Зародышевая линия это клеточный клон, который передает генетическую информацию следующему поколению. Генетические и эпигенетические изменения в зародышевой линии нарушают эмбриональное развитие и последующее потомство, так что геномная стабильность зародышевых клеток является критической необходимостью для поддержания, как индивидов, так и видов. Повреждения геномной ДНК обычно возникают как следствие физических и химических воздействий, таких как, воздействие ионизирующей радиацией, генотоксическими реагентами и оксидативными стрессами и т. д. Др. угроза для генома закодирована в самом геноме, а именно мобильные заменяемые элементы, которые перемещаются или амплифицируют сами себя и вставляют в новые позиции генома. У млекопитающих мобильные элементы и их базовые последовательности оккупируют почти половину генома (приблизительно 45% у человека), по сравнению с 1-2% белок кодирующих экзонных последовательностей (Lander et al. 2001; Waterston et al. 2002). Хотя большинство этих мобильных элементов делаются молчащими за счет мутаций и укорочений и т.подобное, некоторые элементы остаются активными и вызывают новые инсерционные мутации. Напр., LINE1, наиболее распространенный класс ретротранспозонов у млекопитающих обладает приблизительно 500 000 копиями на гаплоидный геном и примерно 100 и 3000 из них являются функциональными у человека и мыши соотв. (Kazazian 2004). Такие активные мобильные элементы обычно экспрессируются в зародышевой линии, где они генерируют новые мобильные копии и передают их в следующее поколение.

Чтобы контролировать такие мутагенные мобильные элементы, геном хозяина развил множественные слои системы молекулярной защиты. У млекопитающих одним из ключевых путей является метилирование ДНК. Мутации, нарушающие подержание DNA methyl transferase, DNMT1, ведут к прекращению молчания транспозонов и к эмбриональной летальности (Li et al. 1992; Walsh et al. 1998), тогда как DNMT3L выполняет более специфическую роль в супрессии ретротранспозонов в зародышевых клетках (Bourc'his & Bestor 2004). Гистоновые модификации также играют существенную роль в эпигенетическом молчании мобильных элементов (Combes & Whitelaw 2010; Mochizuki & Matsui 2010). Др. более адаптивным механизмом защиты, который преимущественно оперирует с мишенями ретротранспозонами посредством RNA interference (RNAi) или родственных систем, которые используют малые некодирующие РНК, которые управляют Argonaute или ассоциированными комплексами, чтобы разрезать или трансляционно супрессировать мРНК мишени. Клетки, в частности, обладают путем Piwi-interacting RNA (piRNA) (Aravin et al. 2006; Girard et al. 2006; Grivna et al. 2006a; Watanabe et al. 2006), при этом Piwi белки из семейства Argonaute являются центральными эффекторами замалчивания ретротранспозонов. Этот путь малых РНК эволюционно консервативен у многих животных и играет критическую роль(и) в супрессии ретротранспозонов во время развития зародышевой линии (Grimson et al. 2008). У млекопитающих, piRNAs довольно обильно экспрессируются в зародышевых клетках самцов, особенно во время постнатального сперматогенеза, хотя piRNAs также обнаруживаются в меньшей степени в зародышевых клетках самцов плодов (gonocytes/prospermatogonia) также как и в развивающихся ооцитах (Aravin et al. 2008; Kuramochi-Miyagawa et al. 2008; Tam et al. 2008; Watanabe et al. 2008). Итак, все мутации потери функции генов пути piRNA, описанные у мышей ведут к стерильности самцов, тогда как самки остаются плодовитыми, указывая на важность этого пути в развитии зародышевой линии самцов млекопитающих. Путь Piwi действует посредством как пост-транскрипционного, так и транскрипционного механизмов, т.e. на уровне РНК и эпигенетических уровнях, чтобы замалчивать ретротранспозоны у мышей (Aravin et al. 2007a,b; Kuramochi-Miyagawa et al. 2008). Это предоставляет интригующую модель РНК-направляемого эпигенетического контроля у млекопитающих, у которых в отличие от растений и дрожжей мало известно о молекулярной функции эндогеных малых РНК в эпигенетической регуляции.

Помимо Piwi белков недавние исследования идентифицировали класс функциональных компонентов пути piRNA, таких как члены семейств Tudor и helicase (Chuma et al. 2003, 2006; Kojima et al. 2009; Reuter et al. 2009; Shoji et al. 2009; Vagin et al. 2009; Wang et al. 2009a; Kuramochi-Miyagawa et al. 2010; Yabuta et al. 2011), и их количество всё ещё увеличивается. Эти компоненты пути Piwi формируют эффекторные RNP ансамбли, которые содержат piRNAs. Кроме того, они также специфически локализуются в цитоплазматических компартментах в зародышевой линии, наз. зародышевыми гранулами/nuage (Eddy 1975). Зародышевые гранулы/nuage обнаружены давно и влияют на спецификацию зародышевой линии у Drosophila и Caenorhabditis elegans, но оставались загадочными структурами в зародышевых клетках млекопитающих (Chuma et al. 2009).

Germ cell development in mammals

У мышей детерминация зародышевой линии происходит в популяции плюрипотентных эпибластных клеток в зависимости от индуктивных сигналов от окружающих соматических клеток (Mclaren 2003). Этот процесс спецификации дает primordial germ cells (PGCs), судьба которых детерминирована к формированию будущих гамет приблизительно на стадии гаструляции эмбрионального развития. PGCs располагаются во внеэмбриональной ткани, аллантоисе, затем мигрируют по собственно эмбриону, чтобы достичь зачатков гонад в средине беременности, где они начинают дифференцировку в зародышевые клетки самцов или самок. У самцов PGCs вступают в арест G1/G0 и становятся про-сперматогониями, тогда как у самок они вступают в мейоз и арестовываются в мейотической профазе I. Про-сперматогонии затем возобновляют митотическую пролиферацию вскоре после рождения и становятся постнатальными сперматогониальными стволовыми клетками, что сопровождается первой волной сперматогенной дифференцировки, которая дает мейотические сперматоциты, гаплоидные округлые сперматиды, затем взрослые сперматозоиды (Yoshida 2010) (Fig. 1). Благодаря непрерывной пролиферации сперматогониальных стволовых клеток и последующей дифференцировке, функциональные сперматозоиды продуцируются в течение всей жизни самцов. У самок, напротив, число ооцитов детерминируется до рождения, а по достижении половой зрелости примордиальные ооциты периодически начинают расти и прогрессивно созревать в функциональные яйцеклетки (Handel & Eppig 1998).

Во время такой дифференцировки зародышевых клеток происходит динамическое эпигенетическое репрограммирование, которое включает глобальное деметилирование ДНК в PGCs, сопровождаемое становлением de novo метилирования ДНК во время дифференцировки зародышевых клеток самцов и самок (Mochizuki & Matsui 2010). Итак, PGCs после выбора ими соотв. судьбы обнаруживают прогрессивное снижение метилирования цитозина по всему геному, сопровождаемое затем вступлением в развитие гонад, родительские импринтируемые гены, также ка и др. кодирующие гены, а также мобильные элементы становятся сильно деметилированными (Hajkova et al. 2002). Как протекает такое деметилирование ДНК, является ли процесс активным или пассивным, ещё предстоит выяснить. Затем после этого геномного стирания метилирования ДНК, происходит метилирование de novo, включая отцовские и материнские паттерны импринтинга восстанавливаются в плодных просперматогониях/гоноцитах у самцов и в постнатальных растущих ооцитах самок (Schaefer et al. 2007). На этой стадии de novo метилирования ДНК в плодных проспематогониях/гоноцитах самцов аппарат piRNA впервые обусловливает молчание ретротранспозонов посредством пути Piwi посредством метилирования ДНК (see below).

Piwi proteins

Центральным стержнем путей всех малых РНК является член семейства белков Argonaute и ассоциированная с ним малая РНК (Carmell et al. 2002). Семейство Argonaute может быть грубо подразделено на Ago и Piwi clades. Члены Ago clade обнаруживаются у почти всех Изученных организмов, от прокариот до эукариот, с заметным исключением в виде почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ago белки повсеместно экспрессируются и связывают ~ 21 nt РНК, подобные microRNAs (miRNAs), и small interfering RNAs (siRNAs). Члены Piwi clade, с др. стороны, обнаруживаются исключительно в гонадах животных и ассоциируют с ~24-30 nt piRNAs (Ghildiyal & Zamore 2009). Мышиный геном кодирует три Piwi белка: MIWI (PIWIL1), MILI (PIWIL2) and MIWI2 (PIWIL4). Mili обнаруживается у обоих полов, тогда как др. два экспрессируются только в зародышевой линии самцов (Kuramochi-Miyagawa et al. 2001). Mili обнаруживает широкий профиль экспрессии от эмбриональных зародышевых клеток самцов на ст. 12.5 dpc (days post coitum) до постнатальных гаплоидных округлых сперматид (Kuramochi-Miyagawa et al. 2004). Остальные два имеют более ограниченные домены экспрессии, при этом Miwi2 присутствует с 14.5 dpc до 3 дня после рождения (P3) (Aravin et al. 2008), тогда как экспрессия Miwi начинается только во время мейоза в пахитенных сперматоцитах (на P14) и достигает пика в округлых сперматидах (Deng & Lin 2002).

Белки Argonaute характеризуются своей сигнатурой PAZ, MID и PIWI доменами (Parker & Barford 2006). Кристаллическая структура древних AGO белков в комплексе с малой нуклеиновой кислотой показала, как PAZ домен распознает 3' конец малой РНК, тогда как 5' конец закреплен в MID домене Argonaute (Wang et al. 2009b). Большинство малых РНК имеют 5' монофосфатный и 3' гидроксильный концы, тогда как в немногих случаях, подобно растительным siRNAs и miRNAs или Drosophila siRNAs, 3' терминальный нуклеотид модифицируется в 2'-O-methyl маркер (Yu et al. 2005; Horwich et al. 2007). Такая модификация 3' конца универсальное свойство piRNAs у всех изученных организмов (Kirino & Mourelatos 2007b). Структурная информация о распознавании модификации с помощью Piwi белков получена с помощью кристаллографии и Nuclear Magnetic Resonance (NMR) структуры Piwi PAZ в комплексе с метилированными РНК лигандами (Simon et al. 2011; Tian et al. 2011). Общая закрученная β-barrel архитектура Piwi PAZ домена сходна с таковой. описанной для др. Argonautes (Sashital & Doudna 2010). Исходя из структцры связанного и не связанного состояния, стало ясно, что метилированный 3' конец piRNAs приспосабливается в предварительно сформированный гидрофобный карман. Неожиданно метильный маркер вносит вклад только скромный вклад во взаимодействие с Piwi PAZ и не создает драматического усиления сродства связывания. Это указывает, что специфическая загрузка piRNAs на Piwi белки не диктуется распознаванием модификации piRNA. Ведущий остаток нуклеиновой кислоты в позиции 1 избирается для основание-специфического контакта с Argonaute (Wang et al. 2009b). В самом деле, кристаллическая структура человеческого Ago2 MID домена подчеркивает важность ригидной петли для спецификации связываемого нуклеотида (Frank et al. 2010). Необходимо посмотреть, существует ли строгое предпочтение для uridine в качестве первого нуклеотида (U1-bias) в последовательностях piRNA как следствие специфического распознавания с помощью Piwi MID домена или результатом механизмов биогенеза piRNA (Aravin et al. 2006; Girard et al. 2006).

Некоторые Argonautes являются small RNA-наводимыми нуклеазами (Slicers), которые могут катализировать отщепление нуклеиновых кислот мишеней, идентифицируемых с помощью взаимодействий пар оснований. Это свойство размещается в RNase-H-подобной складке PIWI домена и предопределяется присутствием каталитической триады DDH (Asp-Asp-His), необходимой для координации ионов магния (Martinez & Tuschl 2004; Meister & Tuschl 2004; Song et al. 2004; Wang et al. 2009b). Каталитическая активность была продемонстрирована биохимически для некоторых Piwi белков (Lau et al. 2006; Saito et al. 2006; Gunawardane et al. 2007; Reuter et al. 2011). Важность in vivo катализа Piwi подчеркивается тем фактом, что одиночная точковая мутация MILI и MIWI каталитического мотива приводит к стерильности мышей, фенокопируя полный нокаут (De Fazio et al. 2011; Reuter et al. 2011). Сходная мутация каталитической триады MIWI2 не нарушает фертильности, указывая тем самым, что MIWI2 должна быть каталитически неактивной (De Fazio et al. 2011). Однако для этого необходимо непосредственно исследовать с помощью биохимических методов. Активность MIWI slicer исследовали, используя очищенные эндогенные MIWI комплексы, и показали необходимость экстенсивного спаривания оснований между piRNA проводником и РНК мишенью (Reuter et al. 2011). Несовпадением между первым нуклеотидом piRNA и мишенью не влияет на катализ, как ожидалось, исходя из его инсерции в MID домен Argonaute. Спаривание оснований между РНК мишенью и остатками piRNA в позициях 2-21 оказалось абсолютно важным для MIWI катализа, что отражает нужду в формировании, по крайней мере, двух витков A-спирали, чтобы создать каталитически компетентную конформацию.

Piwi белки являются уникальными среди Argonautes в использовании пост-трансляционных модификаций, чтобы дать возможность собрать комплекс. Piwis пост-трасляционно модифицируемые с помощью симметричных dimethyl (sDMA) меток по их N-концу (Kirino et al. 2009; Reuter et al. 2009; Vagin et al. 2009), которые катализируются с помощью protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) (Kirino et al. 2009). Такие метки распознаются с помощью доменов Tudor из большого семейства в основном специфичных для гонад Tudor domain-containing proteins (TDRDs) (Heo & Kim 2009; Handler et al. 2011) (see below).

piRNA clusters

Анализ по глубокому секвенированию библиотек piRNA выявил очень сложную природу РНК последовательностей (Aravin et al. 2006; Girard et al. 2006; Grivna et al. 2006a). Это соответствует более нескольких миллионов индивидуальных последовательностей piRNA по сравнению с несколькими сотнями miRNAs. Картирование piRNA выявило геномные кластеры источников этих последовательностей, при этом большинство (более 90%) piRNAs в библиотеке картируется приблизительно в 100 геномных участках. Диапазон кластеров обычно от нескольких kilobases (kb) до более чем 100 kb в длину. Большинство кластеров мыши обнаруживает выраженную асимметрию нити, при этом считывание происходит только с одной нити внутри кластера (uni-strand cluster). Когда piRNAs картируются на обеих нитях, то они делают это не перекрывающимся образом (bidirectional cluster) (Aravin et al. 2006; Girard et al. 2006). В эмбриональных зародышевых клетках piRNAs картируются на обеих нитях (dual strand clusters), но не обнаруживают типичной фазировки, наблюдаемой для siRNAs на двунитчатых предшественниках (Aravin et al. 2008).

Унифицирующим свойством piRNAs у всех организмов является присутствие происходящих из повторов последовательностей. Межгенные регионы и генные транскрипты (в основном экзоны) также вносят вклад в пул piRNA (Aravin et al. 2006, 2008; Girard et al. 2006; Brennecke et al. 2007). В зависимости от стадии, на которой они экспрессируются во время сперматогенеза две самостоятельные популяции piRNA идентифицированы у мышей: пре-пахитенный и пахитенный пул piRNA. Пре-пахитенные piRNAs обогащены (~ 80% в MIWI2) последовательностями, происходящими из повторов, и ассоциируют с MIWI2 и MILI (Aravin et al. 2008). Пахитенные piRNAs, с др. стороны, обладают высокой пропорцией (~ 70%) межгенных, неаннотированных последовательностей с уменьшенным вкладом последовательностей. происходящих из повторов (~ 25%) (Aravin et al. 2006; Girard et al. 2006; Reuter et al. 2011). Пахитенные piRNAs вступают с MILI и MIWI в пахитенные сперматоциты и округлые сперматиды. В отличие от miRNAs, последовательности piRNA-продуцирующих локусов не законсервированы, однако их геномная локализация, по-видимому, очень консервативна от грызунов до человека. Функциональное значение такой синтении пока неясно (Girard et al. 2006).

Primary piRNA biogenesis

RNase III энзим Dicer является ключевым для биогенеза siRNAs и miRNAs из двунитчатых РНК предшественников (Siomi et al. 2011). Однако боле длинный размер piRNAs уже указывает на иной механизм биогенеза, который не зависит от потребности в Dicer (Vagin et al. 2006; Houwing et al. 2007; Saito et al. 2010). Наблюдение, что piRNAs картируются исключительно на одной кластерной нити, ведет к предположению, что длинные однонитчатые предшественники являются источниками piRNAs (Brennecke et al. 2007). Такие нить-специфичные транскрипты обнаруживаются с помощью reverse-transcription coupled polymerase chain reaction (RT-PCR) и RNA-seq анализа (Lau et al. 2006; Reuter et al. 2011). Генетическое подтверждение этому предположению получено на Drosophila, где инсерция P-элемента в предполагаемый промотор кластера piRNA устраняла продукцию piRNA с нижестоящего региона в 180 kb (Brennecke et al. 2007). Продукция piRNAs с таких длинных однонитчатых предшественников пока плохо изучена и ориентировочно наз. первичным биогенезом piRNA (see below).

Как определенные геномные регионы определяются как кластеры piRNA неясно. У C. elegans мотив из специфической последовательности обнаруживается выше piRNA-продуцирующих регионов, но идентификаторы сходных нуклеотидных последовательностей не обнаружены у др. организмов (Ruby et al. 2006). Возможно, что клетки рекрутируют аппарат транскрипции на эти геномные области посредством специфических маркеров хроматина или с помощью включения этих регионов в транскрипционные фактории (Osborne et al. 2004) для скоординированной экспрессии с этих локусов. Это может затем облегчить ко-транскрипционную загрузку кластера транскриптов специфическими РНК-связывающими белками, которые могут быть предшественниками шаперонов для цитоплазматических nuages, которые являются предположительно местом биогенеза piRNA (see below).

Внутри кластера, индивидуальные piRNAs случайно расположены в пространстве и распределены на всю ширину геномного участка. Но в многих регионах с высокой плотностью piRNA, почти каждая одиночная нуклеотидная позиция служит в качестве 5' конца piRNAs. Это указывает на действие двух нуклеаз: эндонуклеазы, которая разрывает длинный транскрипт предшественник, это сопровождается в некоторых локусах перевариванием 5'-3' экзонуклеазой (Fig. 2A). Такие pre-piRNAs затем загружаются на Piwi белки, где 5' pre-piRNA собирается с помощью Piwi MID домена. Наблюдаемая склонность к U1 у piRNAs может быть очень хорошим исходом предпочтения последовательности для эндонуклеазной активности. Однако недавние исследования подчеркивают врожденное свойство самого Argonaute MID домена специфицировать эту склонность (bias). Во-первых, кристаллическая структура Argonaute2 MID домена указывает на присутствие ригидной петли, которая может стать основой специфического для основания распознания первого нуклеотида малой РНК и для проявления предпочтения к уридину (Frank et al. 2010). Во-вторых, in vitro метод загрузки piRNA с Bombyx mori BmN4 клеточным лизатом, U1-содержащие 50 nt РНК оказывались преимущественно загруженными на Piwi белок (Kawaoka et al. 2011). В-третьих, в мышиных piRNA библиотеках, хотя piRNAs начинаются с любого последовательного нуклеотида, выявляются внутри региона кластера высокой плотности, те, что стартуют с U, обнаруживают более высокое изобилие, указывая тем самым, что U1-содержащие piRNAs каким-то образом отлавливаются и обогащаются на Piwi белках.

После инкорпорации на Piwi белки pre-piRNAs обрезаются по 3' с помощью экзонуклеазной активности, этому стерически препятствует связь с Piwi белком, чей отпечаток детерминирует размер зрелой piRNA. Это согласуется с наблюдением, что более 90% пахитенных piRNAs связываются с помощью MILI (~ 26 nt) и MIWI (~ 30 nt)? обладая идентичными 5' концами, но отличаясь по своим 3' концам (Aravin et al. 2006; Reuter et al. 2011). Биохимическая проверка такой экзонуклеазной активности, проводимая in vitro с piRNA с использованием бесклеточной системы насекомых, где Piwi-нагруженная 50 nt pre-piRNA была урезана с 3' до зрелого размера piRNAs (Kawaoka et al. 2011). Хотя неясны качественные характеристики результат 3' урезания связан с зависимой от магния экзонуклеазой. Определение этого 3' конца точно соответствовало метилированию 3' конца зрелой piRNAs с помощью РНК метилтрансферазы Hen1 (Horwich et al. 2007; Kirino & Mourelatos 2007a; Saito et al. 2007; Kawaoka et al. 2011). Модифицированный piRNA 3' конец затем вставлялся в Piwi PAZ домен, чтобы завершить биогенез первичной piRNA .

Secondary piRNA biogenesis

Первоначально описанный у Drosophila, этот путь использует slicer-обеспечиваемое выщепление транскриптов смысловых транспозонов с помощью мушиного Piwi белка Aubergine (Aub), генерирующего 5' конец новой вторичной piRNA, которая вступает в Ago3 (Brennecke et al. 2007; Gunawardane et al. 2007). Эти смысловые piRNAs направляют Ago3 на выщепление транскриптов антисмыслового кластера, чтобы создать ту же самую инициальную Aub-ассоциированную антисмысловую piRNA. Хотя активность Piwi участвует в генерации 5' конца, генерация 3' конца piRNAs, как полагают, использует сходное урезание и метилирующие активности, как описано выше для первичных piRNAs. Обнаруживаются две характерные сигнатуры в популяции piRNA, испытывающей цикл амплификации: во-первых, существенная (более 50%) пропорция Aub- и Ago3-связанных piRNAs указывает на перекрывание их первых 10 нуклеотидов, которые являются результатом биохимический Argonaute slicer активности; во-вторых, поскольку Aub piRNAs обнаруживают строгую U1-склонность, Ago3 piRNAs обнаруживают предпочтение к A в 10-й позиции (A10-bias). Эта модель генетически подтверждается наблюдаемым коллапсом вторичных piRNAs у мутантов ago3 и общей редукцией вступления антисмысловых piRNAs в Aub (Li et al. 2009).

У мышей амплификация piRNA выявляется в пуле препахитенных piRNA (Aravin et al. 2007b, 2008). Ping-pong сигнатуры выявляются в основном между MILI и MIWI2, где первичные piRNAs в MILI приводят к slicer-обусловленной генерации вторичных piRNAs, вступающих в MIWI2 (Aravin et al. 2008; De Fazio et al. 2011). Загрузка MIWI2 разрешает её вступление в ядро и способствует метилированию de novo ДНК траспозоновых элементов (Aravin et al. 2008; De Fazio et al. 2011). Такой путь подтверждается генетическими доказательствами от мутантов, лишенных Mili и Mov10l, где недостаток первичных piRNAs ведет к неправильной локализации незагруженных MIWI2 (Aravin et al. 2008; Zheng et al. 2010). Др. мутанты Tdrd1, Mvh, Tdrd9 и аллель MiliDAH (точковая мутация каталитического мотива DDH), избирательно отключают биогенез вторичных piRNA, приводя к загрузке на MILI интактных piRNAs (Reuter et al. 2009; Shoji et al. 2009; Vagin et al. 2009; Kuramochi-Miyagawa et al. 2010; De Fazio et al. 2011). Неожиданно Miwi2DAH мутанты обладают нормальным сперматогенезом, указывая, что они, скорее всего, не slicer (De Fazio et al. 2011). Эти результаты подтверждают сценарий, где биогенез вторичных piRNA у мышей является линейным с информацией текущей от MILI к MIWI2.

Одиночные Piwi белки могут также амплифицировать piRNAs, на что указывает присутствие сигнатур вторичных piRNA в мышиной Piwi-ассоциированной библиотеке малых РНК (Aravin et al. 2007b, 2008; Berninger et al. 2011). Такие intra-MILI ping-pong сигнатуры редуцированы у мутантов MiliDAH (De Fazio et al. 2011), тогда как intra-MIWI сигнатуры неизменны у MiwiADH мутантов (Reuter et al. 2011). Несмотря на отсутствие каких-либо фенотипов у мутантов Miwi2DAH (De Fazio et al. 2011), мы всё ещё ищем объяснения для описанных intra-MIWI2 ping-pong сигнатур (Aravin et al. 2008).

Важность вторичного биогенеза для замалчивания транспозонов подчеркивается тем фактом, что MIWI2 приспособлена лучше всего к антисмысловым piRNAs, происходящим из повторов (Aravin et al. 2008). В самом деле, у MiliDAH и Tdrd1 мутантов, LINE1 (L1) элементы активируются избирательно, т.к. MIWI2 является хранилищем большинства антисмысловых piRNAs для L1 элементов (Aravin et al. 2008; Reuter et al. 2009; Vagin et al. 2009; De Fazio et al. 2011). Поскольку новые вторичные piRNAs являются источником для существующих смысловых и антисмысловых транскриптов транспозонов, путь амплификации piRNA может формировать профиль piRNA, чтобы отразить угрозу от активных транспозонов. Это сравнимо с адаптивной иммунной системой, где piRNAs, достигающая активных транспозоновых элементов, быстро амплифицируется для обеспечения эффективной реакции (Aravin et al. 2007a; Brennecke et al. 2007). Роль матерями вносимых мушиных piRNAs в инициации цикла умножения piRNA противодействует вновь приобретаемым отцовским транспозонам, подчеркивая пригодность адаптивной иммунной системы, управляемой малыми РНК (Blumenstiel & Hartl 2005; Brennecke et al. 2008).

Tudor family genes in the piRNA pathway

Белки Piwi являются центральными каталитическими компонентами системы piRNA, но они не действуют в одиночестве. Растут доказательства, что Piwi белки формируют крупный эффекторный комплекс, как AGO белки и miRNAs формируют RISC комплекс, чтобы регулировать трансляцию и/или стабильность мРНК (Ghildiyal & Zamore 2009). Первый белок. идентифицированный как взаимодействующий с белком Piwi у мышей, MILI, явился TDRD1, специфичный для зародышевой линии член семейства белков Tudor (Chuma et al. 2003, 2006; Kojima et al. 2009; Reuter et al. 2009; Vagin et al. 2009; Wang et al. 2009a). Гены семейства Tudor в целом кодируют tudor домен(ы), которые распознают диметилированный аргинин белков мишеней (Chen et al. 2011) и они структурно напоминают chromo, agenet, MBT, PWWP и bromo домены (Maurer-Stroh et al. 2003), каждый из которых распознает белковые модификации. В геноме млекопитающих имеется приблизительно 30 генов, которые кодируют tudor домен(ы), с некоторыми членами, такими как Smn1 и Trp53bp1, которые широко экспрессируются как в соматических, так и зародышевых клетках. Др. специфический субкласс генов семейства tudor, обозначенный tudor domain containing (TDRD) гены, которые преимущественно экспрессируются в зародышевой линии, включая TDRD1, упомянутый выше (Chuma et al. 2003, 2006). TDRD1 кодирует четыре tudor домена и MYND домен и обнаруживает сходный паттерн экспрессии как и MILI. TDRD1 ассоциация с MILI зависит от диметилирования аргинина на MILI N-конце (Kojima et al. 2009; Reuter et al. 2009; Vagin et al. 2009; Wang et al. 2009a). Др. член TDRDr, TDRD9 (гомолог Drosophila Spindle-E/homeless) взаимодействует с MIWI2 (Shoji et al. 2009), демонстрируя, что Piwi-Tudor ассоциация является консервативным свойством, и каждое взаимодействие обладаем своей собственно специфичностью связывания. Два члена TDRD, TDRD1 и TDRD9, слабо кооперируют в пути Piwi, а их мутации потери функции характеризуются стерильностью самцов, обнаруживая дефекты мейоза, сходные с таковыми для мутаций Mili и Miwi2, при этом ретротранспозоны LINE1 активируются и меняются профили piRNA. ДНК метилирование также снижается по промоторам LINE1, указывая, что TDRD1 и TDRD9 являются важными компонентами для эпигенетической регуляции также с помощью пути Piwi.

Недавние исследования идентифицировали др. членов TDRD, включая TDRD5 и TDRD7, по их участию в пути Piwi и/или замалчиванию ретротранспозона (Hosokawa et al. 2007; Tanaka et al. 2011; Yabuta et al. 2011). У Tdrd5 мутантов, нарушен гаплоидный спермиогенез, LINE1 ретротранспозон перестает молчать, а соотв. метилирование ДНК снижается, при этом локализация MIWI2 изменяется (see below), указывая, что TDRD5 является функциональными компонентом пути Piwi, однако профиль piRNA не был исследован у этого мутанта. Сходным образом, Tdrd7 мутация также перестает супрессировать ретротранспозоны LINE1, но в отличие от др. Tdrd генов, имеющиеся данные не выявляют каких-либо дефектов пути Piwi , включая биогенез piRNA, метилирование ДНК и субклеточную локализацию компонентов пути Piwi. Также онтогенетическая кинетика активации LINE1 отличается от таковой др. Tdrd и Piwi мутантов. Сегодня детальный механизм действия TDRD7 неясен, но гены семейства Tdrd могут оперировать в нескольких самостоятельных путях, чтобы действовать против ретротранспозонов. Нп молекулярном уровне TDRD белки, скорее всего, действуют как каркасные для сборки макромолекулярных комплексов посредством tudor доменов, а также др. доменов в каждом из членов TDRD, таких как MYND (TDRD1), LOTUS (TDRD5 and 7) и helicase (TDRD9) домены. Принимая во внимание, что все описанные Tdrd мутанты ведут к стерильности самцов, так что такая каркасная активность TDRD белков, включая собственно сборку комплексов Piwi эффекторов, обязательна для развития зародышевой линии самцов. Роль генов семейства Tudor в регуляции ретротранспозонов эволюционно законсервирована, как напр., участие у Drosophila Krimper, Tejas, Yb и Spindle-E в пути piRNA мух (Siomi et al. 2010). Итак члены семейства tudor проявляют себя как ключевые консервативные факторы, которые гарантируют целостность зародышевой линии у разных животных.

Additional factors for piRNA biogenesis and function

Биохимическая очистка мышиных Piwi комплексов и мутационные исследования идентифицировали дополнительные факторы, участвующие в пути piRNA. Сюда входят три белка с helicase доменами. Предполагаемая мышиная РНК геликаза MOV10L1 или её мушиный ортолог Armi необходимы для первичного биогенеза piRNA (Frost et al. 2010; Haase et al. 2010; Olivieri et al. 2010; Saito et al. 2010; Zheng et al. 2010). Они, как полагают, участвуют в загрузке предшественников первичной piRNA на белки Piwi, так 25-70 nt piRNA предшественники полуфабрикаты (piRNA intermediate-like, piR-IL) были обнаружены в комплексах Armi (Saito et al. 2010). piR-ILs последовательности соответствуют зрелым последовательностям piRNA, но не всегда выстраиваются в линию с концами piRNA. Они, как было установлено, несут 5' hydroxyl м 2'-3' циклические фосфатные группы, указывая на то, что Armi-ассоциированные piR-ILsвсё ещё для дальнейшего процессинга обоих концов, чтобы стать зрелыми piRNAs. Сходные предшественники piRNA пока не описаны для MOV10L1 комплексов.

Vasa мух или Vasa Homologue (MVH/DDX4) мышей являются геликазами, которые будучи делетированы устраняют вторичный биогенез piRNA как у мух, так и мышей (Malone et al. 2009; Kuramochi-Miyagawa et al. 2010). Точная роль этой геликазной активности пока неясна. Подобно Piwi белкам, Vasa также несет sDMA метки на своем N-конце (Kirino et al. 2010), это может позволить ему интегрироваться с комплексами Piwi путем внедрения в tudor каркасные белки. Наконец, мышиный TDRD9 или его ортолог SPN-E у мух содержит как геликазный, так и tudor домены и также участвует во вторичном биогенезе piRNA, хотя их точная роль неясна (Malone et al. 2009; Shoji et al. 2009).

Maelstrom (MAEL) и GASZ являются дополнительными факторами, демонстрирующими участие в пути piRNA (Soper et al. 2008; Ma et al. 2009). MAEL является high molecular group box (HMG-box) белком, тогда как GASZ, по-видимому, стабилизирует MILI и помогает формировать цитоплазматические гранулы, в которых обнаруживаются компоненты пути piRNA. Их механистическая роль пока неясна. Наконец, Zucchini (Choi et al. 2006; Saito et al. 2009; Haase et al. 2010; Olivieri et al. 2010; Huang et al. 2011; Watanabe et al. 2011a) является членом семейства phospholipase D и участвует в пути piRNA у мух и мышей. Хотя давно подозревается как nuclease, однако биохимические исследования не подтверждают это. Интересно, что zuc необходим для биогенеза первичных piRNA у мух, тогда как у мышей он только воздействует на общие уровни piRNAs.

Mechanisms of the Piwi pathway action

Замалчивание транспозонов является центральной ролью пути piRNA. В эмбриональной зародышевой линии, цитозольный белок MILI, скорее всего, использует свою slicer активность, чтобы не только порождать MIWI2 piRNAs, но и также разрушать мРНК транспозонов (De Fazio et al. 2011) (Fig. 2B). Напротив ядерный MIWI2 инициирует транскрипционное замалчивание, способствуя метилированию ДНК промоторных регионов транспозонов. piRNA-ведомый MIWI2, скорее всего, повышает доступ к промоторам транспозона посредством спаривания оснований с появляющимися транскриптами с локусов мишеней, подобно тому, как это описано для RNA-induced transcriptional silencing (RITS) комплекса у делящихся дрожжей (Motamedi et al. 2004). Возможность, что MIWI2 вообще-то не является slicer только подкрепляет такую гипотезу, т.к. его удержание на локусах мишенях усиливется с помощью нерасщепляемой RNA привязи. Как белок MIWI2 рекрутирует аппарат для метилирования ДНК или др. необходимые модификаторы хроматина, пока неизвестно. На постнатальных стадиях, происходящие из повторов пахитенные piRNAs направляют MIWI slicer активность на надзор за ролью в округлых сперматидах путем пост-транскрипционного разрушения мРНК L1 транспозонов, это избавляет их от молчания (Reuter et al. 2011). Т.о., Piwi slicer активность необходима для инициации транскрипционного молчания транспозонов у эмбрионов и для его поддержания на пост-транскрипционном уровне после рождения. Возникает вопрос, почему MILI, который загружается сходными piRNAs как и MIWI, неспособен компенсировать потерю каталитической активности MIWI? Возможным объяснением может быть обилие MILI рибонуклеопротеина (RNP), который остро снижается от пахитенных сперматоцитов до округлых сперматид, и вызывает различия в комплексах, ассоциированных с двумя Piwi белками (Vagin et al. 2009). Функция пахитенных piRNAs, возникающих из неаннотированных геномных регионов, пока неизвестна.

piRNAs также участвуют в становлении геномных импринтов на мышином Rasgrf1 локусе посредством замалчивания некодирующей РНК, пересекающей замалчиваемый домен (Watanabe et al. 2011b). Однако недавняя работа по Piwi slicer активности поставила вопросы, в какой степени Piwi является slicer для этого, по-видимому, ядерного события (De Fazio et al. 2011). piRNAs у мух также участвует в контроле генных транскриптов посредством slicer расщепления и deadenylation-обусловленного распада (Nishida et al. 2007; Rouget et al. 2010). Однако у мышей не получено доказательств, подтверждающих регуляцию на уровне мРНК с помощью Piwi белков (Unhavaithaya et al. 2009; Reuter et al. 2011). Тем не менее, контроль трансляции с помощью MIWI piRNPs описывает эту возможность, но неизвестно, как мРНК мишени отбираются и играют ли piRNAs роль в этом процессе (Grivna et al. 2006b; Unhavaithaya et al. 2009).

Spermatogenesis defects by Piwi pathway mutations in mice

У мышей все мутанты с потерей функции генов пути Piwi, идентифицированные подобным образом, вызывают стерильность самцов. Хотя piRNAs и некоторые факторы пути Piwi обнаружимы в ооцитах, причина, почему самки не затрагиваются, пока неясна (Tam et al. 2008; Watanabe et al. 2008). Объяснением могло бы быть то, что эндогенные siRNAs, генерируемые в ооцитах млекопитающих, и канонический RNAi путь функционируют, чтобы супрессировать ретротранспозоны (Tam et al. 2008; Watanabe et al. 2008). Др. предположение заключается в том, что мутантные ооциты в действительности повреждаются в определенной степени, которая, однако, не ведет к клеточным фенотипическим отклонениям. Эту возможность необходимо тщательно исследовать в будущих работах.

У самцов мутанты пути Piwi обнаруживают дефекты сперматогенеза, а фенотипические отклонения наблюдаются в основном на двух разных стадиях развития. Во-первых, самые ранние фенотипы обнаруживаются во время мейоза сперматоцитов и эта группа мутантов включает Mili, Miwi2, Tdrd1, Tdrd9, Mvh, Mael, Mov10l, Gasz, zucchini/Mitopld/Pld6 и Gtsf1/Cue110 (Kuramochi-Miyagawa et al. 2004, 2010; Chuma et al. 2006; Carmell et al. 2007; Soper et al. 2008; Ma et al. 2009; Shoji et al. 2009; Yoshimura et al. 2009; Frost et al. 2010; Zheng et al. 2010; Huang et al. 2011; Watanabe et al. 2011a). Отметим, что Gtsf1/Cue110 мутанты обнаруживают очень нечетко установленную связь между дерепрессией транспозонов и путем piRNA (Yoshimura et al. 2009). Поздние фенотипы, с др. стороны, возникают, по-видимому, постмейотически в гаплоидных сперматидах у Miwi и Tdrd5 мутантов (и Tdrd1 мутантов. которые обнаруживают дефекты как у сперматоцитов, так и сперматид) (Deng & Lin 2002; Chuma et al. 2006; Yabuta et al. 2011). В обеих группах мутантов зародышевые клетки сильно дегенерированы и не образуется функциональных спермиев, что ведет к полной стерильности самцов. Удивительно, в первой группе мутантов, так где клеточные фенотипы очевидны в постнатальных сперматоцитах, определенные молекулярные изменения уже видны на более ранних стадиях, в плодных просперматогониях (гоноцитах) во время эмбрионального развития. У этих мутантов, LINE1 и/или IAP ретротранспозоны четко активированы в просперматогониях, в то же время на этой эмбриональной стадии, нет обнаружимых дефектов в жизнеспособности клеток. Биогенез piRNAs per se (Mili) или последовательность профилей (Miwi2, Tdrd1, Tdrd9, Mvh, Mael, Gasz, Mov10l, zucchini/Mitopld/Pld6) также нарушена, а LINE1 и/или IAP локусы гипометилированы в мутантных просперматогониях. Причина задержанного фенотипа пока неизвестна, но одним из простейших объяснений может быть деметилирование ДНК. Возможно эпигенетические изменения в просперматогониях передаются постнатальным сперматогониальным стволовым клеткам и затем вследствие мейоза сперматоцитам, в которых транс-действующие факторы запускают экспрессию ретротранспозонов на умеренном уровне в дикого типа (non-toxic), но на значительно более высоком повреждающем уровне у мутантов, при этом эпигенетическая супрессия, т.e. метилирование ДНК не работает. Др. возможность заключается в том, что необычная "открытая" конформация хроматина локусов ретротранспозонов у мутантов, которые многократно повторяются в геноме, может оказаться неспособной супрессировать спаривание неаллельных гомологов и/или рекомбинацию между повторяющимися последовательностями или может приводить к аберрантной конденсации мейотических хромосом, что д. в дальнейшем приводить к активации мейотического checkpoint, сопровождаемого апоптозом.

Группа "поздних" мутантных фенотипов пути Piwi (Miwi и Tdrd5) обнаруживает пост-мейотические дефекты в гаплоидных сперматидах. У Miwi нулевых нокаутов, спермиогенез арестован на ст. округлых сперматид с сильно редуцированным уровнем piRNA (Deng & Lin 2002), но молекулярная связь между биогенезом piRNA и развитием сперматид неясна. Недавно мы показали, что MILI супрессирует LINE1 ретротранспозоны в округлых сперматидах в зависимости от его slicer активности (Reuter et al. 2011) и такая регуляция LINE1 с помощью MIWI не использует эпигенетические изменения (метилирование ДНК), но обнаруживает достоверное влияние на расщепление транскриптов LINE1 за счет последовательностей, комплементарных с piRNAs. Белок MIWI, следовательно, действует в основном пост-транскрипционно, чтобы замалчивать ретротранспозоны в постнатальном спермиогенезе, тогда как MILI и MIWI2 обусловливают как транскрипционную, так и пост-транскрипционную репрессию ретротранспозонов в зародышевых клетках плода. MIWI, как было установлено, также ассоциирует с аппаратом трансляции (Grivna et al. 2006b) и необходим для экспрессии их мРНК мишеней, участвующих в спермиогенезе (Deng & Lin 2002). MIWI сходным образом действует посредством нескольких самостоятельных способов действия, чтобы поразить транскрипты ретротранспозонов и возможно др. виды РНК.

Tdrd5 мутации также вызывают арест округлых сперматид (Yabuta et al. 2011). Однако несмотря на пост-мейотический фенотип спермиогенеза, плодные просперматогонии четко затрагиваются как в случае мутаций Mili и Miwi2, т.e., ретротранспозон LINE1 активируется, и локализация MIWI2 и TDRD9 изменяется на эмбриональной стадии. Tdrd5 мутанты также обнаруживают деметилирование ДНК по локусам LINE1. Все эти наблюдения указывают на то, что TDRD5 участвует в пути Piwi в плодных просперматогониях, тогда как клеточный фенотип проявляется значительно позднее в постнатальных сперматидах. Сегодня м не имеем удовлетворительного объяснения для такого длинного lag периода. Уровень и степень активации ретротранспозонов у этих мутантов могут быть относительно умеренными по сравнению с др. мутантами, или TDRD5 может выполнять более разнообразные роли и кроме замалчивания ретротранспозонов и регуляции пути piRNA. Детальное понимание того, как путь Piwi и др. клеточные процессы взаимодействуют и интегрируются в сперматогенезе предмет будущих исследований.

Subcellular RNP assembly of Piwi pathway components in the germline

Др. неотразимым свойством пути Piwi является его тесная ассоциация с зародышевыми гранулами/nuage. Зародышевые гранулы/nuage являются эволюционно законсервированными цитоплазматическими RNP, обычно обнаруживаемыми в зародышевой линии многих животных (Eddy 1975). Эти структуры были распознаны много лет назад и участвуют в спецификации зародышевой линии у нескольких представительных модельных животных, таких как Drosophila и C. elegans, на том основании, что зародышевые гранулы в ооцитах и ранних эмбрионах этих видов концентрируются с материнскими детерминантами зародышевой линии и асимметрично поступают в проспективные зародышевые клетки (Saffman & Lasko 1999; Seydoux & Braun 2006; Strome & Lehmann 2007). У млекопитающих, однако, детерминация зародышевой линии осуществляется среди плюрипотентных эпибластных клеток в зависимости от индуктивных сигналов от окружающих соматических клеток (Mclaren 2003) и в соответствии с этим зародышевые гранулы не обнаруживаются у ранних эмбрионов млекопитающих. Вместо этого они становятся видимыми на более поздних стадиях дифференцировки зародышевых клеток, т.e. во время сперматогенеза и оогенеза (Eddy 1975; Chuma & Pillai 2009). Эти зародышевые гранулы млекопитающих классифицированы на два типа (i) inter-mitochondrial cement (material/bar между митохондриями, также наз. pi-body), который собирается среди кластеров митохондрий в плодных просперматогониях, постнатальных сперматогониях и мейотических сперматоцитах у самцов и в развивающихся ооцитах самок и (ii) хроматоидные тельца, которые являются более заметной формой зародышевых гранул у млекопитающих, которые развиваются в мейотических сперматоцитах и гаплоидных сперматидах. Такие структуры зародышевых гранул/nuage у млекопитающих распознаны давно, но не привлекали внимание многие годы особенно на молекулярном уровне.

В результате недавних успехов по идентификации и характеристике пути piRNA стало ясно, что факторы пути Piwi существенно обогащены в зародышевых гранулах, а также в др. родственных RNP ансамблях (see below). А именно, меж-митохондриальный цемент в (про)сперматогониях и сперматоцитах содержит MILI, TDRD1 MVH и GASZ (Chuma et al. 2003, 2006; Aravin et al. 2009; Ma et al. 2009; Shoji et al. 2009; Tanaka et al. 2011), а хроматоидные тельца сперматоцитов и сперматид изобилуют MILI, MIWI, TDRD1, TDRD5, TDRD9, MVH и MAEL, среди прочих (Tanaka et al. 2000, 2011; Deng & Lin 2002; Chuma et al. 2003, 2006; Kuramochi-Miyagawa et al. 2004; Soper et al. 2008; Aravin et al. 2009; Ma et al. 2009; Shoji et al. 2009; Yabuta et al. 2011). Далее, в дополнение к зародышевым гранулам/nuage, processing bodies (P-тельца), как было установлено, содержат факторы пути Piwi, включая MIWI2, TDRD9 и MAEL (Aravin et al. 2009; Shoji et al. 2009). P-тельца являются цитоплазматическими ансамблями RNP, законсервированными у эукариот от дрожжей до клеток человека и предположительно их функцией является распад РНК и/или трансляционный контроль, включая тот, что обеспечивается с помощью miRNAs (Parker & Sheth 2007; Filipowicz et al. 2008). Удивительно, Р-тельца часто обнаруживают тесную ассоциацию с меж-митохондриальным цементом и иногда эти две структуры сливаются др. с др. (Aravin et al. 2009; Shoji et al. 2009; Tanaka et al. 2011). Такая тесная ассоциация между двумя ансамблями RNP может отражать некоторый функциональный аспект пути Piwi, такой, как предполагаемый "ping pong" биогенез piRNAs, при котором два самостоятельных под-пути Piwi (MILI и MIWI2 комплексы) кооперируют, такая возможность нуждается в тщательном подтверждении.

Пока мало известно о функциональном значении таких локализаций пути Piwi в зародышевых гранулах/nuage, но в отношении меж-митохондриального цемента было установлено, что эта структура отсутствует или сильно редуцирована в группе мутантов пути Piwi, включая Mili, Tdrd1 и Mvh, это указывает на то, что меж-митохондриальный цемент среди митохондриальных кластеров действительно находится под контролем пути Piwi (Chuma et al. 2006; Kuramochi-Miyagawa et al. 2010). Недавние исследования предоставили и др. доказательства возможной связи между путем Piwi и митохондриями per se. Zucchini/MITOPLD/PLD6, которые принадлежат семейству phospholipase D, важны для плодовитости самцов, а мутации потери функции вызывают тяжелые дефекты биогенеза piRNA и супрессии ретротранспозонов (Huang et al. 2011; Watanabe et al. 2011a). Интересно, что Zucchini/MITOPLD/PLD6 располагаются на наружной мембране митохондрий, а их избыточная экспрессия (в соматических клетках) облегчает слияние митохондрий посредством передачи сигналов липидов (Choi et al. 2006), тогда как потеря их функции разрушает меж-митохондриальный цемент и влияет на распределение митохондрий (Huang et al. 2011; Watanabe et al. 2011a). Zucchini/MITOPLD/PLD6 т.о. осуществляют важную связь, которая связывает путь Piwi с митохондриями, а также с меж-митохондриальным цементом. Удивительно, такого типа зародышевые гранулы/nuage среди митохондрий законсервированы у расходящихся животных (Eddy 1975), существует ли сходная корреляция с путем Piwi, интригующий вопрос.

Хроматоидные тельца по сравнению с меж-митохондриалным цементом, содержат ещё больше факторов пути Piwi, сюда входят (i)компоненты меж-митохондриального цемента в (про)сперматогониях и сперматоцитах (MILI, TDRD1 и т.д.); (ii) белки Р-телец, такие как TDRD9 и MAEL, а также более широко распространенные GW182 и AGO2 (Kotaja et al. 2006a; Tanaka et al. 2011); и (iii) белки пути Piwi, которые начинают экспрессироваться в и/или после мейоза, так как MIWI. Однако несмотря на такой характерный состав, функциональное участие хроматоидных телец в пути Piwi известно недостаточно. У некоторых мутантов по генам Piwi, таким как Miwi и Tdrd5, хроматоидные тельца структурно уменьшены в размере и фрагментированы (Kotaja et al. 2006b; Reuter et al. 2011; Yabuta et al. 2011), но их общая архитектура как структурно, так и композиционно сохраняется, хотя путь Piwi сущестенно наруше у мутантов (Grivna et al. 2006b; Reuter et al. 2011; Yabuta et al. 2011). Кроме того, недавно была получена серия мутантных хроматоидных телец, о мутантов Tdrd7, Tdrd6 и их двойных мутантов (Tanaka et al. 2011). У мутантов Tdrd7 хроматоидные тельца и Р-тельца, которые обычно структурно слиты во время мейотических делений у дикого типа (see Tanaka et al. 2011 for detail of chromatoid body biogenesis), остаются аномально разделены, приводя к особой преждевременной форме хроматоидных телец, которые примыкают к Р-тельцам в мутантных сперматидах. Tdrd6 мутанты затем обнаруживают дефицит хроматоидных телец со снижением размера и количества, подобных таковым у мутантов Miwi и Tdrd5 на более поздней стадии спермиогенеза (Vasileva et al. 2009; Tanaka et al. 2011). Далее, двойные мутанты Tdrd7 и Tdrd6 вызывают полную потерю хроматоидных телец с их инициальной стадии сборки в сперматоцитах до более позднего процесса поддержания b] в сперматидах. У всех этих Tdrd7 и Tdrd6 мутантов. которые обнаруживают тяжелый дефицит хроматоидных телец в целом, уровни piRNA и профили последовательностей затронуты несущественно. Это стало неожиданным открытием, что хроматоидные тельца или, по крайней мере, их структурная целостность не являются обязательным условием для биогенеза piRNA per se, и пока мы всё ещё не знаем, почему и как компоненты пути Piwi собираются в этих характерных цитоплазматических компартментах в сперматидах. Хроматоидные тельца, как было установлено, обладают свойствами, сходными с Р-тельцами, срессовыми гранулами, а также aggresomes (Haraguchi et al. 2005; Kotaja et al. 2006a; Tanaka et al. 2011). Эти структуры одинаковы благодаря сборке и секвестрации ими РНК мишеней и/или белков в массивные агрегаты для деградации или более позднего использования (Bhattacharyya et al. 2006). Хроматоидные тельца могут действовать посредством агрегации и секвестрации излишних клеточных аппаратов (machineries), включая компоненты пути Piwi, которые, по-видимому, выключаются, чтобы избежать нежелательного процессинга РНК и т.д. после соотв. промежутка развития. Если это так. то две формы зародышевых гранул/nuage млекопитающих, т.e., меж-митохондриальный цемент и хроматоидные тельца, играют скорее разные роли в регуляции пути Piwi.

Conclusion

We touched briefly on the piRNA system in male germline development in mice. So far, our knowledge of this small RNA pathway is still limited and partial. Key unsolved issues include the primary processing of piRNA precursors, the target selection and specificity if any, and the epigenetic functioning of the piRNA pathway in fetal germ cells in mice. At the same time, the role(s) of piRNA is still expanding. The Piwi pathway in Drosophila targets several endogenous mRNAs in addition to retrotransposon transcripts (Robine et al. 2009; Saito et al. 2009; Rouget et al. 2010). In mice, genomic imprinting of a paternal imprinted gene, Rasgrf1, is regulated by the Piwi pathway through a neighboring non-coding RNA containing a retrotransposon sequence (Watanabe et al. 2011b). The Piwi pathway likely has an effect on endogenous mRNAs and possibly non-coding RNAs other than retrotransposons in trans and in cis. Further, there are several reports that piRNA and Piwi pathway factors are detectable in somatic cells (Wu et al. 2010; Wang et al. 2011; Yan et al. 2011), although whether such expression might have any physiological function or not is still unclear. Together, further comprehensive and careful characterization of the Piwi-small RNA system will uncover novel and intriguing molecular aspects present but hidden in the germline and perhaps beyond.

piRNAs and their involvement in male germline development in mice Ramesh S. Pillai, Shinichiro Chuma Development, Growth & Differentiation Special Issue: RNA and Development Volume 54, Issue 1, pages 78–92, January 2012

piRNAs and their involvement in male germline development in mice
Ramesh S. Pillai, Shinichiro Chuma
Development, Growth & Differentiation Special Issue: RNA and Development Volume 54, Issue 1, pages 78–92, January 2012