Слияние клеток является критическим для некоторых биологических процессов, включая развитие плаценты [1], ремоделирование кости [2], оплодотворение [3], и образование скелетно-мышечных волокон [4], но изучено оно пока слабо. Скелетные мышцы формируют массу ткани у позвоночных и состоят из пучков длинных синцитиальных волокон, образующихся за счет слияния постмитотических клеток мышечных предшественников (миоцитов). Это сильно регенерирующая ткань, постоянно подвергается репарации и росту посредством слияния миоцитов для формирования новых волокон или добавления созданных волокон. Нарушение функции мышц с возрастом или за счет генетических нарушений приводит к средней до тяжелой патологии, что укорачивает продолжительность жизни, снижает качества жизни и требует больших вложений в уход. Наиболее полное понимание молекулярных механизмов мышечного развития может привести к улучшению лечения мышечных болезней и повышению информации в регенеративной медицине

Muscle precursor fusion is blocked in zebrafish by the loss of an essential receptor pair, Jamb and Jamc. Mutation of jamb results in the complete loss of myocyte fusion. Wild-type fast-twitch muscle precursors (myocytes) fuse together during embryogenesis to form syncytial muscle fibers. Loss of function of the cell surface receptor Jamb results in a potent block in fusion; instead, each myocyte forms its own mononuclear fiber. This phenotype is evident from the chevron-shaped arrangement of nuclei (red) within each myotome that arises by the central position of nuclei in each fiber (cell membranes shown in white). Confocal microscopy image of the axial musculature of jambHU3319 48 hour post-fertilization embryos labeled with mRFP (white) and DAPI (red).

Развитие мышц было хорошо охарактеризовано в мускулатуре стенок тела личинок Drosophila melanogaster, где слияние происходило между двумя субпопуляциями миобластов, обозначаемыми как компетентные к слиянию миобласты (FCMs) и клетки основательницы [5-7]. Процесс слияния осуществляется в результате серии промежуточных ступеней, выявляемых при ультраструктурном анализе [8-10] и идентификации молекулярных компонентов посредством направленного генетического скрининга [11]. Критической ступенью в слиянии является первоначальное распознавание и слипание двух типов клеток. Это регулируется взаимоисключающей экспрессией рецепторных белков клеточной поверхности Kirre и Sns, которые образуют гетерофильную рецепторную пару между соседними клетками [12-17]. Мутации в генах, кодирующих эти рецепторы клеточного распознавания (и в их частично перекрывающихся паралогах Rst и Hbs) приводят к тяжелому блоку слияния между мышечными предшественниками. У позвоночных, функционально эквивалентная гетерофильная рецепторная пара, которая существенна для слияния миоцитов in vivo пока неидентифицирована[18]. Один из подходов по выделению рецепторов у позвоночных был сфокусирован на использовании ортологичной последовательности белкам плодовых мушек-разумность этого базировалась на доказательстве, что молекулярные пути, важные для слияния миоцитов, законсервированы у разных видов [19-23]. Эксперименты с культурами клеток также подтвердили участие некоторых др. белков клеточной поверхности в слиянии миоцитов позвоночных, напр. BOC и CDO [24]. Исследования потери функции этих кандидатов давали умеренные нарушения слияния миоцитов in vivo, это привело к мнению, что этот процесс использует несколько частично перекрывающихся белков у позвоночных [18]. Только один рецептор позвоночных, Kirrel3l (первоначально названный Kirrel), был идентифицирован как важный для слияния миоцитов in vivo при использовании антисмысловых morpholino для нокдауна белка у эмбрионов рыбок данио [22]. Ничего неизвестно о встречном для Kirrel3l рецепторе, участвующем в процессе слияния, это указывает. что др. важный рецептор позвоночных ещё предстоит открыть.

В данном исследовании мы идентифицировали два рецептора клеточной поверхности позвоночных, которые важны для слияния миоцитов: Jamb и Jamc (официальна номенклатура: Jam2a и Jam3b, соотв.; Entrez gene: 100005261, 569217, соотв.). Ортологи обоих генов млекопитающих принято обозначать JAM-B и JAM-C (после модернизации номенклатуры генных семейств в этой области [25]), они обладают хорошо установленными ролями в миграции лейкоцитов [26], образовании плотных соединений [27-29] и в сперматогенезе [30]. Мышиный Jam-B (Jam2) и Jam-C (Jam3) являются членами небольшой подгруппы сверхсемейства иммуноглобулиновых белков клеточной поверхности, которые ограничены ветвью вторичноротых (TreeFam [31]). Они содержат два внеклеточных домена иммуноглобулинового сверхсемейства, одиночный трансмембранный домен и короткий цитоплазматический домен, заканчивающийся типа II PDZ домен связывающим мотивом [32]. Гетерофильные взаимодействия между Jam-B и Jam-C, как полагают, важны для трансмиграции лейкоцитов через сосудистый эндотелий [26] и для поляризации сперматид, необходимой для завершения дифференцировки в функциональные сперматозоиды [30], но кстати, не было известно об участии Jam-B и Jam-C в развитии мышц.

Мы показали, что jamb и jamc коэкспрессируются в развивающихся миобластах и, используя мутантных рыбок данио, продемонстрировали, что физическое взаимодействие между ними важно для слияния миоцитов in vivo. При анализе мутантных фенотипов и демонстрации, что экспрессия jamc неправильно регулируется при формировании мышечного паттерна мутантов, мы получили новую информацию о регуляторных механизмах, которые управляют миогенезом позвоночных.

Используя комбинацию количественной биохимии, мутантных рыбок данио и эксперименты по трансплантации клеток, мы показали, что идентифицировали гетерофильные взаимодействия между парой рецепторов клеточной поверхности, которая важна in vivo для слияния миоцитов позвоночных. Это открытие имеет важное значение для молекулярного механизма, регуляции и эволюции слияния клеток в контексте миогенеза.

Идентификация Kirrel3l в качестве функционального ортолога Kirre/Rst рыбок данио и др. ключевых внутриклеточных эффекторов [19-23] подтвердила консервацию важных сигнальных путей для процесса слияния миоцитов между позвоночными и беспозвоночными. Наше открытие Jamb и Jamc в качестве новой, ограниченной вторичноротыми [31] пары рецепторов, которые важны для слияния аксиальной мускулатуры у рыбок данио, открывает возможность специфичных для позвоночных адаптаций компонентов и регуляции мышечного развития у позвоночных. Напр., наши результаты подтвердили, что это взаимодействие независимо от Kirrel3l, следовательно, необходимы множественные ступени распознавания между миоцитами позвоночных для их слияния.

Dj время дифференцировки миоциты принимают фундаментальное решение между основанием нового мышечного волокна или слиянием между существующими миоцитами. У эмбрионов кур и мышей это решение, по-видимому, контролируется по времени: первичные миоциты формируют массив удлиняющихся моноядерных волокон, с которыми сливаются позднее дифференцирующиеся миоциты [48],[49]. В стенке тела личинок Drosophila, это решение контролируется с помощью ранней спецификации миобластов в два самостоятельных подтипа, что в конечном итоге предопределяет количество формирующихся мышечных волокон [7],[12-16],[50]. Наши результаты показали, что в отсутствие слияний в аксиальной мускулатуре рыбок данио количество быстро сокращающихся мышечных волокон почти удваивается, подтверждая, что предшественники быстрых мышц не подразделяются на определенные субпопуляции, но что каждый миоцит способен стать основателем волокна, если не сливается с уже существующими миоцитами. Коэкспрессия этих важных рецепторов во всех быстрых мышечных миобластах дополняет предположение, что предшественники не ограничены специфическими судьбами. Кроме того, наши эксперименты по трансплантации не выявили какого-либо функционального подразделения миоцитов; приблизительно 95% jamb или jamc мутантных донорских миоцитов были способны осуществить слияние с jamc или jamb хозяйскими миоцитами, соотв. Динамическая природа экспрессии jamc в миобластах быстрых мышц и репрессия в предшественниках медленных мышц указывет на то, что регуляция jamc играет фундаментальную роль в формирования паттерна мышц во время событий слияния скорее, чем спецификация. Более того, др. элементы терминальной дифференцировки, такие как элонгация и генез саркомер, по-видимому, не зависят от процесса слияния.

Наши результаты подтвердили, что взаимодействием между Jamb и Jamc, экспрессируемыми соседними клетками, существенны для слияния. Эти рецепторы клеточной поверхности, скорее всего, обеспечивают инициальное распознавание и событие слипания, сходные с теми, что наблюдаются с рецепторами клеточной поверхности Kirre и Sns у Drosophila. Маловероятно, что взаимодействие между Jamb и Jamc достаточно для слияния, поскольку оба белка , как известно, экспрессируются и взаимодействуют в др. тканях, которые обычно не подвергаются слиянию клеток, такие как сосудистый эндотелий [51]. Jamb и Jamc делают возможным распознавание и слипание клеток, но не вызывают слияния, когда экспрессируются в гетерологичных клетках, таких как CHO [52], MDCK [51] или HEK293E (unpublished data), в отличие от EFF-1, известного фактора слияния клеток C. elegans , который вызывает спонтанные слияния между Sf9 клетками насекомых, трансфицированных связанными с мембранами сплайс-вариантами [47]. Кроме того, эктопически экспрессирующие или Jamb или Jamc, у рыбок данио медленные мышечные клетки не приводят к нежелательным слияниям с предшественниками быстрых мышц (unpublished data). Мы предполагаем, что в биологическом контексте Jamb и Jamc связывание детерминирует продуктивный исход такого взаимодействия; напр., слияние клеток или образование плотных соединений. Взаимодействие между Kirre и Sns, как полагают, является инициальным событием для формирования критических адгезивных и сигнальных комплексов между клеткой основательницей и компетентным к слиянию миобластом, наз. FuRMAS [9]. И Kirre и Sns, как полагают, участвуют в локализации важных сигнальных компонентов этого комплекса, таких как Rols7 и Mbc, для того, чтобы построить и поддержать сложную разветвленную F-actin структуру, необходимую для слияния [11]. Сходным образом, Jam-B и Jam-C, как известно, участвуют в формировании плотных соединений между клетками и локализуют др. белки, такие как ZO-1 в таких сайтах [27-29]. Специализированные структуры слияния не описаны и не охарактеризованы у позвоночных, но Jamb и Jamc может формировать часть подобного комплекса, который определяет место слияния между миоцитами.

Консервативная роль JAM-B и JAM-C в слиянии миоцитов у др. организмов позвоночных является важным направлением наших дальнейших исследований. В подтверждение этой гипотезы оба гена, как было установлено, экспрессируются в развивающихся скелетных мышцах мыши [53],[54] и эмбрионах человека [55]. Нокаутные мышиные модели были созданы для обоих генов и изучены в отношении плодовитости [30], иммунитета [56],[57], кардиального развития [58], нейробиологии [59] и биологии стволовых клеток [60]. Две независимые модели Jam-C^-/- были описаны с высокой перинатальной смертностью [30],[57]; приблизительно две трети мутантных особей погибали в течение 48 h после рождения и были описаны как синюшные и задыхающиеся [57],[58]. Образование, структура и целостность диафрагмы были изучены у таких мышей. Выжившие Jam-C мутантные мыши также обладали заметной задержкой роста, начиная со второй недели постнатального развития [56],[58], megaeosophagus [56]-[58], более слабой силой схватывания передних лап [59] и "дрожанием" [58]. Эти характеристики д.быть предположительно результатом лежащих в основе дефектов мышц. Мыши, дефицитные по Jam-B не обнаруживают выраженного фенотипа [53],[60] хотя развитие скелетных мышц и рост не исследовали специально.

Мы полагаем, что идентификация критической функции jamb и jamc для слияния миоцитов у рыбок данио предоставляет нам возможность лучше понять миогенез у высших позвоночных и слияние клеток в др. биологических контекстах. Молекулярное расширение процессов межклеточного распознавания, которое необходимо для слияния, напр., при образовании плаценты и взаимодействиях спермий-яйцеклетка, которые остаются неполными. Идентификация Jamb и Jamc в качестве in vivo рассматриваемой пары рецептор-лиганд, необходимой для слияния клеток у позвоночных, может послужить стимулом для прояснения этих биологических процессов.