторящиеся мышечные повреждения, Notch3-дефицитные мыши регенерируют лучше и имеют больше сателлитных клеток, чем контрольные животные, указывая тем самым, что Notch3 не является негативным регулятором пула мышечных стволовых клеток.90 Напротив, избыточная экспрессия внутриклеточного домена Notch1 (NICD, Notch intra-cellular domain, активированная форма Notch1) увеличивает пролиферацию культивируемых миобластов,88 , подтверждае его позитивную роль в экспансии стволовых клеток. Интересно отметить, что в то время как Notch1 экспрессируется почти во всех сателлитных клетках, Notch3 экспрессируется тольков в их субнаборе. Можно предположить, что путь Notch служит, чтобы регулировать количество сателлитных клеток путем балансировки активности между Notch1 (позитивная) и Notch3 (негативная). Участвуют ли различные Delta-like лиганды в обеспечении дифференциальной активности Notch пока неясно.
Хотя экспрессия Dll-1 позитивно регулируется в поврежденных мышцах молодых взрослых особей, 88 старческие мышцы теряют способность активировать Dll-1 после повреждения и ставят под угрозу процесс регенерации. 81 Фармакологическое ингибирование передачи сигналов Notch в самом деле может блокировать регенерацию мышц у молодых взрослых мышей, тогда как принудительная активация передачи сигналов Notch достаточна для восстановления эффективной регенерации мышц у старых мышей. 81 Эти регультаты предоставляют строгое подтверждение непрерывного участия передачи сигналов Notch в поддержании активности стволовых клеток скелетных мышц в течение всей жизни. Для изучения процесса старения избыточная экспрессия генов или реагенты для функционального блокирования скорее, чем генетические средства, часто используются. Нюансы дифференциальных ролей между членами семейтва генов могут быть пропущены. Ограничивающие нокауты для каждого Delta и Notch гена в мышечных предшественниках в противовес окружающим клеткам могут помочь в выяснении специфической роли каждого члена семейства.
REGENERATION RECAPITULATES DEVELOPMENT?
Исследования развития эмбриональных мышц и регенерации мышц две самостоятельные дисциплины. В основном в результате дедуктивных размышлений эти процессы были сравнены. iИсходя из представленных выше описаний становится ясно, что во многих случаях молекулярные механизмы, которые контролируют регенерацию взрослых мышц не воспроизводят механизмы контроля эмбрионального миогенеза. Во время экспансии и поддержания стволовых клеток и предшествеников скелетных мышц обнаруживаются прогрессивные изменения в генетических потребностях в отношении Pax3 и Pax7, чтобы только Pax7 и чтобы никакой другой от эмбриона до новорожденного, до взрослого, соотв. Для мышечной дифференцировки существует также временной сдвиг генетического вклада для членов MRF, напр., роли MyoD и Myf5 во время развития эмбриональных мышц в противоположность регенерации мышц у взрослых, рассмотрен выше. Наиболее поразительный сдвиг функции представляет Myogenin, который необходим для слияния эмбриональных миоцитов, но безразличен для слияния регенерирующих миоцитов взарослых.91 Наконец, путь Wnt/β-catenin также, по-видимому, действует по-разному во время эмбрионального миогенеза, регенерации мышц у взрослых и фиброза старых мышц. Этот путь т.о., постоянно необходимый для поддержания предшественников эмбриональных мышц и мышечных стволовых клеток взрослых это передача сигналов Notch. Однако, Notch3 необходим только для поддержания размера пула мышечных стволовых клеток после повторных повреждений, но не для регуляции пула эмбриональных миогенных предшественников. Существует множество др. сигнальных и транскрипционных регуляторовe развития мышц и регенерации, которые были исследованы только в одном контексте, но не вдругом, но они не будут рассмотрены из-за нехватки места. Всесторонняя оценка этих регуляторов в обоих контекстах поможет составить представление о различиях между этими двумя процессами. Поскоьку эмбриональное развитие базируется на активных предшественниках, постоянно делящихся, а мышечные стволовые клетки взрослых относительно пассивны с отсутствие повреждений, эти два процесса являются фундаментально отличными. В частности, процессы регенерации мышц используют активацию стволовых клеток и возвращаются к гомеостатическому состоянию в хаотических воспалительных условиях, не наблюдаемых во время эмбриогенеза. Следовательно, единственно разумное, что эти стволовые клетки взрослых используют отличающиеся стратегии от тех, что используются эмбриональными предшественниками при регенерации после повреждений.
|
Сайт создан в системе
uCoz