Embryonic stem cells (ESCs) обладают неограниченным потенциалом пролиферировать (самообновляться) и способностью генерировать и дифференцироваться в большинство клеточных типов (плюрипотентность) [1],[2]. Недифференцированное состояние ESC регулируется сетью транскрипционных факторов, напр., OCT4, SOX2, NANOG и KLF4, и эпигенетических модификаторов, которы способствуют экспрессии ESC-специфических генов и супрессируют дифференцировку [3]–[7]. Введение экзогенных транскрипционных факторов, таких как OCT4, SOX2, NANOG и KLF4 во взрослые клетки мыши и человека вызывает их плюрипотентность в результате репрограммирования этих клеток в индуцированные плюрипотентсные стволовые клетки (iPSCs), которые функционально и фенотипически сходны с ESCs [8],[9].

Способность ESCs к самообновлению и поддержанию плюрипотентности связана со способностью этих клеток оставаться в пролиферативном состоянии. ESCs проходят через укороченный клеточный цикл, приводящий к быстрому клеточному делению [10]–[12], характеризующемуся укороченной G1 фазой, повышенной экспрессией G1-ассоциированных cyclins, активных cyclin-dependent kinases (CDKs), и низкими уровнями белков ингибиторов клеточного цикла p21, p27 и p57 [13]. Во время дифференцировки в эмбриоидные тела мышиные ESCs (mESCs) накапливаются в G1 и обнаруживают удлинение клеточного цикла с 8–10 ч до более чем 16 ч, как наблюдается во взрослых клетках [14]. При создании iPSCs, многие исследования показали более эффективное перепрограммирование клеток с нефункционалными ARF/p53 путями и повышенной клеточной пролиферацией, укорочением G1 и отсутствием КПП (checkpoints) клеточного цикла [15]–[20]. Дополнительные исследования выявили несколько малых некодирующих РНК, которые играют роль в реглуяции клеточного цикла и контроле статуса ESC [21]. MicroRNAs (miRNAs) небольшие некодирующие РНК из 21–23 нуклеотидов в длину, которые регулируют экспрессию генов, обычно на посттранскрипционном уровне [22]. Специфические мРНК регулируют самообновление, плюрипотентность и стабильность mESC [23],[24], а некоторые дифференциально экспрессируются в ESCs человека (hESCs) [25],[26].

Воздействие на hESCs сигналов, обусловливающих дифференцировку, чтобы переключить ацетилирование, стабилизирует белок p53. Активация p53 удлиняет G1 фазу клеточного цикла путем индукции p21 и увеличивает miR-34a и miR-145, которые поставляют специфические для стволовых клеток факторы для репрессии. Эти функции p53 осуществляются, как только эктопически экспрессируемый p53 связывает эти хроматиновые мишени и вызывает спонтанную дифференцировку без добавления ретиноевой кислоты (RA). Комбинированные эффекты p53 не только противодействуют самообновлению и плюрипотентности, но и также выполняют активную роль в подержке дифференцировки hESCs.

Здесь мы показали, что p53 играет важную роль в активной поддержке дифференцировки hESCs. Мы установили, что перед дифференцировкой p53 экспрессируется на очень низких уровнях в hESCs, удерживаемый с помощью двух негативных регуляторов, HDM2 и TRIM24, которые запускают деградацию p53. После индукции дифференцировки lysine 373 в p53 ацетилируется и это нарушает существующие взаимодействия с негативными регуляторами, и в результате становится возможной стабилизация и активация p53. Активный p53, в свою очередь, способствует экспрессии регулятора клеточного цикла p21, чтобы затормозить клеточный цикл hESC; клетки накапливаются в gap (G1) фазе клеточного цикла, предупреждающей деление. Параллельно p53 активирует специфические микроРНК, miR-34a и miR-145, которые ингибируют экспрессию некоторых факторов стволовых клеток и удерживают дифференцированные клетки от соскальзывания обратно в плюрипотентность. Полученные результаты подчеркивают новую функцию p53 в предопределении состояния стволовых клеток человека.

Discussion

TP53 мутантен в более чем половине всех раковых опухолей человека и поддерживает геномную стабильность в соматических клетках прежде всего как чувствительный к стрессам регулятор транскрипции генов, которые контролируют арест клеточного цикла и апоптоз [60],[61]. Функции p53 в клеточном метаболизме, гомеостазе и развитии менее изучены, но всё более оцениваются по достоинству [62],[63]. В стволовых клетках взрослых p53 негативно регулирует пролиферацию и самообновление нервных стволовых клеток и гематопоэтических стволовых клеток, удерживая их в покоящемся состоянии [64],[65]. Роль p53 в модуляции ESC впервые была предположена в сообщении, показавшем, что p53 непосредственно репрессируетs Nanog в mESCs [40]. Сходным образом p53 участие в апоптозе и дифференцировке hESCs было уже описано, но механизм оставлася неясным [66],[67].

Здесь мы показали, что p53 активно способствует дифференцировке hESCs и делает это с помощью механизмов, отличных от прямой регуляции транскрипции NANOG (Figure 7). В противоположность mESCs, человеческий p53 располагается в ядре hESCs в низких концентрациях и в деацетилированном состоянии. В ответ на сигналы дифференцировки, SIRT1 подавляется [33], делается возможным ацетилирование p53 по Lys373, мишени CBP/p300. Ацетилирование p53 активирует его функции в качестве транскрипционного фактора [68] и освобождает p53 от HDM2- и TRIM24 (shown here)–обусловленного убиквитилирования и деградации [34]. Важность концентрации p53 и его регуляции была показано с помощью достоверных уровней дифференцировки, которая происходит или в ответ на siRNA-обусловленную деплецию MDM2 и TRIM24 или за счет эктопической экспрессии p53. В этих случаях дифференцировка появляется в отсутствие RA и в среде, которая обычно поддерживает стволовые клетки как таковые.

Figure 7. Model depicting role of p53 in inducing differentiation of hESCs.
In pluripotent hESCs, p53 is negatively regulated by HDM2 and TRIM24. Differentiation induces acetylation at Lys373 of p53 via CBP/p300, p53K373ac then activates transcription by binding to p53REs on CDKN1A (p21), miR-34a, and miR-145. Induction of p21 leads to p53-dependent elongation of G1 phase, whereas induction of miR-34a supports G1 elongation, blocks deactivation of p53 by targeting the deacetylase SIRT1, and counteracts pluripotency by targeting LIN28A. On the other hand, miR-145 targets OCT4, KLF4, and SOX2 and antagonize pluripotency. Thus, p53 exerts a cumulative pro-differentiation effect by elongating hESC G1 phase via p21 and synergistically up-regulating miR-34a and miR-145 to counteract pluripotency. Ub, ubiquitin.

Сравнение профилей клеточного цикла во время RA-обеспечиваемой дифференцировки и в условиях повреждения ДНК подчеркивает различие ролей, выполняемых p53 по ограничению клеточного деления и иницииации или дифференцировки или репарации ДНК, соотв. Дифференцировкой активированный p53 соединяется с p53REs нижестоящего гена мишени CDKN1A, чтобы обеспечить G1 блок, который эффективно удлиняет G1 и удлиняет клеточный цикл hESCs, с минимальной индукцией апоптоза. Паттерн посттрансляционных модификаций p53 и накопление клеток hESCs в G1, вызванные с помощью RA, находятся в контрасте с арестом Adr-обработанных hESCs в фазе G2–M клеточного цикла в классической, p53-обусловленной реакции на повреждение ДНК [60]. Мы установили, что p53, временно активируется во время дифференцировки, регулирует клеточный цикл, но не вызывает существенного апоптоза. Хотя избирательность p53 в активации ареста клеточного цикла в противовес апоптозу остается неполностью ясной [30], наши находки, что дифференцировка hESC воспроизводит специфичность, ранее продемонстрированную на мышиных моделях, которые экспрессировали специфические точновые мутации p53 [48],[69] и подтверждают, что эти механизмы высоко консервативны. Дифференцировка hESCs существенно задерживается, когда уровни TP53 и/или CDKN1A снижены, как показывает AP окрашивание, анализ клеточного цикла и экспрессия маркеров плюрипотентновсти в hESCs, трансфицированных siRNAs. Недавно, Dox-индуцибельная экзогенная экспрессия p21 в hESCs, как было установлено, вызывает арест клеточного цикла и массивную дифференцировку hESC [70], это подтверждает, что индуцированные уровни p21 и контроль клеточного цикла необходимы для дифференцировки hESCs.

Ряд нижестоящих генов мишеней для p53 активно исследовался, особенно в трансформированных клетках, и теперь идентифицированы некодирующие РНК, регулируемые с помощью p53 [71]. Роль miRNAs во время дифференцировки hESC или репрограммирования соматических клеток недавно была описана [24],[53],[72]–[76], при этом специфические сигнатуры miRNAs, обнаруживаемые при разных состояниях стволовых клеток, регулируются с помощью p53 [77]. Известная p53 мишень, miR-34a, как было установлено, усиливает активацию p53 путем репрессии SIRT1 в культивируемых клетках [49], но ранее не связывалась с hESCs. miR-145 была открыта как прямой репрессор факторов плюрипотентности, но не было установлено, что она регулируется с помощью p53 в стволовых клетках [53]. Здесь мы показали, что p53 активирует экспрессию miR-34a и miR-145 во время RA-обеспечиваемой дифференцировки hESCs. Экспрессия этих miRNAs, непосредственно индуцируется с помощью взаимодействия p53 с p53REs хромтина, и воздействует на сеть транскриптов мишеней, которые контролируют плюрипотентность прямо или косвенно. Далее Choi et al. [78] было показано, что miR-34a обеспечивает барьер репрограммированию в соматических клетках. Это исследование подтверждает нашу находку, что miR-34a противодействует плюрипотентности hESCs и обладает функциями, способствующими дифференцировке, в биологии стволовых клеток. Мы установили, что miR-145 выполняет более важную роль в дифференцировке hESCs, при этом miR-34a действует для усиления её функции. Однако поскольку повреждения ДНК индуцируют miRNAs miR-34a и miR-145, но не способствуют накоплению hESCs в G1 и дифференцировкеf hESCs, как это наблюдается при воздействии RA или эктопической экспрессии p53, становится ясно, что miRNAs сами по себе недостаточны, чтобы индуцировать дифференцировку hESCs. Мы показали, что активация p53 временная во время дифференцировки hESCs; т.о., активация miRNAs, которая репрессирует экспрессию фактора стволовых клеток, расширяет воздействие активации p53 и может предупреждать “соскальзывание” к плюрипотентности, как только p53 возвращается к своей обычно низкой концентрации, к детерминированному состоянию.

Недавно создание TP53^-/- hESCs с помощью гомологичной рекомбинации показало, что потеря p53 способствует плюрипотентности, роль p53 законсервирована как мышиных, так и человеческих ESCs [79]. Однако, TP53^-/- hESCs вносят вклад во все три зародышевых слоя во время образования тератом у SCID мышей, вообще-то из-за компенсации с помощью структурно сходных членов p53 семейства , p63 и p73. Делеция всех p63 и p73 изоформ у мышей показала критическую роль их в развитии и дифференцировке [80],[81]. p63 и p73 могут соединяться с каноничесткими ДНК местами связывания p53 и регулировать транскрипцию с чувствительных к p53 промоторов, в присутствии или отсутствии самого p53 [82]–[84]. Компенсация может быть неполной, поскольку p53-нулевые мыши обладают некоторым аномалиями развития, такими как высокий процент экзэнцефалии у самок, и специфические гены обнаруживают измененную p53-регулируемую генную экспрессию во время развития [85]–[87].

Становление удлиненной Gap-фазы в стволовых клетках довольрно сходно с таковым в соматических клетках, ранее было предположено, что это необходимо для восприятия сигналов дифференцировки [11]. Наше исследование показало, что p53 является интегралом этого процесса и активно способствует дифференцировке hESCs, в отсутствие клеточных стрессов и повреждений ДНК. Коллективные эффекты активации p53 удлиняют G1 фазу и противодействуют плюрипотентности путем индукции miR-34a и miR-145 (Figure 7). Важно, что активация p53 во время дифференцировки hESCs временная, это позволяет позднее расти и дифференцироваться, поскольку индуцированные с помощью p53 miRNAs регулируют сеть генов, которые поддерживают продвижение вперед к дифференцировке.