Наиболее хорошо изучены последовательности генома человека, гены, кодирующие белки. Однако кодирующие экзоны этих генов объясняют только 1.5% генома, пропорция которых увеличивается до 2%, если учитывать untranslated regions (UTRs)
1. В последние годы стало очевидным, что порция генома, некодирующая белки, имеет критическое функциональное значение: для нормального развития и физиологии и для болезней
2. Функциональное значение генома, не кодирующего белки, особенно показательно для класса мылых некодирующих РНК non-coding RNAs (ncRNAs), называемых микро РНК (miRNAs)
3, 4. При болезнях человека, особенно при раке, было показано, что эпигенетические и генетические дефекты в miRNAs и в аппарате их процессинга являются широко распространенным признаком болезней
5-8. Однако, miRNAs сегодня на вершине айсберга, а др. ncRNAs, такие как transcribed ultraconserved regions (T-UCRs), small nucleolar RNAs (snoRNAs), PIWI-interacting RNAs (piRNAs), large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs) и в целом гетерогенная группа long non-coding RNAs (lncRNAs), также могут вносить вклад в развитие многих разнообразных болезней
2.
Types of ncRNA and their functions
Открытие, что многие геномные последовательности у сложных организмов транскрибируются регулируются зависимым от стадии развити и ткани способом9, 10 послужило толчком к гонке, чтобы охарактеризовать все разнообразные типы ncRNAs, которые транскрибируются в клетках человека. Хотя большинство работ сфокусировано на коротких РНК, таких как miRNAs, lncRNAs также обратили на себя внимание. В случае lncRNAs, это те ncRNAs, которые длиннее 200 нуклеотидов на базе протокола очистки РНК, который исключает малые РНК10. Хотя и необязательно четкое различие между классами ncRNA, для простоты, в данном Обзоре, я буду обсуждать ncRNAs, подразделяя их на следующие категории: miRNAs, piRNAs, snoRNAs, lncRNAs (напр., homeobox (HOX) transcript antisense RNA (HOTAIR), lincRNAs и T-UCRs) и др. типы ncRNAs. Table 1 суммирует разные типы ncRNAs, которые обсуждаются, а Fig. 1 иллюстрирует аппарат биогенеза большинства хорошо охарактеризованных ncRNAs.
miRNAs. Наиболее глубоко исследован класс ncRNAs это miRNAs, которые являются малыми ncRNAs из ~22 нуклеотидов (nt) , которые у животных обусловливают пост-транскрипционое молчание генов, контролируя трансляцию мРНК в белки3, 4. miRNAs, как было установлено, регулируют трансляцию более 60% белок-кодирующих генов. Они участвуют в регуляции многих процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и развитие. В то время как некоторые miRNAs регулируют специфические индивидуальные мишени, др. могут функционировать как мастера регуляторы процессов, так ключевые miRNAs регулируют экспрессию уровней сотен генов одновременно, а многие типы miRNAs регулируют свои мишени кооперативно3, 4. Биогенез miRNAs осуществляется посредством многоступенчатого процесса, который использует RNase III энзимы Drosha и Dicer и в конечном результате формируются зрелые miRNAs в ~22 nt11. Эти молекулы загружаются с помощью Dicer-TARBP2 (TAR RNA-binding protein 2; также известен как TRBP) комплекса на члена подсемейства белков Argonaute, чтобы сформировать RNA-induced silencing complex (RISC), в котором белки Argonaute составляют каталитические эндонуклеазные компоненты. RISC управляет регуляцией мРНК путем распознавания комплементарной последовательности в мРНК мишени, которая обычно располагается в 3'UTR. Как загрузка miRNAs в RISC12, так и и функция аппарата miRNA тонко регулируются11. Трансляция мРНК в белки репрессируется с помощью miRNAs двумя основными способами: деградация мРНК и ингибирование инициации трансляции мРНК3, 4.
piRNAs. piRNAs являются ncRNAs 24-30 nt в длину, они независимы от Dicer и соединяются с PIWI подсемейством семейства белков Argonaute, которые участвуют в поддержании стабильности генома в клетках зародышевой линии13, 14. Они транскрибируются с регионов генома, которые содержат транскрибируемые мобильные элементы и др. повторяющиеся элементы. Комплекс, который формируется piRNAs и PIWI белками, супрессирует экспрессию и мобилизацию мобильных элементов с помощью двух разных механизмов, которые описаны у Drosophila melanogaster: расщепление транскриптов мобильных элементов с помощью PIWI белков - процесс, которые обеспечивается посредством распознавания спариваемых оснований с помощью piRNA15 - и гетерохроматином-обусловленное молчание генов16. Три основных PIWI-класса белков (а именно, PIWIL1, PIWIL2 и PIWIL4) участвуют в т. наз. 'ping-pong' цикле амплификации, создавая антисмысловые piRNAs, которые способны репрессировать транскрипт первоисточника17. Интересно, что PIWI белки не только участвуют в непосредственной деградации, но и также связаны с метилированием ДНК13, 18. В соответствии с этим, недавно была описана одиночная piRNA, обеспечивающая локус-специфическое метилирование импринтируемого региона19.
snoRNAs. snoRNAs это промежуточного размера ncRNAs (60-300 bp). Они являются компонентами small nucleolar ribonucleoproteins (snoRNPs), которые являются комплексами, ответственными за сиквенс-специфическое 2?-O-метилирование20 и pseudouridylation21 of рибосомальной РНК (rRNA). Пост-транскрипционные модификации rRNAs происходят в ядрышке - компартмент ядра, внутри которого формируются рибосомы - и облегчают укладку и стабильность rRNA22. Последовательности snoRNAs ответственны за целенаправленную сборку snoRNPs на специфических мишенях.
lncRNAs. lncRNAs гетерогенная группа некодирующих транскриптов более чем в 200 nt длиной, которые участвуют во многих биологических процессах. Этот класс ncRNA составляет самую большую часть некодирующего транскриптома млекопитающих2. Предполагаются различные механизмы транскрипционной регуляции генной экспрессии с помощью lncRNAs. Кроме того, lncRNA, , как известно, обусловливают эпигенетические модификации ДНК путем рекрутирования хроматин ремоделирующих комплексов на специфические локусы23, 24. В HOX локусах человека, выявляется последовательная временная и пространственная экспрессия сотен lncRNAs, которые регулируют доступность хроматина в процессе, который использует энзимы модификации гистонов и RNA полимеразу25. lncRNAs важны для многих физиологических процессов, таких как инактивация Х у млекопитающих, у которых X-inactivation specific transcript (XIST) lncRNA (17 kb) рекрутирует polycomb комплекс для замалчивания Х хромосомы, с которой он транскрибируется26. TSIX, другая lncRNA, транскрибируется с противоположной нити по сравнению с XIST и регулирует уровни XIST во время инактивации X хромосомы23. В качестве др. примера, многие lncRNAs экспрессируются импринтируемыми локусами, в которых они выполняют центральную функциональную роль2.
Др. класс lncRNAs это lincRNAs, которые транскрибируются с межгенных регионов. Эти транскрипты идентифицированы при поиске хроматиновых сигнатур, которые ассоциируют с активной транскрипцией в регионах, в которых происходит транскрипционная элонгация27. Ключевые роли lincRNAs в определенных биологических процессах начинают выявляться: напр., в p53-обусловленном транскрипционном ответе на повреждения ДНК28. Одна p53-регулируемая lincRNA (наз. lincRNA-p21 поскольку расположена вблизи гена p21) имеет мотив связывания p53 в своем промоторе. Если имеет место p53 индукция вследствие повреждения ДНК, то эта lincRNA репрессирует экспрессию нижестоящих генов пути p53. lincRNAs, как было установлено, регулируют как экспрессию соседних генов28 , так и удаленных геномных последовательностей29.
Наконец, класс lncRNAs, который транскрибируется с ultraconserved regions (UCRs). UCRs это сегменты ДНК, которые длиннее 200 bp и которые полностью консервативны в геномах человека, крыс и мышей и большинство из которых законсервировано также у кур и собак30. Они, как полагают, происходят из очень раннего периода эволюции позвоночных, т.к. большинство их не имеют ортологов у sea squirts, или червей31. Описано 481 UCRs, некоторые из которых перекрываются с кодирующими экзонами, хотя полагают, что более половины из них не кодируют каких-либо белков32. Неожиданно 68% UCRs (т.е., 325 из них) транскрибируются, составляя новую категорию ncRNAs, T-UCRs33. Хотя длины UCRs находится в пределах от 200 до 779 bp, транскрипционные единицы T-UCRs (не подверженные сплайсингу, полной длины кДНК) обычно свыше 2 kb для известных T-UCRs33, 34. T-UCRs экспрессируются в обычных тканях как повсеместно или в виде специфического паттерна в зависимости от ткани33, 34. Функции T-UCRs неизвестны, но было показано, что некоторые из них соединяются с miRNAs33.
Other types of ncRNAs. Описаны многие классы ncRNA, которые ассоциированы с transcriptional start sites (TSSs) генов: напр., promoter-associated small RNAs (PASRs)
10, TSS-associated RNAs (TSSa-RNAs)
35, promoter upstream transcripts (PROMPTs)
36 и transcription initiation RNAs (tiRNAs)
37. Для всех этих классов их биологические функции плохо определены, хотя, по-видимому, участвуют в регуляции транскрипции. Наконец, специализированный тип lncRNA, известный как telomeric repeat-containing RNAs (TERRAs), транскрибируется с теломер. TERRAs помогают поддерживать целостность теломерного гетерохроматина путем регуляции активности теломеразы
38.
Disruption of ncRNAs in cancer
Disruption of miRNAs in cancer. Роли ncRNAs в туморогенезе в большинстве своем изучались применительно к miRNAs5-8. При раке у человека профили экспрессии miRNA отличаются от нормальной ткани и отличаются в зависимости от типа опухоли. miRNAs могут действовать как онкогены или как опухолевые супрессоры и могут выполнять ключевые функции в туморогенезе5-8. Пример семейства miR-200 в регуляции эпителиально-мезенхимного перехода показан на Fig. 2. Дерегуляция miRNAs при раке может возникать в результате эпигенетических изменений (напр., гиперметилирование промоторных CpG островков в случае семейства miR-20039) и генетических альтераций, которые могут влиять на продукцию первичных транскриптов miRNA, их процессинга в направлении зрелых miRNAs и/или взаимодействий с мРНК мишенями (Table 2). С генетической точки зрения, одной из первых ассоциаций, наблюдаемых между miRNAs и развитием рака стала дерегуляция miR-15 и miR-16 в большинстве случаев B клеточных хронических лимфоцитарных лейкемий в результате делеции хромосомы13q1440. Интересно, что miRNAs часто располагаются в ломких регионах хромосом, которые участвуют в овариальных и грудных карциномах и меланомах41, 42.
Недавняя демонстрация опухоль-специфичных генетических дефектов в аппарате процессинга miRNA, таком как гены, кодирующие TARBP2 (Ref. 43), DICER1 (Ref. 44) и exportin 5 (XPO5)45, довольно строго подчеркивает значение этих путей в трансформации клеток, дефекты которых вносят вклад в объяснение дерегуляции miRNA при раке. В этом отношении хотя и были описаны специфические miRNAs, действующие как онкогены и опухолевые супрессоры, профили экспрессии miRNA в опухолях человека характеризуются общим дефектом продукции miRNA, что приводит к глобальному подавлению miRNA9.
Disruption of piRNAs in cancer. piRNAs и piRNA-подобные транскрипты, как было установлено, участвуют в туморогенезе тестикулярной ткани и в ряде др. типов опухолей46-49, хотя их специфические функции в туморогенезе неясны. PIWI белки также участвуют в развитии рака; напр., PIWIL1 и PIWIL2 избыточно экспрессируются в разнообразных соматических опухолях50-53. Более того, изученные модели раковых клеток человека оказались связаны с избыточной экспрессией PIWIL1, приводящей к аресту клеточного цикла54, и избыточной экспрессией PIWIL2 приводящей к передаче анти-апоптических сигналов и пролиферации клеток55. У модельных D. melanogaster эктопическая экспрессия генов, кодирующих PIWI и др. компоненты аппарата piRNA, продемонстрировала управление ростом злокачественной опухоли головного мозга56.
Механизмы, которые лежат в основе предполагаемых онкогенных эффектов piRNAs и PIWIs в основном неизвестны, хотя некоторые пути выглядят осуществивыми. PIWI белки оказались ассоциированы с самообновлением стволовых клеток, которые обладают потенциалом злокачественной дифференцировки58. При некоторых раках, избыточная экспрессия PIWIL2, как полагают, ведет к тому, что клетки становятся резистентными к cisplatin, это может возникать из-за повышенной конденсации хроматина, которая предупреждает нормальный процесс репарации ДНК59. Поразительно, PIWI-ассоциированные РНК были также обнаружены аберрантно экспрессируемыми в соматических опухолях человека60, указывая тем самым, что PIWI путь выполняет наиболее выраженную функцию вне клеток зародышевой линии, чем это предполагалось.
snoRNAs. Информация о потенциальной роли snoRNAs получена в исследовании, где наблюдалось существенное подавление snoRNAs в менингиомах по сравнению с нормальным головным мозгом61. недавно было также показано, что различные snoRNAs дифференциально экспрессируются в non-small-cell раке легкого по сравнению с соотв. нормальной тканью62. Др. исследования показали, что зародышевой линии гомозиготная в 2 bp (TT) делеция snoRNA U50 ассоциирует с развитием рака простаты63 и что U50 часто подвергается соматической гетерозиготной делеции и подавлению транскрипции при раке груди64. Др. исследования показали, что growth arrest specific 5 (GAS5) - ген, который содержит 10 интронных snoRNAs, но который также кодирует lncRNA - контролирует жизнеспособность клеток путем индукции или сенсибилизации клеток к апоптозу65, 66. Существенное снижение уровней мРНК GAS5 в образцах рака груди по сравнению с соседней нормальной эпителиальной тканью молочной железы, также подтвержадет, что он действует как ген опухолевого супрессора65.
Ассоциация между snoRNAs и туморогенезом распространяется также на ассоциированные с ними белки. snoRNPs подразделяются на два основных класса - C/D box и H/ACA box - в соответствии со своими законсервированными вторичными структурными характеристиками и ассоциированными модификационными реакциями67. C/D box snoRNPs состоит из основы в 4 белка - fibrillarin (methyltransferase), nucleolar protein 56 (NOP56), NOP58 и NHP2-like 1 (NHP2L1) - тогда как H/ACA box snoRNPs содержат dyskerin (pseudouridine synthase), GAR1, NHP2 и NOP10. Fibrillarin важен для развития, а его делеция летальна для эмбрионов. Мутации в гене dyskerin (DKC1) человека, в NOP10 и NHP2 ассоциированы с X-сцепленным генетическим нарушением dyskeratosis congenita, одним из признаков которого является чувствительность к эпителиальным раковым опухолям68. snoRNAs и snoRNPs, скорее всего, вносят вклад в туморогенез посредством эффекта на рибосомы и трансляцию белков, принимая во внимание, что трансляция часто нарушена в раковых клетках. Однако, snoRNAs могут также участвовать в регуляции генной экспрессии, учитывая вклад др. регуляторных видов РНК, таких как miRNAs69. особенно интересными для будущих исследований являются orphan snoRNAs, функции и мишени которых остаются неизвестными.
lncRNAs. Недавние находки подтвердили, что уровни транскрипции T-UCR изменены при туморогенезе у человека и что разные типы рака человека могут быть различены в соответствии с их специфическими аберрантными профилями экспрессии T-UCR33. Признаки экспрессии T-UCR были описаны при chronic lymphocytic leukaemia (CLL), colorectal cancer (CRC) и hepatocellular carcinoma (HCC). Как подавление, так и повышенная активность разных T-UCRs наблюдается при сравнении экспрессии в опухолях и нормальных тканях. Подобно miRNAs, T-UCRs, которые дифференциально экспрессируются в специфических раковых опухолях, обнаруживают тенденцию локализоваться в cancer-associated genomic regions (CARGs), которые ассоциированы с таковыми при разных типах рака: напр., ломкие сайты, кластеры HOX генов, минимальные регионы потери гетерозиготности и минимальные регионы амплификации33, 70.
Пока аберрантная регуляция экспрессии T-UCR в раковых опухолях обнаруживается двумя основными способами: путем измененных взаимодействий с miRNAs33 и с помощью гиперметилирования CpG островков промоторов34. Многие T-UCRs обнаруживают существенную комплементарность специфическим miRNAs, это указывает на то, что T-UCRs могут действовать как мишени для miRNA31, 71. Экспериментальные результаты подтверждают эту гипотезу. Напр., трансфекция miR-155 в лейкемичные клетки существенно снижает экспрессию T-UCR uc.160+ (Ref. 33). Как это происходит в кодирующих генах, гиперметилирование ДНК по CpG островкам, расположенных в промоторах, также может подавлять экспрессию T-UCR34. Это было продемонстрировано для некоторых T-UCRs способом, который специфичен для типа рака. Наконец, недавние сообщения также показали, что точковые мутации зародышевой линии (напр., в uc.21 и uc.72) и делеции (напр., в uc.159) в UCRs примерно в три раза более часты у пациентов с CLL и CRC, чем в контроле72.
Учитывая приведенные доказательства, большие усилия были сделаны, чтобы охарактеризовать роль T-UCRs при раке, но мало известно о их биогенезе и нормальных функциях. T-UCR uc.338, по-видимому, модулирует клеточный рост гепатоцитов человека: её подавление в HepG2 клетках уменьшает длину S фазы и увеличивает sub-G1 пик73, тогда как повторное введение uc.283+ в HCT-116 клетки увеличивает время удвоения клеток и клеточную гибель34.
Среди различных примеров участия lncRNAs в раковых опухолях, роль HOTAIR при неоплазиях у человека изучена лучше всего
24. В эпителиальных раковых клетках избыточная экспрессия HOTAIR заставляет polycomb быть направленным на новые цели в геноме (Fig. 2). Инвазивность таких клеток и склонность к метастазированию также увеличена, оба эти изменения зависят от polycomb белка PRC2. Напротив, инвазивность рака снижается, когда теряется экспрессия
HOTAIR, этот эффект увеличивается в клетках с более высокими, чем обычные уровни активности PRC2. Как таковая, HOTAIR может выполнять активную роль в модулировании ракового эпигенома и обеспечении трансформации клеток. Сходная функция была предположена для некоторых др. lincRNAs, таких как lincRNA-p21, которая действует как репрессор в p53-зависимых транскрипционных реакциях
28. Антисмысловая p15 lncRNA, p15AS, была впервые идентифицирована в лейкемии человека, как было установлено, она также вызывает молчание
p15 гена опухолевого супрессора путем индукции образования гетерохроматина
74.
Disruption of ncRNAs in other diseases
Мы только теперь открыли крышку ящика Пандоры, и убедились, что ncRNA вносят вклад и в др. болезни человека. Как и в случае рака, miRNAs были первыми ncRNAs, для которых была установлена роль в др. болезнях. Как и в случае нарушений паттерна экспрессии miRNA, наблюдаемых в трансформированных клетках, нейродегенеративные, воспалительные и сердечно-сосудистые болезни обнаруживают сигнатуры аберрантной транскрипции miRNA (Table 3). Информация о роли др. ncRNAs при нераковых болезнях только начинает появляться.
miRNAs in neurological disorders. Среди их разнообразных ролей многие микроРНК важны для правильной функции нервной системы, которая содержит широчайший спектр экспрессии miRNA во всех тканях человека. Около 70% miRNAs экспрессируются в головном мозге и многие из них специфичны для нейронов75. Они участвуют в нейральном развитии, формировании дендритных шипов и выростах нейритов, а нарушения их регуляции описывается почти при всех изученных нейрологических заболеваниях.
У млекопитающих условное устранение существенных компонентов аппарата miRNA, таких как Dicer, указывает на то, что miRNAs являются критическими для функционирования головного мозга. Напр., продемонстрирована важность miRNAs для терминальной дифференцировки и поддержания многих типов нейронов76. Нарушение процессинга miRNA, , как было установлено, вызывает признаки: атаксии в клетках Пуркинье77; множественный склероз в клетках олигодендроцитов78; Паркинсонову болезнь в допаминергических клетках76; и болезнь Алцгеймера в нейронах, экспрессирующих Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase type II (Ca2+MKII)79. Мутации в центральном аппарате процессинга miRNA также часто обнаруживаются как причинные в случаях различных нейрологических нарушений. Напр., мутации компонентов Drosha микропроцессорных комплексов, таких как Fus и TDP-43, вызывают свыше 50% семейного амиотрофического бокового склероза80; fragile X syndrome (FXS) может быть вызван мутациями в компоненте комплекса RISC fragile X mental retardation 1 protein (FMRP)81, а репрессия трансляции с помощью miRNAs негативно регулируется мутациями в повторе, богатом лейцином, serine/threonine-protein kinase 2 (LRRK2), которая является причиной болезни Паркинсона82. Кроме того, широко распространенное нарушение регуляции miRNA было описано при многих нейрологических нарушениях. Немногие случаи такого нарушения регуляции были охарактеризованы, такие как изменения дозы miRNA, которые возникают вследствие трисомии 21 при синдроме Дауна83 , а ассоциированные с болезнью SNPs по miRNA локусам встречаются при множественном склерозе, болезни Алцгеймера и болезни Паркинсона84, 85.
Специфические miRNAs оказались также сцеплены с определенными нейрологическими заболеваниями. Примеры включают дефицит miR-206, который ускоряет амиотрофический боковой склероз86, дефекты miR-9 встречаются при болезнях спинальных двигательных нейронов87, а уровни miR-19, miR-101 и miR-130, модифицируют пенетрантность спиномозжечковой атаксии типа 1 путем совместной регуляции уровней ataxin 188. В целом, однако с функциональной точки зрения оценка роли нарушения регуляции miRNA при нейрологических заболеваниях строго зависит от того, насколько много известно о молекулярных основах патологии болезни - это может позволить определить, могут ли быть выяснены специфические гены мишени или пути для miRNAs. Напр., при болезни Алцгеймера аномально экспрессирующиеся miRNAs постоянно описываются как подавляющие экспрессию энзима β-secretase 1 (BACE1), это ведет к продукции β-amyloid пептида89-91. miRNAs также, как известно, контролируют воспалительные процессы, которые ведут к развитию множественного склероза92, 93. Наконец, miRNAs регулируют экспрессию α-synuclein94 и E2F1 и продукцию dopamine82; т.о., их аберрантная экспрессия может лежать в основе болезни Паркинсона.
miRNAs in cardiovascular disorders. S Несколько линий доказательств указывают на ключевую роль miRNAs в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тканеспецифическая делеция Dicer у мышей вызывает летальные фенотипы в миокардиальном и сосудистом клонах95, 96. Наиболее многочисленные miRNA в кардиальных миоцитах это miR-1, которые участвуют в развитии сердца97. Эта miRNA оказалась сцепленной с возникновением аритмий, т.к. она подавляла экспрессию генов ионных каналов98. Более того, миокардиальная ткань от пациентов с сердечной недостаточностью обнаруживает отличающийся профиль экспрессии miRNA по сравнению со здоровым миокардом99. miRNAs также играют роль в сосудистых заболеваниях. Здесь образование атеромных бляшек и физиологические фенотипы сосудистых гладкомышечных клеток зависит от правильной экспрессии нескольких miRNAs, таких как miR-10a, miR-145, miR-143 и miR-126100-102. Как и при сердечной недостаточности, признаки экспрессии miRNA отличают сосудистые повреждения от здоровой ткани103. Наконец, SNPs, которые затрагивают сайты связывания miRNA, включая таковые и для miR-1, оказываются ассоциированными с неограниченным мышечным ростом104 и гипертонией105, которые повышают риск сердечно-сосудистых заболеваний.
miRNAs in other diseases. Некоторые моногенные нарушения, как было установлено, имеют аберрантные профили экспрессии miRNA в тех типах тканей, которые имеют отношение к патофизиологии болезней и список их постоянно увеличивается. Помимо дефектов специфических miRNA, лежащих в основе определенных болезней; напр., miR-145 и miR-146a делеции участвуют в фенотипе 5q синдрома106. В дополнение к генетическим мутациям, которые лежат в основе дисфункции miRNA при наследственных болезнях, мы д. также учитывать такие болезни, при которых альтерации эпигенетических меток вызывают неправильную регуляцию экспрессии ncRNA. Недавние исследования болезней выявили нарушение экспрессии miRNAs, которые транскрибировались с CpG островков, с которых экспрессия miRNA регулировалась с помощью DNA methyltransferases (DNMTs). Эта ситуация обнаруживается при иммунодефиците, синдроме нестабильности центромер и лицевых аномалий (ICF), при которых пациенты обладали мутациями в гене, который кодирует DNMT3B107, и при синдрме Rett's, за который ответственны мутации в гене methyl CpG-binding protein 2 (MECP2)108, 109. Нарушение регуляции miRNAs при ICF синдроме также связано с аберрантным профилем гистоновых модификаций107.
Постоянно увеличивается количество miRNAs, связанных с развитием многих др. болезней человека. Напр., присутствие измененных сайтов связывания для miRNAs описано при воспалительной колоректальной болезни Crohn's110, а мутация в miR-96 связана с глухотой111. Очевидно, что примеры, описанные выше это только верхушка айсберга.
Other ncRNAs in non-neoplastic disorders. Др. типы ncRNA также участвуют в болезнях, не связанных с опухолями. Напр., при болезни Алцгеймера консервативный некодирующий антисмысловой транскрипт управляет быстрой feed-forward регуляцией BACE1 (Ref. 112) (Fig. 2). Кроме того, обогащенные по T-UCR локусы наблюдаются в хромосомно несбалансированных регионах, которые ассоциируют с патологией при нарушениях развития нервной системы113. snoRNAs, как было установлено, играют важную роль при нарушениях импринтинга, особенно в тех, что с компонентом нейрального развития, таких как Prader-Willi syndrome (PWS) и синдром Angelman114. Эти нарушения вызываются несколькими генетическими и эпигенетическими механизмами, связанными с импринтируемым локусом 15q11-q13, который содержит кластер тандемно расположенных snoRNAs115, 116. Потеря одной из этих snoRNAs, HBII-52, участвует в возникновении PWS, при котором она изменяет альтернативный сплайсинг мРНК предшественника серотонинового рецептора HTR2C (pre-mRNA)115 (Fig. 2).
Потенциальные связи между др. ncRNAs и болезнями интригующие, но на сегодня предварительные. Нокаутные мышиные модели для белков, которые участвуют в биогенезе piRNA (MIWI1, MILI2 и MIWI23) обнаруживают выраженную реактивацию активности транспозонов, которая, как полагают, ответственна за наблюдаемую стерильность у этих мышей из-за нарушения сперматогенеза
17, 117. Интересно, что у человека SNP в 3'UTR PIWIL4 ассоциирует с повышенным риском нарушения сперматогенеза
118. Наконец, повышенный риск атеросклероза ассоциирует с экспрессией не-полиаденилированной циркулярной ncRNA, которая сцеплена с локусом cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A; также известным как INK4/ARF)
119.
Therapies targeting ncRNAs
ncRNAs и белковые кухни, которые связаны с их биогенезом или активностью, становятся мишенями для новых терапевтических подходов (Fig. 3). Пока большинство работ в этой области проводятся в контексте роли miRNAs в раковых опухолях120. Хотя это только начало, существует значительный интерес к использованию сходных подходов при др. типах заболеваний, как miRNAs , так и др. ncRNAs.
Therapies that inhibit miRNA function. Знание, что miRNAs регулируют свои мишени посредством спаривания оснований, привело к использованию антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) для терапевтического ингибирования функции miRNA. ASOs ингибируют мишени miRNA благодаря комплементарности пар оснований. Разработаны три основных класса ASOs, это locked nucleic acids (LNAs), anti-miRNA oligonucleotides (AMOs) и antagomirs, которые инкорпорируют разные химические модификации для увеличения стабильности и эффективности121-123.
Эффективность ASOs была продемонстрирована в некоторых случаях; напр., у мышей, моделирующих опухоли молочных желез, внутривенные инъекции antagomirs, нацеленных на miR-10b, предупреждают начало метастазирования, супрессируют диссеминацию в легкие124. В контексте сосудисто-сердечных заболеваний, LNAs были нацелены на miR-122, т.е. miRNA которая участвует в регуляции холестеролового и липидного метаболизма. Системное использование этих LNAs, как было установлено, противодействует функции miR-122 в печени, а также снижает уровни холестерола в плазме, без признаков токсичности, способом, который зависит от дозы LNAs122.
Однако замалчивание одиночной miRNA может быть недостаточным во всех случаях из-за плейотропной и многогранной биологии раковых клеток. Недавние исследования в этой области подтвердили, что некоторые miRNAs могут быть ингибированы одновременно при использовании одиночных ASOs, которые нацелены против множественных miRNAs. При таком подходе множественные антисмысловые единицы искусственно преобразуются в одиночную единицу, чтобы продуцировать то, что авт. называют многоцелевые anti-miRNA antisense oligodeoxyribonucleotide (MTg-AMO)125. Один MTg-AMO был разработан для целенаправленного воздействия на miR-21, miR-155 и miR-17-5p, которые являются тремя онкогенными miRNAs, которые обнаруживают избыточную экспрессию во многих опухолях. Использование этого MTg-AMO приводит к усилению ингибирования ракового роста по сравнению как с индивидуальными AMOs , которые нацелены против одиночных miRNA, так и с комбинациями таких одиночно-нацеленных AMOs125.В будущем, MTg-AMOs будут предназначены для одновременного ингибирования функции miRNAs, которые играют роль в управлении несколькими ключевыми аспектами биологии рака: в уклонении от апоптоза, неконтролируемых клеточных делений, ангиогенеза, инновации и метастазирования в ткани.
Др. инновационная стратегия связана с экспрессией конкурентноспособных ингибиторов функции miRNA. Такие 'miRNA sponges' являются векторами, содержащими множественные искусственные сайты связывания miRNA, которые помещаются под контроль сильных промоторов, чтобы продуцировать большие количества транскриптов. Они действуют как губки для соотв. miRNAs, предупреждая их ассоциацию с естественными мишенями126, 127. Эти стратегии были использованы, напр., для ингибирования miR-9 в высоко злокачественных клетках, для демонстрации роли miR-9 в метастазировании127.
Therapies that restore miRNA function. Несколько стратегий предложено, чтобы восстанавливать функцию miRNAs со свойствами опухолевых супрессоров, которые подавляют раковые опухоли. Недавно сообщалось об использовании стратегии, наз. 'miRNA replacement therapy', целью которой является восстановление экспрессии miR-26a в гепатоклеточных карциномах. Аденовирусный вектор был использован для доставки этой miRNA у мышей, моделирующих гепатоклеточную карциному, это приводило к супрессии пролиферации и индукции апоптоза, тем самым подавлялся прогрессивный рост опухоли128. Однако доставка с помощью аденовирусов miRNAs вызывает те же самые затруднения, которые присутствуют при доставке белок-кодирующих генов при большинстве стратегий традиционной генной терапии129.
Большое количество доказательств показывает, что большинство опухолей человека характеризуется дефектами продукции miRNA, что ведет к глобальной понижающей регуляции miRNA. Следовательно, можно предположить, что восстановление глобального miRNAome д. оказывать терапевтический эффект. Глобальное подавление miRNA запускает клеточные трансформации и туморогенез как in vitro, так и in vivo моделях43, 45, 130. Как результат эти находки, предполагают новые 'miRNAome-based' стратегии. Низко-молекулярное лекарство enoxacin усиливает RNAi и способствует процессингу miRNA за счет связывания TARBP2 (Ref. 131). Исследование по проверке принципов на линиях раковых клеток человека и xenografted первичных опухолей показало, что путем глобального восстановления подавленных miRNAs к более 'нормальному' паттерну экспрессии miRNA сопровождает воздействие enoxacin, злокачественный фенотип может быть блокирован132. Лекарство не влияет на нормальные клетки и не вызывает токсичности у мышиных моделей132.
Наконец, др. подход для восстановления глобального miRNAome использовал агенты деметилирующие ДНК и ингибиторы гистоновых деацетилаз. Эти соединения устраняют эпигенетическое замалчивание опухолевых супрессорных ncRNAs, как это было продемонстрировано для miRNAs и T-UCRs, останавливая тем самым опухолевый рост и приводя в конечном итоге к запрограммированной клеточной гибели трансформированных клеток34, 133, 134. Эти агенты, даже в отсутствие какой-либо специфичности к мишеням, сами по себе вызывают терапевтический эффект и вызывают клиническое улучшение при лечении определенных гематологических злокачественных состояний135.
Targeting other types of ncRNAs. Сходные подходы с теми, что описаны выше, по ингибированию функции подавляющих miRNAs может быть использованы для др. ncRNAs, тем самым увеличивается количество терапевтических мишеней. Успешное ингибирование длинных ncRNAs, по-видимому, наиболее затруднительно, по сравнению с miRNAs, в основном из-за их обширной вторичной структуры, хотя нокдаун lincRNAs с использованием siRNAs может быть эффективным24, 136. Сложность lincRNAs означает, что новые биоинформационные инструменты необходимы для получения ингибиторов. Напр., методы, такие как systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) были предложены для идентификации последовательностей РНК, которые соединяются с lincRNAs137. Эта стратегия была уже использована для идентификации последовательностей РНК, которые соединяются с первичными miRNAs (pri-miRNAs; see Fig. 1)138.
Наше всё увеличивающееся знание др. ncRNAs также будет эксплуатироваться для разработки новых терапевтических стратегий не только против рака, но и др. заболеваний. Как упоминалось выше, некодирующие антисмысловые транскрипты регулируют BACE1, критический энзим для болезни Алцгеймера
112. Эта находка и др. привлекают внимание фармакоцевтической и биотехнологической индустрии. Компании и институты, такие как Allen Institute for Brain Science, CuRNA, Regulus Therapeutics, Miragen Therapeutics and Santaris Pharma разрабатывают базирующиеся на ncRNA стратегии против рака, сердечно-сосудистых, нейрологических и мышечных болезней
139. Хотя необходимы дальнейшие исследования, полученные результаты пока на линиях раковых клеток, мышиных моделях и не человекообразных приматах многообещающие. Надеемся, что мощные успехи в ncRNA-базирующейся терапии будут претворены в клинической практике в ближайшем будущем.
Future perspectives
Interest in the contribution of ncRNAs to the genesis and progression of human disorders is booming, but much effort is now required to determine the full extent of this contribution and the mechanisms by which ncRNAs exert their pathological effects.
One important challenge will be to identify all functional ncRNAs that are encoded in the human genome, and emerging genomic, epigenomic and bioinformatic approaches will be crucial in this context. Efforts such as the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) project — which aims to identify all functional elements in the human genome140 — are making important headway. Methods based on second-generation sequencing, such as RNA sequencing, will provide a more detailed picture of the whole human ncRNA transcriptome. Bioinformatic tools for identifying potentially functional ncRNAs will also be important. Because ncRNAs fold into complex secondary structures that are crucial to function, sequence-based alignments alone might not be enough to identify ncRNAs. A number of algorithms that use different approaches have been developed to identify potentially functional ncRNAs (for example, RNAfold, RNAalifold, Pfold, EvoFold, RNAz, QRNA, CMFinder and FOLDALIGN). However, so far, only a few kinds of ncRNA can be identified using these programs, including rRNAs, tRNAs, snoRNAs and miRNAs. In general, several issues make the identification of functional ncRNAs and the assignment of a particular function challenging: for example, the lack of a complete understanding of functional motifs or domains in ncRNAs, the low expression levels of some ncRNAs, and the need for a better definition of their regulatory regions. However, the restricted spatio-temporal expression of many ncRNAs, as well as the binding of transcription factors to non-coding loci2, could be used as evidence of functionality. Furthermore, the purifying selection that acts on ncRNA promoters141 suggests a strictly regulated expression and function that is not expected for transcriptional 'noise' and can therefore be used to infer functionality of an ncRNA.
Specifically in relation to disease, understanding the precise roles of ncRNAs, particularly non-miRNAs, is a key challenge. The development of mice models for single ncRNAs have been useful in relating the altered expression of some of these transcripts to particular human disorders. A good example is a mouse model that conditionally expresses miR-21, which revealed the function of this miRNA as a genuine oncogene142. Similar models could be used to study the potential oncogenic role of other candidates, such as miRNA-372 and miRNA-373143. Biochemical and biological tools, such as antagomirs, have been useful in elucidating the function of miRNAs, and similar tools will be important in studying the function of other ncRNAs. Improved cloning techniques and better approaches for mapping TSSs are also needed to characterize ncRNAs so that these ncRNAs can be studied by overexpression and promoter regulation. For example, rapid amplification of cDNA ends (RACE) methodology has been used to define the origin of transcription of T-UCRs34, but the process is very time consuming. The complete cloning of the full-length transcripts of these ncRNAs might provide further functional clues, along with knock-in and knockout experiments in cellular and animal models.
Finally, expectations in the therapeutic arena have been raised as a result of the recognition of ncRNA defects in human diseases. Molecules based on ncRNAs broaden the universe of potential 'druggable' targets, and important cancer-promoting genes (such as MYC and other transcription factors) that are not considered to be viable conventional drug targets can now be readily inhibited by siRNAs or miRNAs. The first clinical trials using ncRNA-based molecules are underway. However, new approaches are imminent, such as small molecule drugs that target the miRNA machinery. Although there is a long way to go to establish genuine treatments using these latter agents, these approaches might be useful for overcoming a key problem that is faced by traditional cancer therapy: the development of resistance. Drug resistance through mutation of target gene sequences could be a problem for miRNA strategies, just as it is for conventional drugs. However, it would presumably be much more difficult for a cancer cell to resist the actions of drugs that, by targeting the cell's miRNAome as a whole, aim to revert the transformed cell to a more 'normal-like' ncRNA expression profile. The scientific community and pharmaceutical companies must strive harder in pursuit of these new approaches (by using automated large-scale screening of these miRNA-related drugs, developing knock-in and knockout models for the target ncRNAs, and so on). The targeting of other ncRNAs and other human diseases, in addition to miRNAs and cancer, is still in its infancy, but new important developments are expected in this area. Exciting times lie ahead for us.
Сайт создан в системе
uCoz 
