Точная стоихометрия компонентов γTuRC пока неясна. Исследования клеток человека показали, что комплекс содержит множественные копии компонентов γTuSC и GCP4, но лишь единственную копию GCP5 (не установлено число копий GCP6)
. Недавние исследования оценили количественное соотношение компонентов в γTuRC человека, на базе гелей очищенных комплексов и вычислили стоихометрию комплекса как соответствующую 14 копиям γ-tubulin, 12 копиям GCP2 или GCP3, 2-3 копиям GCP4 и одиночной копии GCP5 (Ref. 39). Однако эти количественные соотношения д. рассматриваться как предварительные, поскольку GCP6 присутствует менее, чем одна копия на γTuRC, возникает возможность гетерогенности выборок. Интересно, что стоихометрия, выявляемая в этом исследовании имеет больше γ-tubulins, чем GCP2 и GCP3, указывая тем самым, что небольшая часть γ-tubulin включается в γTuRC независимо от γTuSC.
Было предположено, что γ-tubulin закрепляется (nucleates) путем формирования олигомеров, которые воспроизводят раннюю сборку промежуточного αβ-tubulin, с или боковыми или продольными подобными микротрубочкам контактами пространственной решетки, формируемыми между γ-tubulins. Нуклеация затем д. продолжаться посредством непосредственных взаимодействий γ-tubulin с αβ-tubulin путем lattice-подобных контактов. Генерация моделей расположения γ-tubulin внутри γTuRC и механизма нуклеации микротрубочек, базирующегося на γ-tubulin, следовательно, являются двумя аспектами одной и той же проблемы. Линии доказательств из структурных и биохимических исследований дают некоторую информацию об обеих проблемах.
Хотя модель неотразима по своей простоте, экспериментальных данных недостаточно для определения специфического числа γTuSCs в кольце, возникают вопросы, как пары γ-tubulins внутри γTuSCs могут nucleate микротрубочки с нечетным количеством протофиламент. Существуют две генеральные возможности: шесть γTuSCs (12 γ-tubulins) могут формировать неполное кольцо, давая разрыв на месте тринадцатой протофиламенты, или семь γTuSCs (14 γ-tubulins) могут формировать кольцо с одним избыточным γ-tubulin, который не взаимодействует с микротрубочкой.
Альтернативная гипотеза - модель протофиламент 'protofilament model' - была предложена раньше, согласно ей γ-tubulins д. осуществлять продольные контакты др. с др. вокруг кольца44, 45 (Box 1, see the figure part d). Это кажется разумным, a priori, т.к. продольные контакты значительно сильнее, чем боковые контакты и кольца из продольно взаимодействующих тубулинов и их бактериальные гомологи FtsZ, действительно наблюдались. Более того, ЭМ картины γTuRCs показывают, что структура может быть довольно гибкой, указывая тем самым, что она может быть в принципе развернута, чтобы представлять одиночную протофиламенту из γ-tubulins, которые д. nucleate посредством боковых контактов с α-tubulin и β-tubulin. Однако перевешивают доказательства в пользу модели матрицы.
Хотя матричный механизм нуклеации является доминирующей моделью функционирования γTuRC уже боле 10 лет, он остается недоказанным и остаются несколько важных вопросов. Какой способ взаимодействия (боковой или продольный) между γ-tubulin и αβ-tubulin? Почему способность к нуклеации γ-tubulin слабее в γTuSC, чем в γTuRC и почему
S. cerevisiae, которые имеют только γTuSC, эффективно закладывают (nucleate) микротрубочки? Как образуются микротрубочки из 13 протофиламент, если γ-tubulins вступают в комплекс парами посредством γTuSC? И, наконец, какова структурная и функциональная роль не γ-tubulin компонентов в γTuRC? Некоторые недавние успехи проливают свет на данные вопросы, генерируют более полную основу для понимания закладки микротрубочек на базе γ-tubulin.
Structural insight into γTuRC function
Однако механистическое понимание закладки микротрубочек с помощью γ-tubulin нуждается в структурной модели высокого разрешения γTuRC. Это устрашающая цель. Крупный размер и композиционная сложность γTuRC делают его побуждающей мишенью для рекомбинантной экспрессии и, кстати, лишь небольшие количества гетерогенного материала были очищены из нативных источников (напр., эмбрионов D. melanogaster29, яиц X. laevis24 и клеточных линий человека32). Альтернативная стартегия, которая зародилась недавно, определяет структуры высокого разрешения индивидуальных компонентов γTuRC с помощью кристаллографии и ЭМ и затем интегрирует их в модель γTuRC.
The γ-tubulin crystal structure. Кристаллическая структура мономерного γ-tubulin человека, как было установлено, соединяется с ГТФ и ГДФ10, 46. γ-tubulin очень сходен с α-tubulin и β-tubulin по своей общей укладке, это согласуется с ожиданием, что он способен осуществлять решётко-подобные контакты с микротрубочками. Незначительные различия поверхности микротубулярной решетки могут вызывать различия у γ-tubulin в сродстве взаимодействия по этим сайтам, влияя на силу взаимодействий γ-tubulin-γ-tubulin при сборке или взаимодействий γ-tubulin с микротрубочками. Важно, что в двух γ-tubulin кристаллических формах, индивидуальные γ-tubulins образуют боковые контакты др. с др. посредством одной и той же контактной области, которую ?γ-tubulin использует при боковых взаимодействиях микротрубочек, демонстрируя. что это их предпочтительный способ взаимодействия. Кристаллическая упаковка предоставляет подтверждение модели матрицы нуклеации микротрубочек, которая предсказывает боковые взаимодействия между γ-tubulins и продольные взаимодействия между γ-tubulin и αβ-tubulin.
The structure of the γTuSC. Структура свободных S. cerevisiae γTuSC первоначально была определена в 25 Å с помощью ЭМ негативной окраски одиночных частиц (EM)47 (её V-образная структура была позднее подтверждана с помощью cryo-ЭM высокого разрешения (see below)), и определено расположение и ориентация субъединиц GCP2 и GCP3 в структуре с помощью экспериментов по прямому мечению48. Плечи V-образной структуры состоят из GCP2 и GCP3, которые имеют сходные общие формы и димеризуются посредством своих N-терминальных доменов в основании V-формы. Кончики V-формы содержат γ-tubulin, который взаимодействует с С-терминальными доменами GCP2 и GCP3 (Fig. 2a). Неожиданно, два γ-tubulins в структуре удерживаются в отдалении один от др., и не образуют ожидаемых боковых контактов, которые необходимы для строительства микротубулярной решетки. Это отстранение др. от др. дает частичное объяснение для более слабой nucleating активности свободных γTuSC - каждый γ-tubulin остается в целом независимым скорее, чем формирует ансамбли подобных микротрубочкам промежуточных образований, которые могли бы облегчить сборку микротрубочек. Т.о., структура γTuSC подтверждает, что он находится в 'off' состоянии, это открывает возможность регуляции на уровне конформации γTuSC.
The γTuSC assembles with microtubule-like symmetry. Очищенные S. cerevisiae γTuSCs обнаруживают слабую тенденцию к спонтанной сборке in vitro в кольце-образные структуры, которые сильно напоминают γTuRC49. Кольцевые ансамбли формируются только в узких рангах буферных условий, а их гетерогенность и нестабильность делает их чрезвычайно манящим предметом для выяснения структуры. Однако было открыто, что совместная очистка γTuSC с N-терминальными доменами S. cerevisiae компонента 110 фактора прикрепления веретена к полярным тельцам (Spc110; который соединяет ?TuSC со стержнем полярных телец веретена) драматически стабилизирует сборку ?TuSC. Таким образом, будучи ассоциированными с Spc110, γTuSC кольца продолжают расти, давая удлиненные спиральные филаменты из латерально ассоциированных γTuSCs, это чрезвычайно хорошо соответствует cryo-ЭM реконструкции. В 8 Å структура такой γTuSC филаменты представляет собой прорыв в нашем понимании сборки γTuSC, с важным значением для механизма нуклеации микротрубочек49.
Наиболее замечательным свойством олигомерной структуры γTuSC является то, что существует шесть с половиной γTuSCs на спиральный оборот, благодаря этому половинки субъединиц перекрываются между первой и седьмой субъединицами (Fig. 2b). Это дает 13 γ-tubulins на оборот, это согласуется с числом профиламент микротрубочки in vivo, со спиральным pitch, которые очень сходен с таковым микротрубочек. Имеется удивительное сходство между одиночным кольцом из γTuSC и структурой при низком разрешении γTuRC, это строго подтверждает, что γTuSC ансамбли подобные этим составляют сердцевину γTuRC (Fig. 2c). Эта находка также разрешает парадокс того, как почкующиеся дрожжи эффективно закладывают микротрубочки только с помощью γTuSC - они могут формировать γTuRC-подобные структуры из одних γTuSCs.
При повышенном разрешении структура субъединиц ?TuSC позволяет установить точную ориентацию каждого γ-tubulin. Минус концы обоих γ-tubulins погружены в поверхность взаимодействия с GCP2 или GCP3, а их боковые поверхности обращены лицом к соседним γ-tubulins. Более того, каждый плюс конец γ-tubulin полностью открыт, это строго подтверждает, что эта поверхность взаимодействует с минус концами αβ-tubulin. Комбинация геометрии γ-tubulin и его ориентации предоставляет убедительное доказательство, что γ-tubulin комплексы действуют в качестве матрицы для микротрубочек. В самом деле, γTuSC кольца, скорее всего, обусловливает ограничение степени свободы, которое гарантирует создание микротрубочек из 13 протофиламент in vivo. Важно отметить, что архитектура из 13 складок олигомера определяется почти исключительно конформациями и взаимодействиями между GCP2 и GCP3, при минимальных контактах между γ-tubulins внутри кольца. Проблема того, как может быть создана геометрия микротрубочек с нечетным количеством протофиламент на базе матричных комплексов с четным числом субъединиц также теперь разрешена - половинки-γTuSC перекрываются, гарантируя, что большинство из 13 γ-tubulins открыты для взаимодействия с αβ-tubulin.
Хотя симметрия γ-tubulin в γTuSC кольцах сходна с таковой для αβ-tubulin в микротрубочке, они совпадают не в точности. Не существует крупных конформационных изменений индивидуальных γTuSCs после олигомеризации; два γ-tubulins внутри каждого γTuSC всё ещё ведут себя обособленно. Однако контакты между γ-tubulins соседних γTuSCs в кольце почти идентичны, как в отношении их пространственного расположения, так и относительной ориентации, так что боковые взаимодействия в микротрубочках создают альтернативный паттерн вокруг кольца из контактирующих γ-tubulin пар, разделенных пробелами (Fig. 2d). Важно отметить, что относительная ориентация γ-tubulins в кольце детерминируется в первую очередь посредством взаимодействий между GCP2 и GCP3, которые имеют более значительные области поверхности в контаках, чем γ-tubulins.
Активность по нуклеации Spc110-стабилизированных олигомеров лишь слегка выше, чем гетерогенных γTuSC колец, собранных в отсутствие Spc110 (Ref. 49), и обе обнаруживают значительно более низкие уровни нуклеации по сравнению с γTuRC29. Однако, в условиях, при которых γTuSC остаются мономерными, их активность нуклеации полностью исчезает, указывая тем самым, что сборка γTuSC колец необходима даже для низких уровней активности нуклеации49. Неточное совпадение между геометрией γ-tubulin и геометрией микротрубочки объясняет скромные уровни нуклеации микротрубочек, наблюдаемые у ?TuSC олигомеров, которое возможно возникает из-за правильных пар соответственно расположенных γ-tubulins между γTuSCs.
The GCP4 crystal structure: a model for the GCP family. Важным достижением в направлении полного понимания γ-tubulin комплексов было достигнуто недавно путем определения кристаллической структуры GCP4 человека (Ref. 50). GCP4 имеет уникальную упаковку, образуя удлиненную структуру из пяти ?-спиральных пучков с выраженным перекручиванием (kink) между третьим и четвертым пучками и с небольшим доменом, фланкирующим четвертый и пятый пучки (Fig. 3a). Кристаллическая структура сама по себе неполная, т.к. в ней отсутствуют несколько крупных петель из-за их врожденной гибкости. Несмотря на это, GCP4 удивительно хорошо согласуется с γTuSC cryo-ЭM структурой в позициях GCP2 и GCP3, только необходимо небольшое приспособление в угле изгиба между третьим и четвертым спиральными пучками. Чрезвычайно хорошее совпадение между GCP4 и GCP2 и GCP3 демонстрирует неожиданно сильную консервацию полной укладки в белках семейства GCP. Ранее гомология последовательностей была идентифицирована только в коротких GRIP1 и GRIP2 мотивах белков семейства GCP31-33 (Box 1), но структурное сходство GCP2 и GCP3 с GCP4 требует повторной проверки сходства последовательностей. Используя кристаллическую структуру GCP4 и предсказанные вторичные структуры оставшихся GCPs в качестве гидов, становится возможным более аккуратное построение всего семейства, демонстрирующее небольшие островки законсервированных последовательностей, разбросанные по всему белку. Регионы с наиболее сильной консервацией преимущественно находятся внутри белка, предопределяя структурный стержень с сильно варьирующими регионами петель, позволяющими многочисленные вставки и/или делеции. GCP4 самый короткий из GCPs, почти полностью состоит из гомологичных регионов. Сильная консервация общей упаковки между GCP4 и GCP2 и GCP3, вместе с наиболее обширной гомологией последовательностей, которая теперь доказана, позволяет нам использовать GCP4 в качестве модели основы всех остальных GCPs.
Эта работа продемонстрировала также прямое взаимодействие с высоким сродством между GCP4 и γ-tubulin,демонстрируя не только структурную, но и функциональную консервацию в семействе GCP. Связывающая активность GCP4 локализована внутри его C-терминального домена, который является в точности регионом, противостоящим γ-tubulin, когда GCP4 и γ-tubulin вставлены в γTuSC cryo-ЭM структуру49. Это также согласуется с экспериментами по непосредственному мечению, которые показали, что C-концы GCP2 и GCP3 взаимодействуют с γ-tubulin48. В самом деле, поверхности, участвующие в связывании γ-tubulin, находятся среди наиболее законсервированных в семейства GCP и они включают GRIP2 мотив. Более ранняя работа с белками D. melanogaster также позволила предположить, что γ-tubulin соединяется непосредственно с GCP5 и GCP6 (Ref. 36). Консервация последовательностей и структуры указывает на то, что все GCPs непосредственно связывают γ-tubulin; как будет показано ниже, это имеет важное значение для понимания организации γTuRC.
A pseudo-atomic model of the γTuSC. Используя кристаллическую структуру GCP4 в качестве матрицы, были сгенерированы гомологичные модели GCP2 и GCP3 и вставлены в γTuSC cryo-ЭM структуру вместе с кристаллической структурой γ-tubulin, чтобы создать псевдо-атомную модель γTuSC50 (Fig. 3b). Модель γTuSC предсказывает поверхности, участвующие во взаимодействиях γ-tubulin-GCP2 и γ-tubulin-GCP3. Модель также выявляет позиции GCP GRIP1 и GRIP2 мотивов и подтверждает функции этих мотивов, которые ранее не были известны (Fig. 3c). Мотив GRIP2 безусловно часть γ-tubulin-связывающей поверхности GCPs, это согласуется с in vitro экспериментами по связыванию с использованием GCP4 и γ-tubulin. Роль GRIP1 менее ясна; он образует часть боковой поверхности взаимодействия, подтверждая, что он выполняет роль в сборке γTuSC. Однако он также составляет часть поверхности GCP2 и GCP3, которая открыта на наружной поверхности кольца, подтверждая? что он может быть местом связывания др. белков, которые взаимодействуют с γTuSC.
Псевдо-атомная модель γTuSC также предоставляет информацию о природе сборочных контактов в γTuSC олигомерах (Fig. 3d). Внутри-γTuSC и между-γTuSC взаимодействия с помощью GCP2 и GCP3 очень сходны: существенно, что взаимодействия вдоль основания γTuSC кольца всё тот же самый путь вокруг и прежде всего использует контакты между спиральными пучками i и ii (Fig. 3e). Очевидно, имеется единственное правило сборки, базирующееся на взаимодействиях между GCP2 и GCP3, как внутри, так и между γTuSCs. Изменения этих поверхностей взаимодействий, по-видимому, обладают настроенным сродством давать очень сильные связи, чтобы удерживать вместе индивидуальные γTuSCs, но более слабыми взаимодействиями, которые управляют обратимой сборкой этих γTuSCs в γTuSC кольца.
Conformational regulation of the γTuSC
Неполное совпадение между γ-tubulins в γTuSC кольцах и геометрией микротрубочек интерпретируется как 'off' состояние ?TuSC, при котором комплексы нуклеации полностью собраны, но конформационно неактивны49. Однако γ-tubulins были расположены так, что небольшие перемещения могут перестраивать их в микротрубочки-подобные контакты (Fig. 4a). Ключ к конформационной активации может лежать во врожденной гибкости GCP3, которая наблюдается в виде шарнироподобного движения при ЭМ реконструкциях с негативным окрашиванием47 (Fig. 4b). GCP4, как предсказывает анализ нормальных мод, имеет имеет точку перегиба в позиции, эквивалентной шарниру GCP350 (Fig. 4c). Кристаллическая структура GCP4 дает детальную картину шарнирной точки, позволяя создать более точную модель наблюдаемой гибкости GCP3, которая, по-видимому, базируется на перестройке гидрофобных взаимодействий между доменами на каждой из сторон шарнира. Используя геометрию микротрубочек из 13 протофиламент в качестве основы мы разработали модель активации γTuSC, согласно которой GCP3 выпрямляется в своей шарнирной точке. Подобной перестройки в GCP3 достаточно, чтобы привести два γ-tubulins в γTuSC в точное пространственное расположение микротубулярной решетки49 (Fig. 4d). В контексте γTuSC кольца, выпрямление GCP3 вблизи пробела между каждой парой intra-γTuSC γ-tubulins должно создавать точную матрицу для сборки микротрубочек49 (Fig. 4e).)
Остается протестировать, является ли такое конформационное изменение в GCP3 возможным и если это так, то что может обеспечивать перестройку. Одним из возможных механизмов является пост-трансляционная модификация компонентов γTuSC; в самом деле, все три γTuSC компонента фосфорилируются в разных точках во время клеточного цикла разными киназами, включая cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) и MPS1 (также известна как TTK)51-53. Др. возможность заключается в том, что конформация изменяется благодаря аллостерическим взаимодействиям с белками, связывающимся с γTuSC. Хотя и менее вероятно, но связывание нуклеотидов и гидролиз с помощью γ-tubulin также может играть роль в регуляции конформации комплекса.
Др. возможность заключается в том, что предсказываемое конформационное изменение происходит только после начала роста микротрубочек. Предположительно, пары протофиламент начинают расти из соответственно расположенных в пространстве γ-tubulins между γTuSCs, и затем боковые ассоциации синтезируемых протофиламент управляют выпрямлением GCP3. Регуляция может затем достигаться за счет модификации жесткости шарнира GCP3. Однако рост по этому пути д. быть, по-видимому, менее благоприятным, чем рост из соотвественно сформированного ядра γ-тубулинов с правильной геометрией; и в таком случае γTuRC д. действовать как якорь для минус конца скорее, чем как nucleator.
Конформационная регуляция активности нуклеации не совсем новая концепция. Очень сходный механизм играет роль в нуклеации actin-related protein 2/3 (ARP2/3) комплекса. В этом примере комплекс нуклеации собирается с помощью гомологов актина ARP2 и ARP3, находящихся на удалении др. от др.
54. Комплекс затем активируется с помощью структурной перестройки, которая сводит ARP2 и ARP3 вместе с филаментозный актин (F-actin)-подобными контактами, создавая ядро для роста актиновой филаменты
55, 56. Поразительно, что эволюция, по-видимому, конвергировала сходные механизмы для регуляции активности нуклеации в этих двух совершенно различных системах филамент.
A new model of γTuRC assembly
Недавний прогресс в понимании структур γ-tubulin комплексов привел нас к пересмотру модели γTuRC. Как было описано выше, предыдущая модель сборки γTuRC , постулирующая повторяющееся кольцо из γTuSCs, организованных с помощью каркасной шапочки, состоящей из GCP4, GCP5 и GCP6 (Box 1). Роли GCP4, GCP5 и GCP6 в нашей модели сборки γTuRC д. быть пересмотрены в свете некоторых важных находок. Во-первых, γTuSC спонтанно собираются в кольцевые структуры с симметрией, сходной с таковой в микротрубочках в отсутствие GCP4, GCP5 и GCP6 (Fig. 2), это отличает необходимость каркасной роли этих трех белков. Во-вторых, общая структура и способность связывать γ-tubulin законсервирована у GCP2, GCP3 и GCP4 (Fig. 3), это указывает на то, что все GCPs непосредственно связывают γ-tubulin. В-третьих, единственное правило сборки GCP, по-видимому, определяет взаимодействия между GCPs (Fig. 3e), подтверждая, что все GCPs собираются в γTuRC посредством эквивалентных законсервированных поверхностей.
Структурные роли GCP4, GCP5 и GCP6. В свете этих находок мы предложили новую модель структуры γTuRC, согласно которой GCP4, GCP5 и GCP6 инкорпорируются непосредственно в кольцевую структуру, каждый непосредственно связан с γ-tubulin (Fig. 5). Эта модель прекрасно объясняет, почему наблюдаемое соотношение γ-tubulin к GCP2 и GCP3 значительно больше единицы39. Базируясь на кольцевой структуре γTuSC, область в основании ранней структуры γTuRC, которая первоначально была интерпретирована как каркасная шапочка, по-видимому, состоит из N-терминальных регионов GCPs (Fig. 2c). В самом деле, сходство между структурой γTuRC и кольцевой структурой γTuSC весьма поразительна, указывает на то, что весь γTuRC представлен кольцевыми γTuSC-подобными структурами.
В этой модели GCP4, GCP5 и GCP6 взаимодействуют др. с др. и с GCP2 и GCP3, посредством правила боковой сборки GCP. Можно представить GCP4, GCP5 и GCP6 действующие как γTuSC-подобные комплексы одним из трех способов: как половинка γTuSCs с единственным GCP, связывающим один γ-tubulin; как гибридные γTuSCs, у которых γTuRC-специфические GCP замещают GCP2 или GCP3 в γTuSC; или как совершенно новые γTuSCs, состоящие из двух γTuRC-специфичных GCPs (Fig. 5a). Разные GCPs могут собираться разными способами. Моделирование гомологии высокого разрешения из др. GCPs, базирующиеся на кристаллической структуре GCP4, может оказаться полезным в детерминации, какие GCPs непосредственно взаимодействуют др. с др., а также какие потенциальные ограничения по сборке на некоторых поверхностях (т.е., инсерции в некоторые позиции вблизи боковых поверхностей взаимодействий могут быть предсказаны как мешающие дальнейшей сборке в этом направлении). γ-tubulin-связанные GCP4, GCP5 и GCP6 д. затем замещаться на γTuSC GCPs внутри кольца по правилу сборки для GCP (Fig. 5b).
Позиции GCP4, GCP5 и GCP6 внутри кольца неясны. Хотя они могут в принципе вставляться в любую позицию в кольце, некоторые косвенные доказательства указывают на то, что трое взаимодействуют др. с др. Потеря любого из них GCP4, GCP5 или GCP6 дестабилизирует γTuRCs57-61, подтверждая, что эти GCPs действуют ка единица, чтобы стабилизировать строго очерченное кольцо. Исследования на A. nidulans59 и Schizosaccharomyces pombe62 также продемонстрировали зависимость от иерархической локализации для GCP4, GCP5 и GCP6, показав. что они непосредственно взаимодействуют др. с др. в γTuRC. По нашему мнению лучшим местом положения GCP4, GCP5 и GCP6 д. быть концы кольца, где происходит перекрывание половинок γTuSC. В этом меcте они д. эффективно инициировать или завершать сборку γTuSC и д. стабилизировать кольцо путем взаимодействия с каждым другим в месте перекрывания. Путем взаимодействия др. с др. на концах кольца, GCP4, GCP5 и GCP6 д. быть также способны определять одиночную кольце-образную структуру, как противовес удлиняющимся спиральным филаментам, которые может быть сформированы только из γTuSC.
Структура γTuSC олигомера не выявляет сколько γTuSCs необходимо для формирования сайта нуклеации функциональных микротрубочек - это согласуется с обеими предыдущими моделями, с каждыми 12 γ-tubulins и пробелом или с 14 γ-tubulins и перекрыванием. В соответствии с нашей моделью GCP4, GCP5 и GCP6 на противоположных концах кольца д. взаимодействовать др. с др., это предсказывает, что γTuRC будут также перекрываться, благодаря тому, что GCP4, GCP5 и GCP6 достаточно близки, чтобы взаимодействовать, это также гарантирует образование строго очерченного кольца.
В этой модели, GCP4, GCP5 и GCP6 определяют позицию микротубулярного шва, где происходят αβ-tubulin боковые взаимодействия; в этой позиции одиночное боковое взаимодействие должно быть между γ-tubulin и α-tubulin. Непосредственная стабилизация более слабых α-tubulin-β-tubulin боковых контактов в месте шва д. в принципе играть роль в механизме нуклеации γTuRC. необходимо также отметить, что новая модель γTuRC согласуется только с нуклеацией B-lattice конфигурации (α-tubulin-α-tubulin и β-tubulin-β-tubulin боковые взаимодействия, с исключением α-tubulin-β-tubulin взаимодействий в месте шва, как показано на Fig. 1a), а не с A-lattice конфигурацией (α-tubulin-β-tubulin боковые взаимодействия в каждом месте микротрубочки).
Хотя общая структура и функция связывания γ-tubulin белков семейства GCP законсервированы, остается большое количество вариаций внутри семейства, в основном в форме множественных инсерций и/или делеций последовательностей (Box 1). Эти регионы, скорее всего, ответственны за уникальную функциональность GCPs, и они могут служить для изменения взаимодействий при сборке, чтобы гарантировать включение уникальных сайтов в кольцо и действовать как уникальные места прикрепления, чтобы обеспечить γTuRC-специфическую локализацию.
Roles of GCPs in γTuRC localization. Существует четкое различие между компонентами γTuRC, которые необходимы для его центросомной и его веретенной локализации. Истощение или GCP2 или GCP3 из
D. melanogaster S2 клеток устраняет локализацию γ-tubulin в центросомах и веретенах и ведет к крупным аномалиям в организации микротрубочек. Однако истощение GCP4, GCP5 и GCP6 - или в отдельности или всех вместе - элиминирует веретенную, но не центросомную локализацию γ-tubulin в S2 клетках, а также у дрожжей
A. nidulans57, 59, 63. Неожиданно, клетки, истощенные по GCP4, GCP5 и GCP6 всё ещё были способны вызывать нуклеацию микротрубочек из центросом и собирать митотические веретена. Это вообще-то не так и неожиданно в свете способности γTuSC собирать кольцевые структуры без GCP4, GCP5 и GCP6 (Ref. 49). Эти кольца, хотя и менее стабильны без GCP4, GCP5 и GCP6, могут затем соединяться с центросомами посредством ?TuSC-специфического прикрепления, к которым они могут нуклеировать микротрубочки.
γTuRC attachment and activation
В клетках животных большинство γTuRCs (80%) растворимо в цитоплазме64. Однако их нуклеирующая активность, по-видимому, ограничена специфическими местами в клетке, такими как центросомы или полюса веретена или внутри митотического веретена. Хотя существенное количество белков, как было установлено, соединяются с цитоплазматическими γTuRCs как в интерфазе, так и во время митозов, включая NEDD1, MOZART1, MOZART2A, MOZART2B и NME34-39, ни один из них, по-видимому, не достаточен для стимуляции нуклеации. Это открывает возможность, что связывание γ-tubulin комплексов с помощью факторов закрепления непосредственно индуцирует их нуклеирующую активность. Как обсуждалось выше, один уровень активации возможно связан с конформационным изменением в GCP3, чтобы реорганизовать γ-tubulin геометрию; прямое связывание факторов прикрепления может аллостерически индуцировать предсказуемые конформационные изменения GCP3.
Факторы прикрепления грубо могут быть разделены на две группы, центросомные (или полярных тел веретен) и не-центросомные.
Centrosomal attachment factors. Преимущественный способ центросомного закрепления, по-видимому, осуществляется посредством взаимодействия с компонентами γTuSC, т.к. центросом ная локализация γTuSC не затрагивается в отсутствие др. компонентов γTuRC. Это продемонстрировано у почкующихся дрожжей, которые лишены GCP4, GCP5 и GCP6, а также при нокдауне этих GCPs или в одиночку или всех вместе в клетках животных. Это подтверждает консервативность механизма для управления прикреплением γTuSC к MTOCs, аналогично со способом, с помощью которого фактор прикрепления Spc110 связывает ?TuSC с полярными тельцами веретена у почкующихся дрожжей (Fig. 6a). Когда присутствуют полностью собранные γTuRCs, тогда могут также присутствовать избыточные механизмы прикрепления к центросомам, которые действуют посредством белков. специфических для γTuRC (Fig. 6b).
В случает почкующихся дрожжей прямое соединение с фактором прикрепления Spc110 недостаточно для полной активации γTuSC in vitro, хотя это может быть обусловлено укороченной формой Spc110 (Ref. 49). В клетках животных некоторые центросомные белки были описаны, как связывающие или активирующиеγ-tubulin комплексы, включая pericentrin, centrosome- and Golgi-localized PKN-associated protein (CG-NAP; также известный как AKAP450), ninein, и центросомный белок в 192 kDa (CEP192)65-69. Это все крупные структурные белки, которые формируют двуспиральные взаимодействия и, базируясь на реконструкциях материала около центриолей, в который включены γTuRCs, все они являются предполагаемыми каркасными компонентами этого фиброзного околоцентриолярного матрикса70. Для некоторых из этих белков предположены взаимодействия с GCP2 и GCP3, но неясно является ли эти взаимодействия непосредственными или опосредованными65, 66.
Non-centrosomal attachment factors. В противоположность γTuSC-обеспечиваемой локализации в MTOCs, прикрепление γ-tubulin комплексов к др. местам, по-видимому, зависит в основном от γTuRC-специфических GCPs (Fig. 6c). Недавно открытый из 8 субъединиц augmin комплекс является не центросомным фактором прикрепления γTuRC, который важен для локализации γTuRC внутри митотического веретена63, 71-75. Истощение компонентов augmin ведет к потере локализации γTuRC внутри веретена, но не влияет на его центросомную локализацию63, 72, 73, 76. истощение GCP4, GCP5, GCP6 или NEDD1 также приводит к потере локализации γ-tubulin внутри веретена37, 57, подтверждая, что augmin может взаимодействовать с γTuRC посредством одного или всех этих компонентов77.
Базируясь на этих данных, было предположено, что augmin связывает γTuRCs с поверхностью микротрубочек веретена, где они функционируют как места вторичной нуклеации для дополнительных микротрубочек веретена71. Сходная функция была предположена для mitochondrial translation optimization 1 (Mto1), фактора прикрепления γTuRC, который закрепляется вдоль микротрубочек цитоплазматических массивов делящихся дрожжей62. Регулярное расположение массивов микротрубочек, которое является результатом или Mto1 или augmin сайтов у делящихся дрожжей, в клетках D. melanogaster и человека подтверждает, что γTuRC связан с микротрубочками в определенной геометрии, которая диктует ориентацию только что нуклеированных микротрубочек. Это д. согласоваться с наблюдениями массивов безцентросомных микротрубочек растений, где γTuRC рекрутируются на поверхность существующих микротрубочек и нуклеируют новые микротрубочки с хорошо определенными углами веточек28, 78.
Четкая связь между локализацией γTuRC и активацией нуклеации была продемонстрирован у
S. pombe: где фактор цитоплазматического закрепления Mto1 делетирован, нуклеация цитоплазматических микротрубочек полностью устранялась
62. Др. исследования подтвердили сходную способность к активации для класса белков, который включает Mto1, centrosomin у
D. melanogaster, и CDK5 regulatory subunit-associated protein 2 (CDK5RAP2) и myomegalin у позвоночных
79. В противоположность Mto1, который является специфическими фактором цитоплазматического закрепления, centrosomin, CDK5RAP2 и myomegalin обнаруживаются как на центросомах, так и в цитоплазме, и они, следовательно, участвуют как в центросомном, так и цитоплазматическом рекрутировании γTuRCs. Все эти белки родствены присутствием мотива в ~60 аминокислот, который, который был дублирован в γTuRC-mediated nucleation activator (?TuNA) мотиве
39. Избыточная экспрессия белковых фрагментов, содержащих ?TuNA строго индуцирует нуклеацию цитоплазматических микротрубочек γ-tubulin-зависимым способом у клетках человека и
D. melanogaster39, 80. Более того, γTuNA сам по себе непосредственно связывает γTuRC и существенно усиливает его способность нуклеировать микротрубочки
in vitro, указывая на прямую функциональную связь между локализацией и активацией γTuRC. Остается неясным, как и посредством каких компонентов γTuRC, γTuNA индуцирует активацию микротрубочек, т.к. связывание, по-видимому, происходит только, если присутствуют интактные γTuRC
39.
Conclusions
The recent structural studies described above have enhanced our understanding of γ-tubulin based microtubule nucleation. γ-tubulin complexes have been shown to form microtubule templates that almost certainly nucleate microtubules through longitudinal contacts with α-tubulin and β-tubulin. This activity appears to be regulated, at least in part, through the conformation of GCP3. Which proteins modulate γTuRC activity, and by what mechanism, remains a pressing question in understanding γTuRC regulation. Increasingly, it seems that the attachment, both centrosomal and non-centrosomal, of the γTuRC is correlated with an increase in its nucleating activity; the observation that the small γTuNA motif enhances γTuRC nucleation activity provides another tool for understanding the mechanism of attachment-factor based enhancement and whether this correlates directly with the predicted change in GCP3.
Another major problem to solve in understanding γ-tubulin complex function is the role of nucleotide binding and hydrolysis in nucleation. γ-tubulin and β-tubulin have similar affinities and basal hydrolysis rates for GTP. However, it remains an open question whether the formation of longitudinal contacts with α-tubulin stimulates hydrolysis of the GTP bound by γ-tubulin (as it does for GTP-bound γ-tubulin), and whether hydrolysis weakens the α-tubulin–γ-tubulin interaction (as it does with the α-tubulin–β-tubulin interaction). For example, complete hydrolysis of GTP on the γTuRC could facilitate the release of bound microtubules.
Our revised model for γTuRC assembly, with GCP4, GCP5, and GCP6 interacting with the γTuSC as part of the ring itself, provides a new framework for future studies aimed at elucidating the mechanistic basis of γTuRC function, regulation and localization. In particular, it will now be important to determine the individual functions of GCP4, GCP5 and GCP6, the specific interactions they make with each other and with the ?TuSC, and their positions within the γTuRC. To this end, structural work and modelling of individual components, as well as a higher resolution structure of the γTuRC itself, will be necessary to provide an accurate pseudo-atomic model of the entire γTuRC. This model will doubtless prove to be invaluable in generating specific, testable hypotheses about γTuRC function and regulation.
Сайт создан в системе
uCoz 
