Путь фототрансдукции у Drosophila активно исследовался [1] и большинство известных членов пути было выделено с помощью передового генетического скрининга посредством electroretinogram (ERG) и фототактических методов [2]-[6]. Предыдущие скрининги проводили на гомозиготных жизнеспособных мутантах. Эта стратегия оказалась высоко эффективной и привела к характеризации многочисленных белков, которые играют критическую роль в реакции на свет. Однако каскад фототрансдукции, скорее всего, также базируется на компонентах, которые являются общими др. процессами, которые существенны для жизнеспособности. Поэтому мы начали скрининг крупных мозаичных ERG летальных мутаций на Х хромосоме. Здесь мы охарактеризуем Calmodulin-связывающий белок, родственный Rab3 GDP/GTP exchange protein (Crag).

Ген Crag впервые был идентифицирован при биохимическом скрининге фоторецепторов по Calmodulin (CaM)-связывающим белкам [7]. Crag содержит сайт связывания CaM и взаимодействует с CaM зависимым от кальция образом [7],[8]. Мутации в гене Crag, как было установлено, затрагивают эпителиальную архитектуру и поляризованное расположение белков базальной мембраны, включая Perlecan, Laminin и Collagen IV [8]. Базируясь на гомологии последовательности, N-конец Crag содержит три консервативных домена: uDENN, DENN и dDENN и принадлежит к сверхсемейству белков DENN (differentially expressed in neoplastic and normal cells) [9]. Первый член семейства DENN был идентифицирован при скрининге варьирующей экспрессии мРНК в неопластических клетках [10], и 18 генов, кодирующих DENN доменовые белки, присутствуют в геноме человека. DENND4A, DENND4B и DENND4C являются человеческими гомологами Crag, но их клеточная функция в системах млекопитающих не охарактеризована. Многие DENN-домен содержащие белки были найдены непосредственно взаимодействующими и функционирующими как guanine nucleotide exchange factors (GEFs) разных Rab белков [11]. Белок DENN/MADD был найден как GEF для Rab3 и Rab27 [12],[13], тогда как Connecdenn был найден как GEF для Rab35 [14]. Более того, поиск по всему геному выявил, что большинство DENN белков являются GEFs [15]. Однако ни один из DENN белков не был идентифицирован как GEFs для Rab11.

Rabs располагаются в определенных внутриклеточных мембранах [16],[17], где происходят переключение между неактивным (GDP-bound) и активным (GTP-bound) конформационным состоянием и реакции на различные сигнальные импульсы. В активном состоянии Rab белки взаимодействуют со своими эффекторами и регулируют доставку пузырьков через многочисленные разные ступени [16]. GEFs соединяются с неактивными Rabs и облегчают замену GDP на GTP, активируя тем самым Rabs.

Rab11, как было установлено, затрагивает многие клеточные процессы. Она обеспечивает рециклинг белков путем регуляции мембранного транспорта от recycling эндосом [18]. Она присутствует в trans-Golgi network (TGN) и post-Golgi пузырьках, где она необходима для мембранного транспорта из TGN в плазматическую мембрану [19]. В поляризованных MDCK клетках, Rab11 необходима для апикального рециклинга и трансцитоза из базолатеральных в апикальные части рецепторов иммуноглобулинов [20]-[22]. В подвижных клетках Rab11 необходима для транспорта интегрина в ведущий край [23]. Во время образования клеток (cellularization) в эмбрионах Drosophila, Rab11 необходима для роста базолатеральных частей мембран [24]. Rab11, как было установлено, соединяется с субъединицей exocyst комплекса, Sec15, которая регулирует поляризованный транспорт пузырьков в эпителиальных клетках и нейронах [25]-[27]. Однако несмотря на важные клеточные функции Rab11 не выявлено GEF для Rab11.

Родопсины (Rhs) являются сенсорами света фоторецепторных клеток у Drosophila и позвоночных. Rh1 является основным Rh у Drosophila и присутствует в R1-R6 фоторецепторных клетках. После абсорбции фотона (580 nm), Rh1 подвергается конформационному изменению в активную форму, metarhodopsin (metaRh), который, в свою очередь, передает сигналы через G-protein-coupled каскад, который запускает открытие transient receptor potential (TRP) каналов и ведет к деполяризации фоторецепторных клеток [1]. Помимо своей сенсорной роли, Rh1 необходим для образования терминальной сети рабдомера, сетчатой структуры из F-Actin кабелей, которая, как полагают, играет поддерживающую роль в сильно упакованных рабдомерных мембранах [28],[29]. Полная потеря Rh1 вызывает коллапс рабдомерной мембраны в ~90% куколочного развития [30].

Во время развития фоторецепторов, Rh1 синтезируется и созревает в эндоплазматическом ретикулеме, после чего он он транспортируется в рабдомеры посредством Golgi. Нарушения процесса его созревания ведут к тяжелой дегенерации фоторецепторов [31],[32]. Rab11, как было установлено, необходима для доставки после Golgi Rh1 в апикальную рабдомерную мембрану во время развития фоторецепторов. Rab11 локализуется совместно с Rh1 в пузырьках в субабдомерной области, а снижение активности Rab11 вызывает дефекты в морфогенезе рабдомеров и накоплении Rh1-позитивных пузырьков в цитозоле [33],[34]. Однако роль Rab11 в фоторецепторных клетках взрослых и пути фототрансдукции не установлена.

У взрослых мух превращение metaRh1 обратно в Rh1 в ответ на воздействие света в основном происходит в мембране рабдомеров после абсорбции второго фотона (580 nm) [35]. Кроме того, некоторые Rh1 подвергаются эндоцитозу и деградируют посредством лизосомного пути, чтобы убрать мусор спонтанно активированных или фосфорилированных metaRh, тем самым предупреждая дегенерацию фоторецепторов [34],[36]. Как следствие вновь синтезированный Rh1 высвобождается обратно в рабдомеры, чтобы поддержать гомеостаз Rh1, а также общую морфологию рабдомера. Однако неясно, как этот процесс регулируется в ответ на воздействие светом. Наши данные показали, что Crag и Rab11 играют сущест венную роль в регуляции транспорта Rh1 в рабдомерную мембрану после стимуляции светом и притока Ca²⁺.

Discussion

Здесь мы показали, что Crag является новой GEF для Rab11 и что он необходим для транспорта после Golgi Rh1 в рабдомеры во время активации светом (Figures 7G and S10). Этот регулируемый транспорт Rh1, который не зависит от транспорта Rh1 во время развития фоторецепторов, восполняет потерю Rh1, вызванную стимуляцией светом. Потеря Crag ведет к накоплению секреторных пузырьков в цитозоле фоторецепторных клеток и в конечном итоге приводит к зависимой от света и возраста дегенерации фоторецепторов.

Crag Is Required to Maintain Rh1 Homeostasis upon Light Exposure

Во время развития фоторецепторов, Rh1 и др. белки фототрансдукции синтезируются в эндоплазматическом ретикулеме и транспортируются в рабдомеры, чтобы построить функциональные фоторецепторы. Некоторые молекулярные игроки, включая Rab11 и XPORT, как было установлено, участвуют в этом процессе [32],[34]. После активации светом Rh1 превращается в metaRh (Figure S10A). MetaRh затем снова превращается в Rh1 на рабдомерной мембране в результате абсорбции второго фотона, это позволяет поддерживать уровни Rh1 в рабдомерах [35]. В фоторецепторах дикого типа, часть metaRh фосфорилируется и подвергается эндоцитозу [46], и было предположено, что интернализация metaRh способствует освобождению от нефункциональных белков и служит в качестве механизма корректировки (Figure S10B). Интернализованный Rh1 затем деградирует посредством эндосомного/лизосомного пути [36]. Очевидно, что постепенная потеря Rh1 в фоторецепторах дикого типа ведет к необходимости постоянного синтеза Rh1 и восполнения рабдомерного пула. Это прекрасно иллюстрируется потерей retinol dehydrogenase (RDH), которая необходима для регенерации хромофор из Rh1. Потеря RDH ведет к прогрессирующей редукции размера рабдомера и к зависимой от света дегенерации фоторецепторов [50].

Наши данные показали, что Crag необходим для поддержания гомеостаза Rh1 после световой стимуляции. Потеря Crag ведет к накоплению Rh1 в цитозоле и в конечном итоге к дегенерации сетчатки в присутствии света. Мутации в генах, которые влияют на оборот metaRh1, таких как Calmodulin и arrestin 2 [52],[59], ведут к продолжительной деактивации фотореакции. Поскольку как ERGs, так и записи с одиночных клеток мутантных Crag фоторецепторов нормальные, то, мало вероятно, что Crag участвует в рециклинге metaRh1 в Rh1. Чтобы протестировать, необходим ли Crag для транспорта вновь синтезированного Rh1 в фоторецепторах взрослых, мы подвергали воздействию мух голубым светом, чтобы запустить массивный эндоцитоз и деградацию Rh1 и затем измеряли новый синтез и транспорт Rh1 обратно в рабдомеры с течением времени. Crag не нужен для синтеза Rh1. Однако у мутантов Crag вновь синтезируемый Rh1 накапливается в цитозоле. Мы предположили, что Crag необходим для доставки вновь синтезированного Rh1 в рабдомеры и что потеря Crag ведет к постепенному уменьшению размера рабдомеров и дегенерации фоторецепторных клеток (Figure S10C and S10D). В самом деле, временная последовательность и морфологические свойства дегенерации, ассоциированные с потерей Crag оказались очень сходными с фенотипами, наблюдаемыми у RDH мутантов, дальнейшее подтверждение, что Crag участвует в пути синтеза/доставки Rh1.

Crag Is a GEF for Rab11

Rab11 участвует в различных внутриклеточных мембранах процесса доставки. Её разнообразные функции в различных компартментах мембран обеспечиваются посредством нижестоящих эффекторов в зависимом от контекста способом; многие из этих функций были идентифицированы в предыдущем исследовании [60]. Однако, GEFs для Rab11 ни в одном из контекстов не были идентифицированы. Наши данные in vivo и in vitro предоставляют неотразимые доказательства, что Crag является GEF для Rab11. Во-первых, в Drosophila S2 клетках, Crag колокализуется и физически взаимодействует с Rab11. Во-вторых, Crag преимущественно соединяется с GDP-bound формой Rab11, а DENN домены необходимы для связывания. В-третьих, Crag необходим для собственно локализации Rab11 в фоторецепторах после стимуляции светом. В-четвертых, потеря Crag или Rab11 ведет к сходной вызываемой светом дегенерации фоторецепторов. В-пятых, экспрессия Rab11-CA частично устраняет дегенерацию, вызванную мутациями Crag. Наконец, in vitro GEF метод показал, что Crag облегчает высвобождение GDP от Rab11. Ранее было установлено, что Rab11 важна для развития фоторецепторных клеток и транспорта Rh1 во время куколочной стадии [34]. Однако как морфология рабдомеров, так и локализация Rh1 нормальны в Crag клонах, только что вылетевших мух. Сходным образом инициальная закладки TRP также не затрагивается Crag мутациями, что согласуется с предыдущими находками, что Rh1 и TRP совместно транспортируются в рабдомеры во время их развития [32]. Интересно, что цитозольная локализация TRP не обнаруживается в Crag мутантных фоторецепторных клетках, экспозированных светом, указывая тем самым, что во время световой стимуляции динамики Rh1 и TRP различны. В самом деле, интернализация TRP после световой стимуляции не была описана в предыдущих исследованиях. Следовательно, наши данные показывают, что д. существовать др. GEFs для Rab11 во время развития фоторецепторов и что Crag специфически необходим для обмена GDP/GTP в Rab11 во время световой активации у взрослых мух. Кроме того, Crag может функционировать как GEF для Rab10 в др. процессах и клетках, таких как поляризованное отложение белков базальной мембраны в фолликулярных клетках.

Биохимические методы показали, что кинетика активности Crag GEF более медленная, если сравнивать с GEF активностью др. DENN-домен содержащих белков, таких как Rab35 GEF [14]. Crag обладает GEF активностью против Rab10 с более быстрой кинетикой, чем против Rab11, демонстрируя тем самым, что медленная кинетика может быть обусловлена свойствами Rab11. Это в дальнейшем было подтверждено более медленной кинетикой EDTA, которая запускает высвобождение GDP с Rab11. Возможно, что GDP/GTP замена в Rab11 нуждается в др. кофакторах помимо GEF, что, напр., задокументировано для Rab6 [61],[62].

CaM это повсеместно экспрессируемый сенсор кальция [63]. В фоторецепторных клетках Drosphila фотоактивация ведет к притоку Ca²⁺ и активации CaM. Показано, что CaM необходим для завершения фотореакции в несколько ступеней, включая инактивацию TRP и конформационные изменения metaRh [59],[64]. Crag содержт сайт связывания для CaM и взаимодействует с CaM зависимым от кальция способом [7],[8]. В In vitro GEF испытании присутствии CaM и Ca²⁺, в сомом деле, усиливало GEF активность Crag. Следовательно, возможно, что индуцированное светом увеличение внутриклеточного уровня Ca²⁺ усиливает активность Crag посредством связывания CaM. Активация Crag/Rab11 затем может служить для восполнения рабдомерного Rh1, чья потеря также вызывается стимуляцией светом.

DENND4A and Human Photoreceptor Degeneration

В палочковидных фоторецепторах позвоночных поляризованный транспорт Rh обеспечивается post-Golgi пузырьками, которые отпочковываются от TGN и сливаются с основанием наружного сегмента [65],[66]. Rab11 выявлена в несущих родопсин post-Golgi пузырьках в фоторецепторах [67],[68]; Однако пока еще не было показано, что Rab11 необходима для доставки Rh. DENND4 белки, очень сходные с Crag. Экспрессия UAS-human DENND4A конструкции не только устраняет летальность, но и также устраняет индуцированную светом дегенерацию фоторецепторов, вызванную потерей Crag (Figure S9), показывая, что молекулярная функция DENND4A также консервативна. Более того, три разных подтипа синдрома Usher, врожденной болезни, характеризующейся потерей слуха и прогрессирующей потерей зрения, были картированы вблизи локуса DENND4A в 15q22.31 [69]-[71]. Следовательно, DENND4A может также функционировать посредством Rab11 и в фоторецепторах человека, а потеря DENND4A может приводить к дегенерации фоторецепторов.