Посещений:
ЗАКРЫТИЕ НЕРВНОЙ ТРУБКИ

Механизмы изменения формы клеток

Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure
Makoto Suzuki, Hitoshi Morita, Naoto Ueno
Development, Growth & Differentiation Special Issue: Neural Development Edited by T. Miyata. Volume 54, Issue 3, pages 266–276, April 2012

During early development of the central nervous system, the neuroepithelial cells undergo dynamic changes in shape, cumulative action of which cause the neural plate to bend mediolaterally to form the neural tube. The apicobasal elongation changes the cuboidal cells into columnar ones, whereas apical constriction minimizes the cell apices, causing them to adopt wedge-like shapes. To achieve the morphological changes required for the formation of a hollow structure, these cellular changes must be controlled in time and space. To date, it is widely accepted that spatial and temporal changes of the cytoskeletal organization are fundamental to epithelial cell shape changes, and that noncetrosomal microtubules assembled along apicobasal axis and actin filaments and non-muscle myosin II at the apical side are central machineries of cell elongation and apical constriction, respectively. Hence, especially in the last decade, intracellular mechanisms regulating these cytoskeletons have been extensively investigated at the molecular level. As a result, several actin-binding proteins, Rho/ROCK pathway, and cell–cell adhesion molecules have been proven to be the central regulators of apical constriction, while the regulatory mechanisms of cell elongation remain obscure. In this review, we first describe the distribution and role of cytoskeleton in cell shape changes during neural tube closure, and then summarize the current knowledge about the intracellular proteins that directly modulate the cytoskeletal organization and thus the neural tube closure.


Рисунки в оригинале статьи

Трехмерное изменение эпителиального слоя является основной стратегией у многоклеточных организмов формировать детально разработанные структуры из простых клеточных слоёв. У позвоночных развитие центральной нервной системы (ЦНС) начинается со слоя плоского эпителия, наз. нервной пластинкой, формируемой в конце гаструляции (Stern 2006), в качестве утолщения эктодермы на дорсальной поверхности эмбриона (Fig. 1A). Нервная пластинка состоит из недифференцированных нейральных предшественников, которые экспрессируют уникальные молекулярные маркеры и обнаруживают четкие межклеточные контакты на своей апикальной стороне. Затем нервная пластинка непрерывно сужается и удлиняется вдоль передне-задней оси, это наз. конвергентным удлинением (Davidson & Keller 1999; Ybot-Gonzalez et al. 2007b). Одновременно боковые края нервной пластинки поднимаются, чтобы сформировать гребни, наз. нервными складками, параллельно передне-задней оси. В ходе дальнейшего развития нервные складки поднимаются ещё больше и заставляют нервную пластинку формировать нейральную борозду (Fig. 1B). Наконец, края нервных складок встречаются по дорсальной срединной линии, где они сливаются, чтобы сформировать полую эпителиальную структуру, нервную трубку, зачаток всей ЦНС, и теперь она оказывается под лежащей поверх поверхностной эктодермой (Karfunkel 1974; Copp et al. 2003) (Fig. 1C). Альтернативно, у костистых рыб и задняя часть др. позвоночных, формирует нервную трубку посредством иного механизма, отличного от описанного выше изгибания эпителия, когда клетки мезенхимных предшественников конденсируются, чтобы сформировать сплошной тяж, которые подвергается трансформации в эпителиальную трубку (Lowery & Sive 2004).
По мере развития эмбриона нейроэпителиальные клетки пролиферируют и дифференцируются, чтобы построить многослойный, хорошо упорядоченный комплекс головного и спинного мозга. Более того, поскольку нервная трубка является одним из первых органов, развивающимся во время эмбриогенеза, и представляет собой эпителиальный морфогенез, то она является прекрасной моделью для изучения принципов поведения эпителиальных клеток и их роли в процессах развития. Неспособность закрытия нервной трубки вызывает врожденные уродства, называемые neural tube defects (NTDs), включая анэнцефалию и spina bifida, которые возникают приблизительно с частотой 1 на 1000 беременностей у человека (Copp et al. 2003).

Cell shape changes in neural tube closure


Во время закрытия нервной трубки нейроэпителиальные клетки драматически меняют свою форму (Karfunkel 1974). Перед нейруляцией форма нейроэпителиальных клеток кубическая (Fig. 2Aa). Затем клетки начинают удлиняться вдоль апикально-базального направления и становятся столбчатыми (Schroeder 1984; Burnside 1971; Schoenwolf & Franks 2009) (Fig. 2Ab). Объём нейроэпителиальных клеток остается относительно постоянным и хотя апикальная и базальная поверхности уменьшаются в одинаковой степени на этой фазе (Burnside 1973). Кроме того, верхушки клеток специфически сужаются и минимизируются, заставляя клетки принимать клинообразную или бутылкообразную форму цилиндров (Fig. 2Ac). Эти движения наз. элонгацией клеток и апикальным сужением, соотв., скоординированные действия которых генерируют основные физические силы, чтобы заставить нервную пластинку изгибаться (Glaser 1914; Karfunkel 1974) (Fig. 2B). Эти базирующиеся на клеточном морфогенезе прирожденные силы ведут к полному закрытию нервной трубки кооперативно с внешними силами, которые генерируются с помощью медиально направленных движений не-нейральной эктодермы (Karfunkel 1974; Hackett et al. 1997; Morita et al. 2012). Удлинение клеток предшествует апикальному сужению, тогда как продолжительность времени, в течение которого два движения перекрываются, варьирует у разных организмов: имеется почти полное перекрывание у Xenopus (Lee et al. 2007a), тогда как у кур и мышей нейроэпителиальные клетки полностью удлиняются перед апикальным сужением (Schoenwolf & Franks 2009). Др. отличительной характеристикой между Xenopus и др. организмами является количество клеточных слоёв в нервной пластинке: нервные пластинки у амниот и urodele амфибий псевдостратифицированы, тогда как нервная пластинка у Xenopus многослойная и только поверхностные клетки подвергаются апикальному сужению и становятся клинообразными (Schroeder 1984).
Чтобы осуществить сложные необходимые морфологические изменения для формирования трубки элонгация клеток и апикальное сужение д. контролироваться во времени и пространстве, но как эти безусловно независимые события регулируются в пространстве и времени на молекулярном уровне неясно.

F-actin/Myosin II


Актиновые филаменты (F-actin) являются основным компонентом цитоскелета, состоят из мономерного актина (G-actin). В нейроэпителиальных клетках, а также в эпителиальных клетках, циркулярные полоски актиновых филамент существуют на апикальных соединениях (Fig. 3A). Во время закрытия нервной трубки эти полоски актиновых филамент утолщаются, когда верхушки клеток становятся наиболее суженными (Baker & Schroeder 1967; Schroeder 1984; Burnside 1971; Karfunkel 1971) (Fig. 3C). Эти наблюдения подтверждают возможность, что полоски актиновых филамент действуют как контрактильный ремешок для затягивания старинного кошелька, вызывая сужение верхушки каждой нейроэпителиальной клетки. Если актиновые филаменты разрушены воздействием cytochalasin, который ингибирует полимеризацию актина, то нейроэпителиальные клетки оказываются неспособны к сужению своих верхушек и становиться клинообразными, несмотря на то. что обработанные клетки остаются удлиненной формы (Karfunkel 1972; Linville & Shepard 1972).
Нейроэпителиальные клетки обладают немышечным миозином II, который соединяется с актиновыми филаментами, представлен двумя тяжелыми цепями, двумя важными легкими цепями и двумя регуляторными легкими цепями (Quintin et al. 1997). Моторная активность миозина II регулируется с помощью фосфорилирования регуляторной myosin light chain (MLC). Rho-associated kinase (ROCK), эффекторная малая GTPase Rho, является основной киназой, которая фосфорилирует MLC. Это фосфорилирование увеличивает АТФазную активность MLC, перемещает миозин II вдоль актиновых филамент и в свою очередь генерирует контрактильные силы между актиновыми филаментами. В нервной пластинке, myosin II располагается апикально и его локализация перекрывается с таковой F-actin (Lee & Nagele 1985; Rolo et al. 2008). У эмбрионов кур воздействие ингибитора миозина II, blebbistatin, вызывает дефекты апикального сужения, приводя к тяжелым NTDs (Kinoshita et al. 2008). Сходным образом у Xenopus его нокдаун с помощью антисмысловых morpholino oligonucleotide (MO) вызывает задержку дефектного развития нервной трубки, обусловленное нарушениями, как конвергентного удлинения, так и изгибания нервной пластинки. У таких нокдаун эмбрионов скоплений F-actin и апикального сужения не происходит (Rolo et al. 2008). Это указывает на то, что актиновый цитоскелет и сократительные силы, генерируемые с помощью немышечного миозина II, являются основными силовым приводом апикального сужения. Поэтому молекулярные аспекты апикального сужения активно исследовались.

Microtubule


Микротрубочки др. важный компонент цитоскелета, как и актиновые филаменты. состоят из α- и β-tubulin. Микротрубочки исходят из центросом, наиболее важного типа microtubule-organizing centers (MTOCs), содержащих γ-tubulin, белок прикрепления минус концов или некоторых нецентросомных сайтов (Job et al. 2003; Musch 2004; Bartolini & Gundersen 2006). В клетках плоской нервной пластинки и в не-нейральнных эктодермальных клетках микротрубочки в основном распределены в кортексе клетки и случайно ориентированы по всей клетке. Однако в нервных клетках, подвергающихся апикобазальному удлинению, микротрубочки полимеризуются и собираются параллельно оси элонгации клетки (Waddington & Perry 2011; Messier 1969; Schroeder 1984; Burnside 1971; Karfunkel 1971, 1972) (Fig. 3B). Помимо этого нецентросомный γ-tubulin распределеяется апикально как плотные облака (Lee et al. 2007a). Это скопление γ-tubulin коррелирует со сборкой мощного апикобазально выровненных рядов микротрубочек, указыая тем самым, что микротрубочки, происходящие из нецентросомного γ-tubulin, участвуют в элонгации нервных клеток (Fig. 3B). В соответствии с этим, если нейроэпителиальные клетки обработать ингибиторами полимеризации микротрубочек, vinblastine и colchicine до того момента времени, когда эти клетки обычно удлиняются, они оказываются неспособными делать это. Разрушение микротрубочек также влияет на клетки, которые уже прошли элонгацию до воздействия, вызывая их округление (Karfunkel 1971, 1972). Более того, ингибитором обработанные эмбрионы ни инициируют и не поддерживают подъем нервных складок, приводя к неспособности к закрытию нервной трубки (Karfunkel 1971, 1972) Т.о., организация микротрубочек важна, как для инициации элонгации клеток, как и для её сохранения, и такое клеточное поведение необходимо для корректного закрытия нервной трубки. Возможные механизмы, с помощью которых микротрубочки влияют на удлинение клеток, предположены Burnside (1971), который предположил, исходя из детальных ЭМ наблюдений, что микротрубочки вносят вклад в элонгацию клеток за счет транспорта цитоплазматических материалов в направлении увеличивающихся концов клетки. Недавнее исследование подтвердило и др. функции микротрубочек в качестве позитивного регулятора межклеточных и клетка-extracellular matrix (ECM) адгезий во время элонгации клеток (Suzuki et al. 1995, discussed later), подразумевая, мультифункциональные эффекты микротрубочек необходимы для удлинения нейроэпителиальных клеток.

Shroom3


Shroom3 впервые был идентифицирован как ген, ответственный за рецессивную, летальную мутацию капкан у мышей, которая вызывала экзэнцефалию и spina bifida, в результате чего нервные складки "грибоподбно" располагались в отдалении от дорсальной срединной линии (Hildebrand & Soriano 1999). Сходные дефекты можно наблюдать у эмбрионов кур и Xenopus при нокдауне генов ортологов с помощью специфических MO и RNAi, соотв. (Haigo et al. 2003; Nishimura & Takeichi 2008). Сегодня функция Shroom3 также была выявлена и на др. моделях изгибания эпителия, включая хрусталики и кишку позвоночных и эмбрионы Drosophila (Hagens et al. 2006; Lee et al. 2009; Bolinger et al. 2010; Chung et al. 2010; Plageman et al. 2010, 2011b), подтверждая консервативную роль Shroom3 в качестве ключевого регулятора изменения формы эпителиальных клеток у метазоа. В нервной пластинке, shroom3 мРНК динамично экспрессируется, отражая пространственный и временной паттерн апикального сужения (Hildebrand & Soriano 1999; Haigo et al. 2003). Однако, как экспрессия shroom3 регулируется транскрипционной известно недостаточно, хотя Pax6 и Pitx1, как было установлено, активируют shroom3 экспрессию в хрусталиковых плакодах и развивающейся кишке, соотв. (Chung et al. 2010; Plageman et al. 2010).
Shroom3 включает PDZ (PSD-95/Dgl/ZO-1) домен на N-конце и два Apx/Shrm домена (ASD1 и ASD2) центрально и на C-конце, которые законсервированы среди генов семейства, состоящего из shroom1-4, и предположительно из EVH1 and PDZ сайтов связывания (Hagens et al. 2006). Shroom3 белок располагается в слипчивых соединения и ко-локализуется с β-catenin и F-actin. У shroom3мутантов и эмбрионов с нокдауном апикальные сужения достоверно ингибируются, это ассоциирует со снижением апикального накопления F-actin и фосфорилированного MLC (pMLC) вдоль апикальных соединений (Hildebrand & Soriano 1999; Haigo et al. 2003; Lee et al. 2007a; Nishimura & Takeichi 2008). Напротив, эктопическая экспрессия Shroom3 вызывает апикальные сужения, апикальное накопление F-actin и pMLC в эмбриональных эпителиальных клетках Xenopus и в клетках MDCK (Haigo et al. 2003; Hildebrand 2005). На молекулярном уровне центральный регион Shroom3, содержащий ASD1, непосредственно связывает F-actin и детерминирует апикальную локализацию, а ASD2 запускает апикальное сужение, тогда как PDZ домен безразличен для активности Shroorm3. Обработка blebbistatin или ROCK ингибитором Y-27632 обращает фенотип сужения, вызываемый избытком функции Shroom3 в MDCK клетках, указывая, что ROCK-индуцированная активность myosin II необходима для Shroom3-индуцируемого апикального сужения (Hildebrand 2005). Однако, у Xenopus, доминантно негативные Rap1a и Rap1GAP ингибируют эктопически индуцированное Shroom3 апикальное сужение, указывая тем самым, что Rap1 GTPase также может действовать ниже Shroom3 (Haigo et al. 2003).
Помимо апикального сужения Shroom3 выполняет важную функцию в элонгации клетки также(Lee et al. 2007a, 2009). Нарушение функции Shroom3 в клетках нервной пластинки с помощью MO или доминантно негативной формы Shroom3 блокирует апикальнобазальную элонгацию. Дефекты клеточной элонгации ассоциированы с неспособностью сборки плотных, апикобазально расположенных микротрубочек, тогда как общее количество микротрубочек не нарушено. Удивительно, нокдаун Shroom3 полностью элиминирует апикальное накопление γ-tubulin в клетках нервной пластинки. Эктопический Shroom3 в эпителиальных клетках бластулы Xenopus достаточен для индукции апикального накопления γ-tubulin, апикобазально расположенных микротрубочек и апикобазального удлинения клеток. Интересно, что общий уровень γ-tubulin не затрагивается нокдауном или избыточной экспрессией Shroom3, и отсутствуют доказательства физического взаимодействия между Shroom3 и ?-tubulin (Lee et al. 2007a). эти наблюдения указывают, что Shroom3 управляет апикобазальной элонгацией путем косвенного рекрутирования нецентросомного γ-tubulin на апикальную сторону и индукции сборки из дискретной популяции микротрубочек, расположенных вдоль апикобазальной оси. Др. белки семейства shroom Shroom1 и Shroom2 экспрессируются в клетках глубокого слоя нервной пластинки Xenopus, которые подвергаются апикобазальной элонгации и обнаруживают активности по рекрутированию передаче сигналов-tubulin на апикальную сторону эпителиальных клеток Xenopus (Fairbank et al. 2006; Lee et al. 2007a). Более того, нокдаун функции Shroom2 блокирует апикобазальную элонгацию в глубоких нейральных клетках, вызывая NTDs (Lee et al. 2009). Эти наблюдения демонстрируют, что семейство Shroom обладает побочной ролью в контроле клеточной элонгации во время закрытия нервной трубки путем скоординированной сборки микротрубочек.

Rho and ROCK


Семейство малых Rho GTPases, включая Rho, Rac и Cdc42, содержит ключевые регуляторы организации актинового цитоскелета и необходимо для разных клеточных функций. включая изменение формы клеток (Jaffe & Hall 2005). Активность белков Rho контролируется путем его связывания с GTP: они активны в GTP-связанном состоянии и неактивны в GDP-связанном состоянии. У эмбрионов кур и Xenopus Rho накапливается в апикальных регионах клеток нервной пластинки, где он перекрывается с F-actin, β-catenin b pMLC (Kinoshita et al. 2008). Ингибирование Rho с помощью Tat-C3 нарушает его апикальное накопление и фосфорилирование MLC и ведет к дефектам закрытия нервной трубки (Kinoshita et al. 2008). Напротив, в клетках MDCK, апикально нацеленная, постоянно активная RhoA вызывает апикальные сужения (Plageman et al. 2011a). Эти RhoA-обусловленные апикальные сужения зависят от функции ROCK и myosin II , т.к. Y-27632 и blebbistatin устраняют в клетках апикальные сужения, соотв. Эти результаты указывают на то, что апикально расположенная активная RhoA необходима и достаточна для обеспечиваемых myosin II апикальных сужений.
Rho-ассоциированные киназы (ROCK1 и ROCK2), serine/threonine протеин киназы, регулируют активность myosin II непосредственно путем фосфорилирования MLC и косвенно путем инактивации миозин фосфатазы (Quintin et al. 1997). Ингибирование ROCKs в эмбрионах кур с помощью Y-27632 вызывает снижение pMLC и нарушает закрытие нервной трубки (Wei et al. 2005; Kinoshita et al. 2008). Интересно, что ROCKs физически взаимодействуют с ASD2 доменов в Shroom3 посредством его центральных регионов (C1 domain), а их взаимодействие необходимо для обеспечиваемого с помощью Shroom3 фосфорилирования MLC в клетках MDCK (Nishimura & Takeichi 2008). Сходным образом доминантно-негативная RhoA ингибирует Shroom3-индуцируемые апикальные сужения (Plageman et al. 2011b). В нервной пластинке ROCK1 локализуется совместно с Shroom3 в апикальных соединениях, а нарушение их взаимодействия с помощью Shroom3 RNAi или мутантного ROCK C1 домена снижает апикальную концентрацию ROCK1 и pMLC и вызывает недостаточность закрытия нервной трубки (Nishimura & Takeichi 2008). Эти результаты указывают на то, что ROCK1 необходима для Shroom3 апикальных соединений и затем ведет к фосфорилированию MLC в зависимости т активности RhoA, и этот процесс необходим для функционирования Shroom3 в апикальных сужениях.
Сходным образом, Shroom3-индуцированное апикальное сужение зависит от апикальной локализации RhoA (Hildebrand 2005). Интересно, что базолатерально направляемая постоянно активная RhoA рекрутирует Shroom3 на базальный конец клетки и индуцирует базальное сужение (Plageman et al. 2011a). В таких клетках адапторный белок плотных соединений ZO-1 локализован неправильно, демонстрируя обратную апикобазальную полярность. Это указывает на то, что хотя апикальное рекрутирование ROCK1 зависит от Shroom3, апикальная локализация Shroom3 зависит от апикально расположенной активной RhoA. Необходимы дополнительные исследования для разрешения взаимодействий между RhoA/ROCK путем и Shroom3 и их значение для апикального сужения.
Во время эмбриогенеза активность Rho регулируется с помощью неканонического Wnt/PCP пути (Wallingford & Habas 1966). В нервной пластинке кур и Xenopus экспрессия доминантно-негативной мутации компонентов Wnt/PCP, Xdd1, XFrz7-dC и XWnt11-dC вызывает снижение апикального накопления Rho, экспансию клеточных верхушек и дефекты нейруляции (Kinoshita et al. 2008). Сходным образом супрессия активности Daam1, медиатора активации Rho в этом пути, вызывает неспособность к апикальным сужениям у эмбрионов Xenopus (Habas et al. 2001; Liu et al. 2011). Эти результаты указывают, что активность Rho в нервной пластинке позитивно регулируется с помощью Wnt/PCP пути. Rho в нервной пластинке также негативно регулируется с помощью p190 RhoGAP, которая стимулирует GTP гидролизующую активность в Rho, чтобы способствовать неактивному состоянию (Jaffe & Hall 2005). У мышей, лишенных p190 RhoGAP, приблизительно 30% гомозиготных эмбрионов обнаруживают дефекты закрытия краниальной части нервной трубки, приводя к экзэнцефалии. Интересно, что мутантные нейроэпителиальные клетки обнаруживают повышенное накопление F-actin на базальной стороне и уменьшение апикальных сужений, подтверждая, что аберрантная активность Rho ассоциирует с аномальными изменениями клеточной формы (Brouns et al. 2000).

Ena/VASP


Ena/VASP это семейство близко родственных, консервативных актин-связываюших белков. У позвоночных имеются три белка паралога, Mena (mammalian enabled), VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein) и EVL (Ena/VASP like) (Krause et al. 2003). Ena/VASP белки имеют консервативную структурную организацию, состоящею из N- и C-терминальных Ena/VASP homology доменов (EVH1 и EVH2) и богатой пролином центральной области. EVH1 домен обеспечивает субклеточную локализацию путем соединения с мотивом D/EFPPPP у партнеров по связыванию, а EVH2 домен обеспечивает связывание G- и F-actin. У мышей, как было установлено, тройные нулевые мутанты (Mena-/-;VASP-/-;EVL-/-) и двойные нулевые мутанты (Mena-/-;VASP-/-;EVL+/+) обнаруживают дефекты закрытия краниальной части нервной трубки, приводя к экзэнцефалии с высокой частотой (Menzies et al. 2004; Kwiatkowski et al. 2007). Т.к. одиночные нулевые мутанты не обнаруживают NTDs, то белки Ena/VASP могут выполнять перекрывающиеся функции у мышей. У Xenopus, ортолог Ena (Xena) экспрессируется на высоком уровне в нервной пластинке, тогда как экспрессия VASP и Xevl довольно слабая (Roffers-Agarwal et al. 1997). Белок Xena локализуется в кортексе клеток нейроэпителия, где он перекрывается с β-catenin и vinculin, партнером по связыванию Ena. Ингибирование Xena с помощью MO ил доминантно негативной формы (dnMena) вызывает неспособность к закрытию нервной трубки, ассоциированную с дефектами в апикальном сужении и апикальном накоплении F-actin (Roffers-Agarwal et al. 1997). Это указывает на то, что Ena регулирует апикальные сужения путем облегчения апикального накопления или ремоделирования F-actin.
Молекулярные механизмы функционирования Ena/VASP в апикальном сужении продемонстрированы на мышах и MDCK клетках. Mena-дефицитные мыши, которые гетерозиготны по др. актин-связывающему белку Profilin I (Mena-/-;profilin I-/+) также обнаруживают дефекты закрытия краниальной части нервной трубки, приводя к экзэнцефалии, подтверждая, что Profilin I участвует в Mena-обеспечиваемых апикальных сужениях (Lanier et al. 1999). Более того, недавнее исследование подтвердило роль Ena/VASP в Shroom3-обеспечиваемом апикальном сужении (Plageman et al. 2010). Shroom3 обладает последовательностью, богатой пролином (FPn), которая отвечает за консенсус сайта связывания EVH1 в Ena/VASP, который является уникальным среди четырех Shroom белков. В MDCK клетках делеционного мутанта Shroom3 с отсутствием сайта связывания EVH1 обнаруживается супрессия активности в апикальном сужении. Напротив, dnMena, состоящий только из EVH1 домена, супрессирует Shroom3-индуцируемые апикальные сужения. В соответствии с этим, dnMena ингибирует апикальные сужения во время инвагинации эпителия в проспективной хрусталиковой ямке (Plageman et al. 2010). Апикальная локализация VASP редуцирована или отсутствует у мутантов Shroom3, а апикальное рекрутирование VASP зависит от сайта связывания EVH1 в Shroom3 в клетках MDCK. Всё это указывает на то, что Ena/VASP физически и функционально взаимодействует с Shroom3 и такое взаимодействие важно для обеспечиваемого Shroom3 апикального сужения и апикального привлечения самой Ena/VASP (Plageman et al. 2010).

Myristoylated alanine-rich C kinase substrate


Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate (MARCKS) и MacMARCKS (также наз. F52 и MRP) близко родственны актин-связывающим, ассоциированным с мембраной белкам (Arbuzova et al. 2002). MARCKS белки имеют базовый эффекторный домен, который фосфорилируется с помощью PKC и взаимодействует с др. молекулами, такими как calmodulin, F-actin и кислые фосфолипиды. Белки MARCKS участвуют в нескольких клеточных событиях, связанных с актиновым цитоскелетом, таких как клеточная подвижность и адгезия (Arbuzova et al. 2002). Роль белков MARCKS в закрытии нервной трубки выявлена при анализе нокаутных мышей (Stumpo et al. 2005; Wu et al. 2001; Chen et al. 1996). 25% гомозигот MARCKS обнаруживает экзэнцефалию и 63-100% (варьирует в независимых исследованиях) MacMARCKS гомозигот обладает неспособностью закрытия нервной трубки и и тяжелыми NTDs, представленными экзэнцефалией и spina bifida. У эмбрионов кур нервная пластинка временно накапливает MARCKS на апикальной стороне во время процесса изгибания (Zolessi & Arruti 2007b). С др. стороны, в клетках MDCK MacMARCKS располагается на базолатеральной мембране и локализуется совместно с E-cadherin (Myat et al. 1998). Детальные механизмы того, как MARCKS и MacMARCKS белки регулируют изменения клеточной формы в нейроэпителиальных клетках остаются неясными.

Epb4.1l5/Lulu


Erythrocyte protein band 4.1-like 5 (Epb4.1l5, также известный как YMO1, Limulus, Lulu, Lulu1, Mosaic Eyes) является членом FERM-доменового семейства. Члены этого семейства связывают белки, ассоциированные с мембранами, с актиновым цитоскелетом. Геном млекопитающих кодирует, по крайней мере, 50 FERM белков, включая актин-связывающие белки ezrin, moesin, merlin (Tepass 2008). Epb4.1l5 имеет одного паралога у млекопитающих Epb4.1l4b (также известен как Ehm2, Lulu2). Оба гена являются ортологами Drosophila FERM белков Yurt и дают две альтернативно сплайсированные изоформы, которые имеют общий FERM и FERM-adjacent (FA) домены на своих N-концах. При скрининге ENU мутагенеза была выделена мутация у мыши, наз. limulus (lulu), при которой нерваная пластинка обнаруживала неравномерную широкую форму и формировала эктопические складки, приводя к неспособности образования закрытия нервной трубки (Lee et al. 2007b). Мутация lulu располагается врнутри домена FERM в Epb4.1l5 и поэтому нарушает обе изоформы. В lulu нейроэпителиальных клетках апикобазальная полярность не изменена, но апикальные скопления F-actin и Myosin II распространяются на базальную сторону, вызывая эктопические активности actomyosin в базальных позициях. Итак, эти наблюдения, что белок Lulu концентрируется на апикальной стороне, подтверждают, что Epb4.1l5/Lulu действует, чтобы закрепить актомиозиновый сократительный аппарат на апикальной мембране, что необходимо для искривления нервной пластинки (Lee et al. 2007b).
В клетках MDCK избыточная экспрессия Epb4.1l5 вызывает апикальные сужения (Nakajima & Tanoue 2009). Сходное уменьшение апикальной области с помощью Epb4.1l5 наблюдается также в др. эпителиальных клетках, включая DLD1, NRK52E и Caco-2 клетки, Активность Epb4.1l5 для апикальных сужений нуждается как в FERM, так и FA доменах, и ни FERM ни FA домен в отдельности не обладает такой способностью. Epb4.1l5-обеспечиваемое апикальное сужение рекрутирует F-actin, myosin II и его фосфорилированные формы в апикальные соединения, а blebbistatin или Y-27632 супрессируют изменения клеточной формы, указывая тем самым, что ROCK-обеспечиваемая активность myosin II необходима для Epb4.1l5-индуцированного апикального сужения, Интересно, что хотя эта ситуация очень сходна с Shroom3, нокдаун Shroom3 не ингибирует ни Epb4.1l5-индуцированные апикальные сужения, ни апикальные скопления pMLC, указывая тем самым, что Epb4.1l5 функционирует независимо от Shroom3 (Nakajima & Tanoue 2009). Детальный механизм Epb4.1l5-индуцированных апикальных сужений неизвестен в деталях. Во время эпителиально-мезенхимного перехода в стимулированных с помощью transforming growth factor (TGF) β NMuMG клетках Epb4.1l5 соединяется с p120-catenin посредством его FERM домена и ингибирует его функцию, чтобы стабилизировать E-cadherin в межклеточных контактах (Hirano et al. 2008). С др. стороны, молекула паралог Epb4.1l4b физически взаимодействует с p114RhoGEF, Rho-specific guanine nucleotide exchanging фактором посредством FERM домена и активирует каталитическую активность p114RhoGEF (Terry et al. 2009). Кроме того, взаимодействие между Epb4.1l4b и p114RhoGEF негативно регулируется с помощью белка апикальной полярности aPKC посредством фосфорилирования FA домена в Epb4.1l4b (Nakajima & Tanoue 2011). Действует ли Epb4.1l5 с p120-catenin, p114RhoGEF и aPKC в нервной пластинке предстоит доказать.

N-cadherin and nectin-2


Помимо внутриклеточных молекул, молекулы клеточной адгезии выполняют критические роли в клеточном морфогенезе при закрытии нервной трубки. Cadherins являются кальций-зависимыми межклеточными адгезивными белками, составляющими крупное семейство из более, чем 100 белков (Suzuki & Takeichi 2010). Внутриклеточно, cadherins соединяются с кортикальным актином посредством α-, β-, ?-, p120-catenins и EPLIN, демонстрируя, что cadherins функционируют по сборке актина независимо от межклеточных контактов (Abe & Takeichi 2008). N-cadherin является одним из членов type I подсемейства, характеризуется 5 внеклеточными cadherin доменами. У позвоночных экспрессия N-cadherin обнаруживается в нервной пластинке и концентрируется в апикальной цитоплазме (Detrick et al. 1990; Fujimori et al. 1990; Radice et al. 2008). Истощение N-cadherin у Xenopus с помощью MO вызывает неспособность закрытия нервной трубки (Nandadasa et al. 2009). MO-получающие клетки обнаруживают экспансию апикальной поверхности, ассоциированную с уменьшением апикального F-actin и pMLC, подтверждая, что N-cadherin необходим для поддержания натяжения клеточного поверхности и контрактильности путем связывания F-actin с апикальным регионом. У мышей, N-cadherin-/- эмбрионы обнаруживают почти нормального вида нейроэпителий и только некоторые эмбрионы обнаруживают неровную поверхность нервной трубки, подтверждая, что дефекты в нервной трубке менее тяжелые, чем те, что у Xenopus (Radice et al. 2008). Однако недавний генетический анализ показал, что двойные гетерозиготные эмбрионы с Shroom3 (Shroom3+/Gt;N-cadherin+/-) обнаруживают экзэнцефалию с умеренной частотой, подтверждая, что N-cadherin действует совместно с Shroom3, чтобы модулировать аппарат цитоскелета, управляющий апикальным сужением (Plageman et al. 2011b).
Др. молекула клеточной адгезии, участвующая в сборке апикального актина с N-cadherin это nectin-2 (Morita et al. 2010). Nectin является членом сверхсемейства immunoglobulin (Ig) и содержит три внеклеточных Ig-подобных домена, однажды пронизывающий трансмембранный домен и мотив связывания для afadin, F-actin-связывающего белка (Takai et al. 2008). Nectin преимущественно располагается в слипчивых соединениях и обеспечивает клеточную адгезию разных типов клеток (Takai et al. 2008). У эмбрионов Xenopus nectin-2 является превалирующей экспрессирующейся формой, среди 4-х членов семейства nectin. С началом нейруляции его экспрессия становится более выраженной в нервной пластинке, где образуются апикальные сужения. Истощение nectin-2 с помощью MO вызывает дефекты закрытия нервной трубки. При нокдауне nectin-2клетки не обнаруживают ни апикальных сужений, ни апикального накопления F-actin. Напротив эктопическая экспрессия nectin-2 вызывает апикальные сужения, сопровождаемые накоплением F-actin в не нейральных эктодермальных клетках. Nectin-2 физически взаимодействует с N-cadherin посредством внеклеточного домена цис-способом и непосредственно рекрутирует N-cadherin в апикальные соединения (Morita et al. 2010). Более того, совместная экспрессия nectin-2 и N-cadherin вызывает апикальные сужения и накопление F-actin более эффективно, а двойной нокаут синергично существенно усиливает неспособность к апикальным сужениям в нервной пластинке. Эти результаты указывают, что nectin-2 действует кооперативно с N-cadherin в апикальных сужениях путем рекрутирования N-cadherin и F-actin в апикальный регион.

MID1/MID2 and Mig12


MID1 и его паралог MID2 кодируют консервативные белки, принадлежащие к RBCC/TRIM (N-terminal RING finger-B box-coiled coil/tripartite motif) сверхсемейству (Short & Cox 1970). MID1 и MID2 ассоциируют с микротрубочками посредством COS (C-terminal subgroup one signature) бокса, мотива, недавно идентифицированного в RBCC белках (Short & Cox1970). Кроме того, оба белка формируют гомо- и гетеродимеры (Buchner et al. 1999; Cainarca et al. 1999) и физически взаимодействуют с Mig12 (Mid1 interacting G12-like protein) (Berti et al. 2004). У человека MID1 ответственен за X-сцепленный Opitz G/BBB синдром, который характеризуется гипертелоризмом, гипоспадией и дополнительными дефектами срединной линии (Quaderi et al. 1997). MID блеки экспрессируются в нервной пластинке человека, мыши, кур и Xenopus (Buchner et al. 1999; Pinson et al. 2004;Granata et al. 2005; Suzuki et al. 1995), а нокдаун MID1 и MID2 или Mig12 с помощью MOs вызывает NTDs у Xenopus (Hayes et al. 2007; Suzuki et al. 1995). У эмбрионов в нокдауне клетки нервной пластинки неспособны подвергаться удлинению клеток и апикальным констрикциям, это ассоциирует с дефектами в апикальном накоплении F-actin и в апикобазальном расположении микротрубочек. Более того, нокдаун эмбрионов вызывает дефекты в апикальной локализации белка ZO-1 плотных соединений, белка слипчивых соединений C-cadherin, и в базальном распределении белка внеклеточного матрикса laminin (Suzuki et al. 1995). Эти результаты подтверждают, что регуляция организации микротрубочек с помощью MID1/MID2/Mig12 комплекса необходима для изменений клеточной формы и эпителиальной целостности в нервной пластинке, а также в др. эпителиальных тканях (Suzuki et al. 1995).

Concluding remarks


In this review, we summarized the role of cytoskeleton and the intracellular and cell adhesion proteins directly modulating the cytoskeletal organization in cell shape changes during neural tube closure. The significance of cytoskeleton in early ЦНС development was proven even at early 70s, but it is only since the twenty-first century when the molecular mechanisms have been investigated in detail. Particularly, in the last decade, Shroom3 and Rho/ROCK pathway have been proven as the central regulators of apical constriction. Moreover, several actin-binding proteins and cell–cell adhesion molecules have been shown to participate in apical F-actin assembly and the activation of non-muscle myosin II. On the other hand, although the regulatory mechanism of cell elongation remains relatively obscure, the recent studies have revealed the importance of Shroom3 and MID proteins in the regulation of microtubules and its cellular role in this process.
What is the next question to be solved? The suggested function of Shroom3 seems to be a key scaffold to recruit Rho/ROCK pathway to the apical junction (Nishimura & Takeichi 2008; Plageman et al. 2011b). However, it is not yet known whether such activity of Shroom3 is regulated post-transcriptionally such as by phosphorylation and/or ubiquitination. Similarly, although Rho/ROCK pathway is active in the neural plate (Kinoshita et al. 2008; Nishimura & Takeichi 2008), which RhoGEF activates Rho, and whether the additional pathway exists upstream of Rho as well as Wnt/PCP pathway are still unclear. Identification of possible upstream factor(s) of the Rho and Shroom3 would be important for full understanding of the molecular bases of the initiation and maintenance of the apical constriction. In addition, to understand spatial and temporal dynamics of cell shape change, addressing how actin-binding and adhesion proteins regulate F-actin assembly in apical side at single molecular level is intriguing.
Furthermore, the possible role of secreted factors is of particular interest. The neural plate expresses a variety of growth factors and morphogen, including bone morphogenetic protein (BMP) and sonic hedgehog and their antagonists. From genetic and in vivo manipulation analyses using mouse and chick embryos, it has been shown that antagonism of BMP signaling and its regulation by sonic hedgehog is necessary and sufficient for correct bending of the neural plate (Ybot-Gonzalez et al. 1996, 2002). BMP blockade by noggin overexpression can induce endocytosis of apical protein Par3 and cell adhesive molecule N-cadherin as a possible cause of apical constriction (Eom et al. 2011). In an independent study (Lee & Harland 2010), disrupting endocytosis with dominant-negative dynamin causes inefficient apical constriction and neural tube closure defects in Xenopus, suggesting that BMP-dependent regulation of intracellular trafficking affects apical constriction. As roles of secreted factors have been also proposed in other apically constricting cells, including bottle cells (Choi & Sokol 2009) and Drosophila mesodermal invagination and eye imaginal disc (Costa et al. 1994; Corrigall et al. 2007; Escudero et al. 2007), it is intriguing to examine other signaling molecules as possible players in cell shape changes, for understanding how neural tube closure is spatially and temporally regulated at the whole tissue level. To answer questions discussed above, comparative approaches with other model systems and quantitative analysis combined with the live imaging analyses in high resolution would be promising approaches.
Сайт создан в системе uCoz