Retinoic acid (RA) является уникальным липидным регулятором пролиферации и дифференцировки нейральных предшественников. Эффекты RA's обеспечиваются её связыванием и активацией специфических рецепторов RA, которые являются членами семейства лигандами активируемых транскрипционных регуляторов (Mark et al.,2006). Этот регуляторный фактор обладает потенциалом способствовать транскрипции очень большого числа генов, потенциально индуцируя, по крайней мере, от двух до нескольких тысяч генов (Cawley et al.,2004). Среди своих функций, RA индуцирует дифференцировку нейронов в стволовых клетках, напр., RA индуцирует эмбриональные стволовые клетки приобретать свойства pax-6 позитивных клеток радиальной глии, характерных эндогенных эмбриональных предшественников нейронов (Bibel et al.,2007). RA обладает также антипролиферативными эффектами на большой набор типов клеток и используется для лечения некоторых раковых опухолей (Crowe,2002). Однако экспрессия разных RA связывающих белков в цитоплазме может отталкивать RA прочь от RA рецепторов в направлении PPARalpha/delta, приводя к тому, что RA способствует скорее, чем ингибирует клеточную пролиферацию (Schug et al.,2007).

В качестве регуляторного фактора в развивающейся ЦНС RA интенсивно исследовалась в отношении её функций формирования паттерна экспрессии генов и регуляции нейрогенеза (Maden,2002, 2007). По ходу созревания эмбриона и нейрогенеза, также и др. регулируемые RA функции снижаются, RA-регулируемая транскрипция становится всё более ограниченной (Luo et al.,2004). Вплоть до недавнего времени мало обращали внимания на то, что RA может действовать во взрослом головном мозге, потому что её действие было ограничено лишь немногими регионами головного мозга, имеющиеся доказательства указывают на то, что RA влияет на синаптическую пластичность в гиппокампе (Misner et al.,2001; Aoto et al.,2008; Chen and Napoli,2008) , а также регулирует пролиферацию и нейрогенез в трех ограниченных регионах, где это происходит, в обонятельном эпителии, subventricular zone (SVZ) и subgranular zone (SGZ) гиппокампа (Asson-Batres et al.,2003; Haskell and LaMantia,2005; Wang et al.,2005; Jacobs et al.,2006). В SVZ, RA способствует как пролиферации, так и дифференцировке предшественников (Haskell and LaMantia,2005; Wang et al.,2005). В зоне SGZ гиппокампа, vitamin A был описан как необходимый для дифференцировки и жизнеспособности нейронов, но не для пролиферации гранулярных клеток (Jacobs et al.,2006). Определенно анализ регионов действия RA's в головном мозге производится с использованием трансгенных RA репортерных мышей, а гиппокамп является особенно горячей точкой передачи сигналов RA (Misner et al.,2001; Crandall et al.,2004; Luo et al.,2004), при этом RA-регулируемая транскрипция локализуется преимущественно в зубчатой извилине (dentate gyrus). Исследования In vitro показали, что предшественники нейронов, которые дают гранулярные нейроны непосредственно отвечают на RA (Takahashi et al.,1999).

Хотя RA обладает потенциалом действия в гиппокампе, эндогенный источник RA для регуляторной функции неизвестен. In situ гибридизация и иммуногистохимические исследования не обнаруживают присутствия в гиппокампе грызунов retinaldehyde dehydrogenases (RALDHs), необходимых для синтеза RA. Данное сообщение описывает паттерн синтеза RA в гиппокампе мышей. Единственный источник RA-синтезирующих энзимов являются retinaldehyde dehydrogenase 1 и 2 (RALDH 1 and 2), присутствует в соседних мягких оболочках, при этом RA диффундирует от этого источника, потенциально распределяясь негомогенно по инфрапирамидальным и супрапирамидальным листкам зубчатой извилины. Это может дифференциально регулировать функцию в этих листках и один из исследованных примеров это скорость пролиферации нейральных предшественников. Продемонстрировано, что RA может регулировать пролиферацию предшественников в SGZ и соотношение пролиферации между инфрапирамидальным и супрпирамидальным листками может сдвигаться при отклонениях в передаче сигналов RA.

В развивающейся ЦНС RA координирует упорядоченную экспрессию генов благодаря своей собственной организации в регионы с высокой и низкой концентрациями, эти различия в концентрации детерминируются региональной экспрессией энзимов синтеза и катаболизма (McCaffery et al.,1999; Reijntjes et al.,2004; Hernandez et al.,2007), которые часто находятся в непосредственном соседстве др. с др. (Swindell et al.,1999; Reijntjes et al.,2005). Это сообщение подразумевает параллели между взрослым и эмбриональным головным мозгом мыши, при этом RA во взрослом гиппокампе распределена негомогенно по зубчатой извилине благодаря локализации энзимов синтеза и катаболизма. Катаболический энзим Cyp26b1 в клетках ворот (hilus) (Abu-Abed et al.,2002) обеспечивает RA "опускание" и может в дальнейшем усиливать градиент RA вдоль зубчатой извилины. Это показано на Figure 7, иллюстрирующем синтез RA с помощью RALDH2 (и RALDH1) в менингиальных оболочках, преимущественно активирующий RA сигнал присутствует в клетках инфрапирамидального листка зубчатой извилины. Низкие количества RA из менингиального источника, по-видимому, достигают супрапирамидального листка и RA для этого листка может быть предоставлена также низкими уровнями (1-2 nM), присутствующими в кровообращении (Kurlandsky et al.,1995) и RALDH1 в стенках крупных кровеносных сосудов (see Figs. 1A,B). В эмбриональном заднем мозге, RA может диффундировать, по крайней мере, на 200 µm (Smith et al.,2001), и поэтому RA, генерируемая менингиальными оболочками, может преодолевать расстояния до инфрапирамидального листка. Необходимо учитывать, что нейропиль взрослого головного мозга может быть менее открытым для диффузии по сравнению с эмбриональным головным мозгом и поэтому возможно, что RA и вообще др. ретиноиды также активно транспортируются в гранулярные клетки инфрапирамидального листка; дендриты инфрапирамидальных гранулярных нейронов в молекулярном слое приходят в тесное соприкосновение с менингиальными оболочками (Figs. 7B,C) и белки, связывающие ретиноиды, могут отлавливать RA. Доказательством существования подобных различий RA между листками обеспечивается асимметричное распределение RARE-lacz репортера в двух листках, демонстрирующее более высокое число клеток, меченных репортером, в инфрапирамидальном по сравнению с супрапирамидальным листком; это различие может быть устранено трехдневным воздействием экзогенной RA.

Figure 7. Model of RA signaling in the dentate gyrus in control animals. (A) RA is generated by RALDH2 in the meninges and activates RA signaling predominantly in granule cells and their precursors (in the SGZ) in the infrapyramidal blade of the dentate gyrus. Expression of the catabolic enzyme CYP26B1 further limits the diffusion of RA across the dentate gyrus. The dendrites of the granule neurons of the infrapyramidal blade stretch to reach the meninges, as can be seen in neurons immunofluorescently labeled for the RA reporter (B and C), as also illustrated in (A) and RA may hypothetically be transported by these processes to reach the granule neuron cell bodies. Scale bars: B, 50 µm; C, 25 µm. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

Одним из результатов этого распределения RA является дифференциальная регуляция клеточной пролиферации между двумя листками зубчатой извилины. У необработанных мышей низкая клеточная пролиферация обнаруживается в инфрапирамидальной в противовес супрапирамидальной SGZ, как показывает BrdU мечение. Это может быть сопряжено с тем, что низкая пролиферация клеток в инфрапирамидальной SGZ обусловлена более высокими эндогенными концентрациями RA вокруг этого листка. Клеточная пролиферация в супрапирамидальном листке может быть супрессирован до сходных уровней с помощью экзогенной RA или в течение длительного периода в 3 недели или короткого 3-х дневного интервала. Однако исъходя из этих результатов не было установлено, является ли это прямым или опосредованным влиянием RA. Определенно, RA обладает потенциалом блокировать клеточные деления и делает так с рядом клеток предшественников (Clarke et al.,2004) и в органотипических культурах было показано, что RA может ингибировать пролиферацию клеток в гиппокампе. Заметные различия в способности RA дифференциально влиять на пролиферацию в инфрапирамидальной в противоположность супрапирамидальной SGZ зоне были доказаны между разыми местами вдоль рострально-каудальной оси переднего мозга, при этом ростральные регионы в основном нечувствительны. Это, по-видимому, отражает различия в относительной позиции вдоль septotemporal оси, вдоль которой гиппокамп обеспечивает паттерн функции (Moser and Moser,1998) и скорость нейрогенеза (Jinno,2011). Однако механизм, который генерирует эти различия в ответе, нуждается в дальнейшем исследовании различий в синтезе RA вдоль этой оси, а также сигнальных систем, необходимых для ответа на RA, включая RA рецепторы и ядерные рецепторные коактиваторы и корепрессоры.

Мутации RBP приводят к сходному снижению в супрапирамидальном листке, поскольку воздействие экзогенной RA подразумевает, что потеря RBP также может приводить к увеличению передачи сигналов RA в гиппокампе. RBP впервые был описан как синтезируемый печенью связывающий белок, который транспортирует ретинол в кровообращении и является важным, напр., для перемещения ретинола через плаценту в эмбрион (Quadro et al.,2005). Однако его экспрессия в головном мозге вряд ли сравнима с такой ролью, поскольку энзимы, необходимые для окисления ретинола в активную RA присутствуют в очень немногих регионах головного мозга (Wagner et al.,2002). Ранее было предположено, что RBP не важен для головного мозга, учитывая что RA не пересекает энцефало-гематологический барьер (Breustedt et al.,2006); однако, RBP широко экспрессируется в головном мозге как мышей (не опубликовано), так и приматов (Komatsu et al.,2005). В головном мозге сродство этого белка к RA, ранее не учитывалось, поскольку уровни RA в плазме были очень низкими (Breustedt et al.,2006), и, казалось, вряд ли важны для её функции в головном мозге. То, что нулевые RBP мутанты приводили к снижению пролиферации в том же направлении, что и при избытке RA указывает, что RBP может снижать действие RA и снижение этого связывающего белка увеличивает передачу сигналов RA. RBP может служить буфером для RA или вполне возможно, что RBP может участвовать в секреции ретиноидов из нейральных клеток, сходным образом, что секреция RBP из печени, скомбинированная с высвобождением ретинола (Ronne et al.,1983). Чтобы решить вопрос необходимо знать о его функции относительно CRABPI, который обладает в 10 раз более высоким сродством к RA, чем RBP (Fiorella and Napoli,1991; Breustedt et al.,2006), хотя относительные количества RBP и CRABPI неизвестны. Различие может существовать в субклеточном распределении белков, напр., RBP ассоциирует с комплексом Golgi и секреторными пузырьками (Suhara et al.,1990), тогда как CRABPI присутствует в околоядерном местоположении (Levadoux-Martin et al.,2006) и также транспортируется в ядро (Gaub et al.,1998); их клеточная локализация должна влиять на фракцию RA, связанную с обоими. Было бы интересно установить, существуют ли нулевые CRABPI мутации у мышей, которые бы выглядели в основном нормальными (Gorry et al.,1994), демонстрируя эффект на клеточную пролиферацию в гиппокампе.

RA-обеспечиваемые различия между инфрапирамидальным и супрапирамидальным листками могут регулировать др. процессы в листках помимо клеточной пролиферации. Хотя большинство аспектов зубчатой извилины идентичны в этих листках, отличающие их свойства идентифицированы. Различия гранулярных клеток проявляются в длине дендритов (Claiborne et al.,1990) , а также в плотности их шипов (spines) (Desmond and Levy,1985). Существуют различия и в ранимости клеток; напр., дефицит IL-2 приводит к боле значительной потере количества гранулярных клеток в инфрапирамидальном, чем в супрапирамидальном листке (Beck et al.,2005), в то же время инфрапирамидальный листок обнаруживает более значительную чувствительность к гипоксии (Hara et al., 1990). Мутация Lmx1a у Dreher мышей преимущественно приводит к потере инфрапирамидального листка (Sekiguchi et al.,1992), тогда как мутация EphB2 приводит к потере непосредственно латеральной порции супрапирамидального листка (Catchpole and Henkemeyer,2011). Ряд нейронов может отличаться между листками, напр., у двух линий склонных к судорогам мышей количества гранулярных и basket клеток были выше в супрапирамидальном, чем в инфрапирамидальном лстке (Wimer et al.,1990). Активность гранулярных клеток в супрапирамидальном листке, как было установлено, выше, чем в инфрапирамидальном листке, как было определено по экспрессии непосредственно раннего гена zif268 (Schmidt et al.,2012), в том же самом сообщении приводится список многочисленных примеров различий в стыкуемости. Источник RA, из RALDHs в менингиальных оболочках также предоставляет RA для развивающейся ЦНС (Zhang et al.,2003) , так. напр., менингиальная RA регулирует развитие переднего мозга (Siegenthaler et al.,2009). RA может быть среди факторов, синтезируемых менингиальными оболочками, необходимыми для постнатального развития инфрапирамидального листка, принимая во внимание, что удаление менингиальных оболочек приводит к неспособности развития этого листка (Hartmann et al.,1992).

В противоположность влиянию, обнаруженному в данном исследовании, что экзогенная RA воздействующая in vivo или in vitro ингибирует пролиферацию, исследование Jacobs et al. (Jacobs et al.,2006) показало, что витамин А у мышей необходим для дифференцировки нейронов в SGZ, но не оказывает заметного эффекта на клеточную пролиферацию. Наши предыдущие находки (Crandall et al.,2004; Sakai et al.,2004) и находки других (Jung et al.,2007), выявили, что воздействие RA может ингибировать клеточную пролиферацию (и нейрогенез) в SGZ или SVZ. Возможно, что эти различия могут частично отражать тип исследуемого предшественника; Jacobs et al. изучали предшественники, меченные вследствие воздействия BrdU в течение более 6 дней в противоположность более короткому воздействия в 6 ч BrdU, использованном в данном исследовании. Неожиданно все параметры нейрогенеза, измеренные Jacob et al. (2006) в гиппокампе, которые менялись в результате дефицита витамина А, оказывались необратимыми при добавлении RA, указывая на некоторые дополнительные, независимые от RA, роли ретинола.

Немного сообщений об исследовании относительных различий в нейрогенезе между листками зубчатой извилины получили противоположные данные относительно уровней, напр., жизнеспособности. Сообщалось, что жизнеспособность BrdU-меченных клеток выше в супрапирамидальном. по сравнению с инфрапирамидальным листком (Ambrogini et al.,2000) , тогда как более недавнее исследование показало противоположный результат (Snyder et al.,2009) который исчезал с возрастом (Snyder et al.,2011). Эти различия могут быть обусловлены различиями во времени выживания, варьирующими от 15 до 28 дней, или межлинейными различиями. Последствия таких различий для функции гиппокампа пока неизвестны. Однако детальное исследование Jinno (2011) пространственных различий в нейрогенезе выявило огромное количество calretinin-позитивных клеток, маркер незрелых гранулярных клеток, в супрапирамидальном в противоположность инфрапирамидальному листку дорсальной части зубчатой извилины (dentate gyrus), где располагаются calretinin-позитивные клетки. Базируясь на этих находках Jinno (2011), что нейрогенез имеет свой рисунок как в дорсо-вентральной, так и suprapyramidal/infrapyramidal ориентации и что взаимная соединенность и функция нейронов гиппокампа обнаруживает различия такой организации, было предположено, "that the topographic organization of the neural circuits might contribute to these interblade differences in adult neurogenesis."

Итак, данное исследование идентифицировало асимметрию в передаче сигналов RA между супрапирамидальныи и инфрапирамидельным листком зубчатой извилины и это различие может управляться с помощью градиента RA в зубчатой извилине от локального источника RALDH1 и RALDH2 в менингиальных оболочках. Такой градиент оказывается параллельным его действию как морфогена в эмбрионе и может помогать регулировать те процессы, обнаруживающие различия в двух листках. Нельзя исключить, что относительные различия в эффекте RA на супрапирамидальный и инфрапирамидальный листки отражают внутренне присущие различия в передаче сигналов RA между клетками двух листков. Помимо асимметричного распределения RALDHs, не обнаружено различий др. белков, которые обеспечивают передачу сигналов RA, между двумя листками, включая RARbeta, RARgamma, CRABPI и RBP. Сходным образом, возможно, что различия в клеточной пролиферации между двумя листками могут использовать факторы, интегральные для двух листков. Принимая во внимание находки, что как экзогенная RA , так и мутации RBP устраняют различия между двумя листками и что в органотипической культуре срезов RA ингибирует клеточную пролиферацию, простейшим объяснением может быть то, что различия обусловлены существованием асимметрии в концентрации RA. Эта гипотеза будет проверяться в дальнейшем с помощью манипуляций с этим предполагаемым несоответствием путем нулевых мутаций др. генов, необходимых для передачи сигналов RA.