Посещений:
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА

Связь с цитоскелетом, передача сигналов

Regulation from within: the cytoskeleton in transmembrane signaling
Khuloud Jaqaman, Sergio Grinstein
Trends in Cell Biol. Volume 22, Issue 10, October 2012, Pages 515–526 http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2012.07.006,

There is mounting evidence that the plasma membrane is highly dynamic and organized in a complex manner. The cortical cytoskeleton is proving to be a particularly important regulator of plasmalemmal organization, modulating the mobility of proteins and lipids in the membrane, facilitating their segregation, and influencing their clustering. This organization plays a critical role in receptor-mediated signaling, especially in the case of immunoreceptors, which require lateral clustering for their activation. Based on recent developments, we discuss the structures and mechanisms whereby the cortical cytoskeleton regulates membrane dynamics and organization, and how the nonuniform distribution of immunoreceptors and their self-association may affect activation and signaling.


Рисунки к статье



The plasma membrane: highly dynamic, yet organized


Клетки постоянно взаимодействуют со своим окружением. Это необходимо для выживания клеток и для развития и функциональной координации у многоклеточных организмов. К тому же мириады сигнальных каскадов начинаются на плазматической мембране после взаимодействия со внеклеточными сигналами рецепторов плазмалеммы.
Белки и липиды, которые составляют мембрану, не являются ни статичными, ни распределенными гомогенно вдоль или поперек мембранного бислоя. Межмолекулярные взаимодействия между мембранными липидами и белками генерируют негомогенности варьирующего размера и стабильности. Они могут варьировать от димеров до многокомпонентных доменов - обозначаемых как 'nanodomains', поскольку их размер в целом от десятков до сотен нанометров - и могут длиться от микросекунд до часов. Благодаря взаимодействиям с различными компонентами мембраны, кортикальный цитоскелет может ограничивать диффузию белков и липидов, содействуя их транспорту и ассистируя в образовании, сегрегации или транспорте нанодоменов. Как таковой цитоскелет может потенциально модулировать сигнальную трансдукцию, координируя события в разных частях клетки и купируя механические сигналы в биохимические реакции.

The plasma membrane is more complex than a fluid mosaic


Модель 'fluid-mosaic' , предложенная Singer и Nicolson 40 лет тому назад, постулирует, что липиды формируют бислой, который является фактически двумерной жидкостью, в которую вкраплены белки, формируя липидно-белковую мозаику [1]. Хотя модель удовлетворяет многим признакам биологических мембран, она делает два предсказания, которые не соответствуют экспериментальным наблюдениям: во-первых, она предсказывает, что белки и липиды подвергаются неограниченной диффузии в мембране (Figure 1a); и, во-вторых, как результат такой неограниченной диффузии мембранные белки и липиды д. распределяться случайно и гомогенно.



Figure 1. Types of motion of membrane proteins. (a) Free diffusion, as experienced by a protein in a lipid bilayer. Left panel: 'biophysical' view illustrating the trajectory of a molecule. Each segment of the line indicates the displacement recorded using a fast rate of image acquisition. Right panel: molecular view illustrating the lipids constituting the bilayer (beige; in all panels) and a transmembrane protein (red; in all panels). The arrows indicate the ability of the protein to diffuse in any direction. (b) Anchorage/tethering, as experienced by a protein while directly or indirectly associated with the cortical cytoskeleton. Left panel: 'biophysical' view illustrating that the mobility of a transmembrane protein is restricted to a limited area (broken circle) as a result of its attachment to cytoskeletal filaments (gray rods; in all panels). Right panel: molecular view illustrating attachment of the transmembrane protein to the cytoskeleton, in this illustration by association of its cytoplasmic tail to an adaptor linker molecule (blue). Shorter arrows imply restricted mobility. (c) Hop-diffusion, as experienced by a protein temporarily trapped within corrals formed by picket-fences that form on the cytoskeleton. Left panel: 'biophysical' view illustrating that the protein diffuses rapidly within the corral (red lines) but only occasionally escapes from one corral to the next, resulting in eventual long-range displacement, observable at slower rates of image acquisition (black line). Middle panel: illustrates the confinement of a transmembrane protein by a picket-fence comprising various proteins (all non-red cylinders) that are attached directly or indirectly (via a blue adaptor) to the cytoskeleton. Right panel: transient opening of the fence - either because of detachment of pickets from the cytoskeleton or due to remodeling of the skeleton itself - enables the diffusible protein to escape the corral (gray arrow). (d) Confined diffusion, as experienced by a protein trapped within corrals formed by picket-fences that form on the cytoskeleton. Left panel: 'biophysical' view illustrating that the protein diffuses rapidly within the corral (red lines) but cannot escape (at least during the course of the recording). Right panel: confinement of a diffusible protein by a picket-fence comprising various other proteins that are attached directly or indirectly (via blue adaptors) to the cytoskeleton. Not shown is the case in which the cytoplasmic domain of the transmembrane protein itself bumps into the cortical cytoskeleton, leading to its hop-diffusion (c) or long-term confinement (d).

Доказательство конфликта с первым предсказанием обнаружено после предложения модели Singer-Nicolson, когда в нескольких исследованиях было показано, что диффузия мембранных компонентов довольно ограничена2,3. Подвижность белков в erythrocyte ghosts была обнаружена почти в 20 раз более медленная, чем ожидалось для жидкой мозаики липидов-белков, замедление приписывается присутствию кортикальной цитоскелетной сети ('мембранного цитоскелета') [2]. Ограниченная диффузия белков и липидов наблюдалась в плазматической мембране многих типов клеток, при использовании разных техник, включая fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), single-particle tracking (SPT) и fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (Table 1). Эти исследования выявили уменьшение подвижности молекул, вызываемо не только кортикальным цитоскелетом4,5, а также за счет мембранной 'толкотни' с белками [6], взаимодействий между компонентами мембраны [7] и латеральной негомогенности в составе и состоянии мембраны [8].

Table 1. Imaging techniques that reveal protein mobility, clustering, and/or interactions

Таблица в оригинале статьи

Осознание, что композиция мембраны является латерально негомогенной является второй несообразностью между предсказанием модели Singer-Nicolson и экспериментальными данными. Убедительные доказательства получены с помощью многочисленных подходов, включая immuno-electron microscopy (immuno-EM) [9], FCS и его варианты10,11, atomic force microscopy [12] и недавно разработанную технику микроскопии высокого разрешения13-15 (Table 1). Одной из причин этой негомогенности является тенденция варьирующих видов липидов сегрегировать в соотв. субдомены [16]. Хотя их размер и продолжительность жизни спорны, в целом все согласны, что обогащенные холестеролом нанодомены - т.наз. 'липидные платформы' - существуют в плазматической мембране клеток млекопитающих. Платформы, как полагают, являются liquid-упорядоченными регионами, которые также содержат sphingolipids и glycosylphosphatidylinositol (GPI)-закрепленные белки. Большинство фосфолипидов, напротив, располагается в liquid-неупорядоченной фазе вну платформ. Отметим, что белок-липидные взаимодействия также могут генерировать нанодомены, отличные от платформ, напр., с syntaxin [17].
Др. причиной негомогенного распределения компонентов мембран являются межбелковые взаимодействия, которые обнаруживаются в живых клетках с использованием Forster resonance energy transfer [18] и с помощью SPT19,20 (Table 1). Такие, базирующиеся на белках домены - часто обозначаемые как 'белковые островки' - играют важную роль в активации лимфоцитов после взаимодействия с антиген-презентирующими клетками21-23. Межбелковые взаимодействия участвуют в разных flavors. В мембране белки, такие как tetraspanins ассоциируют др. с др. и дополнительными мембранными белками, чтобы сформировать белковые комплексы и нанодомены [24]. Помимо мембраны взаимодействия с каркасными и поперечно связывающими белками внутри и вне клетки, включая соединительные и PDZ домен содержащие белковые комплексы и galectins [25], также могут приводить к образованию кластеров компонентов мембран. Др. важным каркасом для белковых островков является кортикальный цитоскелет9,26. Влияние цитоскелета, однако, не связано с образованием каркаса. c

The different roles of the cytoskeleton


Membrane compartmentalization


Цитоскелет влияет на подвижность и организацию молекул в мембране дыумя разными, но взаимозависимыми способами. Во-первых, мембранные белки могут быть непосредственно закреплены или косвенно связаны с кортикальным цитоскелетом27,28. Белковые или липидно-белковые островки, прикрепленные к цитоскелету, д. быть относительно неподвижными, при этом пределы подвижности диктуются длиной и гибкостью связи (Figure 1b). В зависимости от силы взаимодействия закреление/прикрепление д. быть временным с периодами низкой и высокой подвижности, часто выявляемые как аномалии диффузии в мембране [29].
Во-вторых, даже без специфических непосредственных или косвенных взаимодействий кортикальный цитоскелет может генерировать барьеры, которые 'стоят на пути' диффундирующих белков и липидов. Наиболее убедительные доказательства этого получены с помощью high-speed SPT экспериментов, которые установили, что хотя белки и липиды диффундируют внутри биологических мембран с или близкими скоростями, наблюдаемыми в липидном бислое (of the order of 1-10 µm2/s) 30,31, такая диффузия ограничена внутри компартментов ('corrals') различной величины (40-250 nm). Это ограничение в общем временное, при этом время нахождения внутри загона (corral) 1-20 ms; молекулы 'прыгают' (hop) между компартментами, приводя к дальнодействующим экскурсиям на более длинной временной шкале (Figure 1c). Следовательно, если движение происходит с интервалами, более длинными, чем время пребывания, то явный коэффициент диффузии на 1-2 порядка величин меньше, чем тот, что записан в чистом липидном бислое. Такие 'hop-diffusion' наблюдаются в разных типах клеток для трансмембранных белков, включая transferrin рецепторы, молекулы major histocompatibility complex (MHC) и G protein-coupled receptors (GPCRs), для липидов в наружном листке мембраны и для GPI-закрепленных белков32-34.
Напротив, молекулы в крупных моноламеллярных везикулах и в мембранах пузырей, лишенных кортикального цитоскелета, диффундируют относительно свободно с коэффициентом диффузии, близким к тем, что наблюдаются в липидных бислоях [32]. Разборка актиновых филамент с использованием latrunculin или cytochalasin также в целом увеличивает фракцию молекул, подвергающихся простому Броуновскому движению в клеточных мембранах. Более того, изображения электронной томографии показывают, что на расстоянии в 10 nm от плазматической мембраны кортикальный цитоскелет образует сетчатую структуру, которая разграничивает компартменты по размерам, сходные с загонами (corrals), предсказанными анализом молекулярной диффузии [35]. Эти данные строго указывают на то, что кортикальный актиновый цитоскелет участвует в компартментализации плазматической мембраны. Модель hop-diffusion предполагает, что цитоплазматические хвосты трансмембранных белков наталкиваются на цитоскелетные филаменты, в результате чего их перемещение задерживается. Более того, трансмембранные белки, которые закреплены/связаны с цитоскелетом, формируют заставы ('pickets'), которые стоян на путях др. белков и липидов, даже те, что в наружном листке.
Hop-diffusion является привлекательной идеей, которая улаживает разногласия между молекулярной мобильностью в клеточных мембранах и мобильностью в искусственных бислоях. Однако необходимо отметить, что hop-diffusion на миллисекундной временной шкале наблюдалась только при использовании относительно крупных частиц золота, чтобы метить мембранные компоненты. Тем не менее, барьерный эффект кортикального цитоскелета на подвижность мембранных белков выявляется на более длительной временной шкале при использовании др. зондов и/или техник. Напр., перемещение меченных золотом молекул класса I MHC с использованием оптической ловушки (Table 1) показывает, что эти молекулы сталкиваются с цитоскелетными барьерами в своей диффузии [36]. Нендавно, SPT эксперименты, отслеживающие подвижность Fcγ [37] или В-клеточных рецепторов [38] на уровне одиночных молекул с одновременным получением изображений актина, выявили, что рецепторы прежде всего перемещаются внутри областей мембраны с низкой плотностью актина. Такие долговременные задержки (Figure 1d), также выявлены для др. рецепторов [20], на временной шкале в 1-10 s.
Что же позволяет молекулам перепрыгивать из одного загона в следующий? Во-первых, как hop-diffusion (с временной задержкой на миллисекундной шкале) так и более долговременные задержки (1-10 s) являются результатом взаимодействий между мембраной и кортикальным цитоскелетом. Во-вторых, перестройка кортикальных актиновых филамент, как было установлено, происходит на временной шкале в 10 s37-40. Следовательно, миллисекундной шкале кортикальный цитоскелет относительно стационарен, это не позволяет объяснить быстрые переходы, присущие hop-diffusion. Скорее всего, быстрое перепрыгивание между загонами обусловлено временным отсоединением сторожевых белков от цитоскелета, со счастливым случаем открытия пробела между двумя сторожевыми белками, позволяющему ограниченную диффузию, или отсоединением закрепленных/привязанных к цитоскелету белков или временными изменениями в сцеплении между актиновыми филаментами, которые образуют сеть под мембраной. Изменения в подвижности компонент мембраны на временной шкале 1-10 s могут быть непосредственно обусловлены ремоделированием цитоскелета. Механизмы, с помощью которых кортикальный цитоскелет модулирует заключение молекул и подвижность в мембране не установлены до конца. Лучшее понимание необходимо для дальнейших исследований не только мембранных липидов и беков, но и также кортикального цитоскелета в соответствующих временных и пространственных шкалах.
Барьеры молекулярной диффузии, накладываемые цитоскелетом, могут, в свою очередь, вести к к образованию кластеров молекул и образованию нанодоменов. Недавнее исследование класса I MHC продемонстрировало, что продолжительность жизни кластеров MHC зависит от стабильности кортикального актинового цитоскелета [41]. Совместное ограничение внутри цитоскелетом образованных компартментов на периоды в секунды увеличивает также шансы столкновения с рецептором, и тем самым увеличивает димеризацию epidermal growth factor receptor (EGFR) [19] и образование кластеров CD36 [20]. Этот эффект компартментализации, как полагают, является критическим для регуляции активации и передачи сигналов иммунорецепторов.

The molecular players


Ранние исследования эритроцитов выявили участие spectrin и actin в образовании сети, которая выстилает цитоплазматическую сторону мембраны, при этом ankyrin и band 4.1 связывают actin/spectrin с мембранными белками42,43. Хотя система spectrin-ankyrin наиболее выражена в эритроцитах, эти белки также участвуют в связывании CD45 с актиновой сетью [44] и малоподвижным классом I MHC молекул [45].
В большинстве др. клеток актин, как полагают, является ключевым элементом цитоскелета, формирующим кортикальную сетевую структуру. Недавно предоставлены доказательства для septins, также уаствующие в сети [46]. Белки из того же самого сверхсемейства что и band 4.1, а именно ezrin, radixin и moesin (ERM белки), связывают мембрану с кортикальной актиновой сетью47,48. Белки ERM ассоциируют с phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) в мембиране посредством своего N-terminal FERM домена и с актиновым цитоскелетом посредством своего С-конца. Родственный белок, merlin, также, как полагают, участвует в образовании мостиков мембрана-цитоскелет, хотя его механизм неясен из-за отсутствия у него actin-связывающего C конца, характерного для ERM белков. Белки ERM и merlin взаимодействуют с со многими мембранными белками, в некоторых случаях непосредственно, а в др. косвенно посредством каркасных белков, таких как ERM-binding phosphoprotein 50 (EBP50). EBP50 сам по себе взаимодействует с некоторыми мембранными белками непосредственно, а с др. посредством др. каркасного белка, PDZ domain-containing protein 1 (PDZK1). Т.о., ERM могут связывать мембрану с цитоскелетом и могут закреплять и создавать поддержку многим мембранным белкам. Они могут также вносить вклад в ремоделирование актинового цитоскелета благодаря своим взаимодействиям с Rho GTPases, после полимеризации актина. Мембранные белки, как было установлено, сцеплены с цитоскелетом посредством ERM белков, включая B клеточный рецептор [38], GPI-связанный белок Thy-1 [28] и cystic fibrosis transmembrane-conductance regulator [27] помимо прочих47,48.
Др. молекулы, участвующие в сцеплении актиновой кортикальной сети с мембраной, это filamin, talin, α-actinin и tensin. Filamin связывает в пучки актин, тем самым вносит вклад в формирование сетчатых структур, но также соединяется со многими рецепторами клеточной поверхности49,50. Talin,α-actinin, и tensin в основном соединяются с интегринами в фокальных адгезиях [50], всё же они могут потенциально взаимодействовать с др. мембранными белками, как это недавно сообщалось для Fcγ рецептора [51].
Необходимо подчеркнуть, что механизмы, которые связывают большинство мембранных белков с цитоскелетом, остаются неизвестны. В большинствe исследований взаимодействие мембранных компонентов с цитоскелетом выводятся дедуктивно из фармакологических нарушений целостности актиновых филамент и измерений эффектов на молекулярную подвижность. Полное понимание организации мембран необходимо для выявления молекулярных механизмов, которые связывают мембранные компоненты с кортикальным цитоскелетом.

Cytoskeleton-raft crosstalk


Несколько недавних исследований подтвердили, кортикальный цитоскелет влияет на формирование липидных платформ и подвижность, тогда как холестерол в мембране, в свою очередь, влияет на динамику кортикального цитоскелета. FCS исследования выявили, что маркеры liquid-ordered фазы, такие как sphingolipid-связывающий домен и cholera toxin subunit B, оказываются в целом менее мобильны, чем маркеры liquid-disordered фазы52,53. Подвижность таких плотиков (платформ) обнаруживает тенденцию к увеличению после деполимеризации актина,азывая тем самым, что кортикальный цитоскелет формирует барьеры, которые уменьшают перемещение составляющих платформ, преимущественно благодаря взаимодействиям между белками, ассоциированными с платформами, и цитоскелетом. Более того, immuno-EM исследование установило, что платформенные нанокластеры не формируются, если цитоскелет деполимеризуется [54], указывая тем самым, что цитоскелет необходим для образования и/или стабилизации липидных платформ. Напротив, имеются доказательства, что уменьшение холестерола изменяет динамику кортикальной актиновой сети, скорее всего путем секвестрации или перераспределения PtdIns(4,5)P2, обнаруживаемых в нанодоменах, обогащенных холестеролом [55]. Эти наблюдения подчеркивают строгую взаимную зависимость между цитоскелетом и мембраной и поэтому необходимо учитывать оба компонента при интерпретации результатов фармакологических нарушений.

Beyond membrane compartmentalization


Помимо компартментализации мембранные белки, которые ассоциированы с цитоскелетом, могут быть транспортированы на длинные дистанции, т.к. иногда одновременно изменяются организация и динамика цитоскелета. Напр., связанные с лигандом EGFR димеры, транспортируются с ретроградным током актина из кончиков филоподий к их основаниям прежде эндоцитоза [56]. Напротив, базирующийся на актине мотор myosin X транспортирует рецепторы, такие как интегрины в кончики филоподий [57]. Ретроградный ток актина также участвует в транспортировке кластеров рецепторов ephrin с периферии клетки в её центр [58] и необходим для образования иммунологических синапсов, причем небольшие агрегаты периферических рецепторов и ко-рецепторов дифференциально транспортируются центростремительно, чтобы сформировать крупные, концентрические супрамолекулярные кластеры59-61. В большинстве из этих случаев молекулы, которые связывают рецепторы с актином, неизвестны.
В некоторых случаях, главным образом в нейрональных клетках, микротрубочки также транспортируют поверхностные рецепторы. Gamma aminobutyric acid (GABA) рецепторы активируются с помощью внешних стимулов, прикрепленных к плюс-концам микротрубочек и транспортируются антероградно в ведущий край клетки, генерируя асимметрические сигналы кальция [62]. SPT исследования ростовых конусов нейронов и ламеллиподий фибробластов показали, что рецепторы glutamate обнаруживают направленное ретроградное перемещение, благодаря ассоциации, возможно косвенной, с микротрубочками, которые, в свою очередь, транспортируются с помощью ретроградного тока актина [63].

Immunoreceptors: an archetype of activation by clustering


Многие рецепторы становятся активированными преимущественно в результате трансмембранных конформационных изменений, вызванных связыванием лигандов. Другие, особенно иммуннорецепторы, передают сигналы в ответ на образование кластеров64-66: T клетки, B клетки, Fcγ и рецепторы Fcγ , среди прочих, подвергаются экстенсивному образованию латеральных кластеров, будучи экспозированными мультивалентными мишенями (т.e., частицами, такими как патогены, которые обладают на своей поверхности множественными копиями одного или нескольких лигандов), вызывая мощную и устойчивую реакцию. Эффективность и специфичность стимуляции часто извилиста за счет одновременного образования кластеров из ко-рецепторов и дополнительных, независимых типов рецепторов. Такое экстенсивное, синергичное образование сопутствующих кластеров наиболее наглядно в иммунологических синапсах между лимфоидными и антиген-презентирующими клетками59-61 и в фагоцитических бокалах [67].
Необходимость в образовании мультимера для активации стоит наиболее остро в случаях, таких как Fcγ рецепторы. В нестимулированных циркулирующих клетках, таких как нейтрофилы или моноциты, Fcγ рецепторы д. оставаться молчащими, несмотря на непрерывное воздействие высоких концентраций мономерных лигандов (циркулирующих IgG). Молчание является следствием низкого сродства рецепторов для мономерных лигандов. Однако, рецепторы с высокой жадностью в отношении мультивалентных мишеней, таких как IgG-opsonized частицы, наделяют способностью Fcγ рецепторы эффективно соединяться с мишенями, кластерами, и становиться активированными65,66.
Многие годы образование олигомеров рецепторов, как полагали, происходит спонтанно и случайно, когда мультивалентные мишени сталкиваются с клетками. Это мнение частично исходило из модели Singer-Nicolson, базируясь на нескольких предположениях: (i) рецепторы гомогенно распределены в качестве мономеров; (ii) они свободно диффундируют в плоскости мембраны; и (iii) они обладают низкой прирожденной тенденцией ассоциировать др. с др. в отсутствие лигандов. Эти предпосылки становились всё более спорными с появлением доказательств, что некоторые типы иммунорецепторов ограничены мембранными загонами, закрепленными на подлежащем цитоскелете37,38.
Разные способы ограничения, как полагают, оказывают разные эффекты на активацию и передачу сигналов рецепторами. В случае одиночного заключения или закрепления индивидуальных рецепторов, когда период заключения/закрепления превосходит время связывания рецептора с мультивалентной мишенью, то образования кластеров рецепторов практически не происходит (Figure 2a). Если продолжительность полу-жизни заключения относительно коротка, то это позволяет рецепторам hop-diffuse вдоль мембраны и формировать кластеры, хотя и с умеренной эффективностью (Figure 2b). Успех образования кластеров д. зависеть от скорости hop-diffusion, времени vis-а-vis нахождения мультивалентной мишени в непосредственно близости к клетке.

Figure 2. Interaction of immunoreceptors with multivalent targets. (a) Individually confined/anchored receptors. Left panel: 'biophysical' view of receptors with limited diffusion range, indicated by broken circles (see Figure 1 for details of this and subsequent left panels). Right panel: because the mobility of receptors is limited, clustering by exposure to vicinal ligands (fuchsia circles) on target (blue) is ineffective. (b) Receptors undergoing hop-diffusion. Left panel: 'biophysical' view of two hop-diffusing receptors. Right panel: hop-diffusing receptors can gradually move along the surface of the membrane and can therefore undergo target-induced clustering, albeit slowly. (c) Co-confined or co-anchored receptors. Left panel: 'biophysical' view of multiple receptors restricted to diffuse within individual corrals. Right panel: fast association of several receptors with a multivalent target when the latter collides with a region of receptor co-confinement. (d) Co-confined or co-anchored receptors with a tendency to self-associate. Left panel: 'biophysical' view of multiple receptors that have the tendency to self-associate transiently and are restricted to diffuse within individual corrals. Right panel: self-associating receptors will bind rapidly and very effectively to a multivalent target when the latter collides with a region of receptor co-confinement.

Важно отметить, что рецепторы не ограничиваются индивидуально [37]. Совместное ограничение множественных рецепторов внутри одного и того же нанодомена может иметь положительный эффект на образование кластеров рецепторов (Figure 2c), поскольку они увеличивают вероятность множественных рецепторов ассоциировать с мишенями, с которыми они сталкиваются в области заточения, богатой рецепторами (Box 1). Фагоцитарный рецептор CD36 представляет уникальный случай совместного заточения, при этом рецепторные молекулы оказываются заловленными внутри актином- и микротрубочками-ограниченных доменов, которые почти одномерны [20].

Box 1. Receptor clustering and signaling: insights derived from modeling To the best of our knowledge, to date there are no published modeling efforts investigating specifically the relation between immunoreceptor clustering in the resting state (i.e., in the absence of ligands) and the efficiency of ligand binding and signaling. However, published attempts to model other signaling pathways where receptor oligomerization is necessary for signaling, such as EGFR, which dimerizes, and abstract models that investigate particular phenomena that are relevant for immunoreceptors, shed light on the effect of resting-state clustering on immunoreceptor signaling.
In terms of ligand binding, modeling studies indicate that receptor clustering decreases the effective dissociation constant of ligands - even if monovalent - because of enhanced ligand rebinding after detachment due to the increased local density of available receptors 80 and 81. Although the case of multivalent ligand/target has not been explicitly investigated, these results predict that immunoreceptor clustering would increase the efficiency of multivalent target binding, because the increased local density of receptors would facilitate multiple, simultaneous receptor-ligand binding events.
Parallel to the effects of receptor clustering on ligand binding, modeling efforts suggest that receptor clustering similarly reduces the effective dissociation constant of downstream effectors, also due to enhanced rebinding [82]. Consequently, receptor clustering enhances signaling if the downstream effector needs multiple sequential modifications to be activated [83]. These results imply that receptor clustering enhances the efficiency of signal transduction whenever cooperativity between different molecular players is required, as is the case for immunoreceptors.
What about the role of the cortical cytoskeleton in clustering receptors? Overall, coupling between the membrane and the cytoskeleton has a profound effect on membrane organization, both spatially and temporally 84 and 85. Simulations suggest that diffusion within corrals might enhance receptor clustering, but only if receptors have a tendency to associate with each other, where the increased size of the receptor complexes would lead to their trapping within corrals [86]. In addition, transient binding of receptors to the cytoskeleton (i.e., anchorage/tethering), coupled to cytoskeletal remodeling, can generate receptor clusters [87]. Cytosolic scaffolds can in fact generate membrane protein clusters, the fraction and size of which are independent of protein density, a feature that is necessary to maintain a linear response to stimulation [88], which cannot be achieved by interactions between membrane components alone.


Мнение, что рецепторы существуют как мономерные единицы прежде, чем столкнуться с лигандом? также оказалось неверным. Экспериментальные и аналитические подходы, которые позволяют анализировать взаимодействия рецепторов in situ в живых клетках, показали, что рецепторы ассоциируют др. с др. в отсутствие лиганда19,20. Подтверждением прирожденной тенденции иммунорецепторов ассоциировать др. с др., также получено в сообщениях о спонтанном (независимом от лиганда) образовании B клеточных рецепторных олигомеров - и о последующей передаче сигналов - когда их способность к коллизиям усиливается удалением зависимого от цитоскелета барьера диффузии [38].
Возникает интересная ситуация, когда врожденное сродство рецепторов ассоциировать комбинируется с возможностью совместного заточения (Figure 2d). При таком сценарии, частые спонтанные столкновения между рецепторами внутри одной и той же зоне заточения будут благоприятствовать образованию некоторого количества олигомеров в нестимулированном покоящемся состоянии [68]. Это по прогнозам будет транслироваться в степень 'tonic' стимуляции, которая фактически описана в некоторых случаях38,69,70. Такая тоническая стимуляция очень умеренная, поскольку олигомеры, формируемые спонтанно, редки, малы и коротко живущие из-за ограниченного межрецепторного сродства. Однако, спонтанно образующиеся олигомеры увеличивают активность связывания мультивалентных мишеней, транслируясь в высоко эффективный способ отлавливания и реакции на bona fide стимулы20,37. Ясно, что эти размышления приложимы не только к гомотипичным взаимодействиям, но и также ко взаимодействиям между разными рецепторами и ко-рецепторами, когда их лиганды присутствуют одновременно на той же самой мишени.

How clustering triggers signaling


Активация и передача сигналов иммунорецепторов является примером положительной кооперации (Box 1). При накоплении рецепторов в плотном кластере мультивалентные мишени запускают высоко скоординированную серию событий фосфорилирования и дефосфорилирования, которые очень чувствительны к локальной концентрации субстратов, киназ и фосфатаз64,71,72. Рецепторы сами по себе являются инициальными мишенями фосфорилирования по двум тирозиновым остаткам, известными как immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). Src-family kinases (SFKs) Lck, Fyn и Lyn в первую очередь ответственны за ITAM фосфорилирование (Figure 3a,b). Фосфорилированные ITAMs затем рекрутируют нижестоящие Syk или ZAP70 киназы, благодаря их Src Homology 2 (SH2) доменам. Рекрутированные Syk и ZAP70 в свою очередь фосфорилируются с помощью SFKs, благодаря чему они и активируются71,73 (Figure 3c).



Figure 3. Signal transduction by immunoreceptors. (a) Resting state. The membrane comprises cholesterol-depleted regions (beige) and cholesterol-enriched nanodomains (rafts; brown). Cholesterol is shown in red. Src-family kinases (SFKs) are anchored to the membrane by acylation and can exist in an unphosphorylated state or be phosphorylated at an inhibitory site (yellow circle labeled P with red perimeter). CD45, a tyrosine phosphatase, can dephosphorylate SFKs, facilitating their activation. Inactivated immunoreceptors (dark blue) reside largely outside rafts. Their tyrosine residues (cyan hexagons labeled Y) constituting the ITAM are buried in the bilayer. Co-receptors (red), present mostly in rafts, tend to associate with SFKs. (b) Signal initiation. A target (light blue) bearing ligands for the immunoreceptors (green diamonds) and co-receptors (fuchsia circles) cluster immunoreceptors and co-receptors together in the context of rafts, where active SFKs can autophosphorylate (yellow circle labeled P with green perimeter) to stabilize their active state and can phosphorylate and activate the ITAM tyrosines on immunoreceptors (also yellow circle labeled P with green perimeter). (c) Signal propagation. Dually phosphorylated tyrosines at the ITAM attract tandem SH2 domains of Syk or ZAP70 (S/Z). Recruited Syk or ZAP70 can in turn be tyrosine phosphorylated and activated by SFKs and by autophosphorylation, thereby propagating the signal.

Фосфорилирование ITAM в рецепторных кластерах может быть запущено с помощью рекрутирования и/или активации SFKs, путем ингибирования и/или смещения фосфатаз или с помощью воздействия латентными ITAM тирозинами. Эти механизмы, скорее всего, кооперируют при инициации передачи сигналов. Как в случае с GPCRs и инсулиновыми рецепторами, индуцируемые лигандом трансмембранные конформационные изменения могут запускать активацию иммунорецепторов; в самом деле, лигандом индуцированная экспозиция региона, богатого пролином, как полагают, способствует рекрутированию адаптора Nck посредством его домена SH3 [64]. Однако отсутствуют доказательства, что Nck способствует фосфорилированию ITAM. Более важно то, что хотя мономерные лиганды, такие как растворимые антигены, неспособны активировать иммунорецепторы, мультимерные растворимые или закрепленные комплексы, они всё же эффективны [64]. Т.о., образование кластеров рецепторов в мембране, по-видимому, является ключевым фактором.
SFKs, которые не ассоциируют стабильно с иммунорецепторами перед стимуляцией (Figure 3a), становятся интегральной частью сигнальных кластеров после поперечного связывания рецепторов. Это приписывается инкорпорации кластеров рецепторов в платформы-плотики, где киназы обычно располагаются благодаря своим насыщенным acyl цепочкам и своей ассоциации с ацилированными ко-рецепторами, такими как CD4 и CD864,72 (Figure 3b). Как рецепторы, которые в покое, в основном исключаются из liquid-упорядоченных доменов, мигрируют в платформы вследствие поперечного связывания, остается мистическим, но их рекрутирование в ближайшее окружение платформ, содержащих ко-рецепторы с помощью соотв. лигандов, может быть таким фактором.
Поскольку SFKs в основном неактивны в нестимулированных клетках, то их активация нуждается в запуске фосфорилирования ITAM. Это осуществляется в два шага: дефосфорилирование SFKs' C-терминального ингибирующего phosphotyrosine, сопровождаемое внутримолекулярным фосфорилированием второго тирозина, который стабилизирует активную конформацию (Figure 3a,b). Дефосфорилирование ингибирующего фосфотирозина выполняется с помощью разных цитозольных (напр., PTP1B, Shp1) и трансмембранных (напр., CD45, CD148, PTPa) фосфатаз. Из них, CD45 наиболее изучена и, скорее всего, наиболее важная. CD45 распределяется преимущественно в liquid-дизорганизованных доменах (Figure 3a), где она дефосфорилирует ингибирующий фосфотирозин в SFKs, создавая субпопуляцию активных киназ, которые предназначены для рекрутирования в платформы [74]. Однако, CD45 может также дефосфорилировать сайт активации SFKs и фосфотирозины, генерируемые с помощью SFKs. Т.о., парадоксально, но CD45 обладает как активирующими, так и деактивирующими эффектами. Как это происходит? Снова образование кластеров рецепторов и латеральная сегрегация оказываются ключевыми. Из-за своего размера, CD45 исключается из liquid-упорядоченных платформ, где располагаются поперечно связанные рецепторы, предупреждая их от противодействия активации SFKs, по крайней мере, первоначально74,75. На более поздних стадиях, CD45 каким-то образом мигрирует в зону активации, где она вносит вклад в завершение передачи сигналов. Следовательно, фосфатазы играют последовательно тройную роль активации/деактивации иммунорецепторов, что обусловлено их инициальным исключением и последующим вступлением в кластер активации.
Этот регуляторный сценарий осложняется дальнейшими изменениям в экспозировании тирозинов субстрата. Имеются убедительные доказательства, что перед стимуляцией ITAM тирозины, по крайней мере, у некоторых из иммунорецепторов погружаются в бислой, недоступный для SFKs76,77. Тирозины оказываются экспозированными во время активации и были предложены некоторые модели для объяснения этого76-79. Во-первых, связывание лиганда может индуцировать конформационные изменения, смещающие тирозины из бислоя. Во-вторых, образование плотных кластеров рецепторов может физически вытеснять их цитозольные хвосты из мембраны путем смещения кольцеобразных липидов, замещая их рецепторами. В-третьих, соединение рецепторов (и ко-рецепторов) может приводить к модификации липидной внешней среды, окружающей их. В этом отношении ITAM тирозины часто окружены катионовыми остатками, которые д. управлять ассоциацией мотива с более негативно заряженными регионами мембраны (напр., регионами, богатыми polyphosphoinositides и/или phosphatidylserine). Эти липиды могут избирательно исключаться из рецепторных комплексов или модифицироваться (напр., гидролизоваться) внутри них, приводя к отсоединению ITAM и экспозиции тирозинов.
Итак, разные элементы необходимы, чтобы инициировать передачу сигналов с помощью иммунорецепторов, это подчеркивает критическое значение образования из них кластеров. Физическое перераспределение рецепторов, ко-рецепторов и ассоциированных липидов усиливает экспозирование тирозинов субстрата, привлекает активные SFKs в непосредственную близость к рецепторам, приводит нижестоящие киназы, такие как Syk и ZAP70 , в контакт с их активаторами (SFKs) и исключает потенциально ингибирующие фосфатазы из активного комплекса.

Concluding remarks


We have come to realize that the plasma membrane is a complex organelle, highly organized in both space and time. Many factors contribute to its organization, from protein and lipid interactions within the plane of the membrane to interactions between membrane components and factors inside and outside the cell. In particular, new experimental and analytical techniques are providing mounting evidence for the cortical cytoskeleton as a major regulator of membrane organization. It is critical for future studies to establish the molecular mechanisms that link the cortical cytoskeleton to the membrane and modulate the mobility and organization of membrane components.
The regulated diffusion and nonuniform distribution of receptors in the membrane are likely to play a critical role in receptor signaling, especially in cases such as immunoreceptors that require lateral clustering for their activation. In this regard, the cortical cytoskeleton plays at least a dual role: on the one hand, it facilitates the clustering of receptors and downstream effectors to increase the efficiency and robustness of signaling upon multivalent ligand binding; on the other, it separates receptors from each other, minimizing their association and preventing signaling in the absence of ligands. What role the cortical cytoskeleton plays in regulating individual receptors and signaling pathways is an essential question that remains to be answered. It should be borne in mind that receptor signaling itself triggers reorganization of the cytoskeleton, which in turn influences receptor mobility and signaling, a feedback of
Сайт создан в системе uCoz