Посещений:
РЕГИОНАЛИЗАЦИЯ


ЛАТЕРАЛЬНОЙ ПЛАСТИНКИ МЕЗОДЕРМЫ ТУЛОВИЩА

Role of paraxial mesoderm in limb/flank regionalization of the trunk lateral plate
Miyuki Noro, Hiroki Yuguchi, Taeko Sato, Takanobu Tsuihiji, Sayuri Yonei-Tamura, Hitoshi Yokoyama, Yoshio Wakamatsu, Koji Tamura
Developmental Dynamics Volume 240, Issue 7, pages 1639–1649, July 2011. | DOI: 10.1002/dvdy.22666

To understand the developmental mechanism that determines limb size and the consequent limb-to-trunk proportions in the tetrapod body, we investigated the role of the paraxial mesoderm in the specification of the limb and flank fields in the chick embryo. We found that the paraxial mesoderm subjacent to the limb field can affect the size of the limb bud along the anterior–posterior and proximal–distal axes. We also found that the paraxial mesoderm subjacent to the flank plays roles in suppressing the emergence and growth of the limb bud and in promoting flank-specific apoptosis in the lateral plate mesoderm. Our results suggest that signals from the paraxial mesoderm specify the limb and flank fields in the competent lateral plate mesoderm. Developmental Dynamics 240:1639–1649, 2011. © 2011 Wiley-Liss, Inc.

Челюстные позвоночные (gnathostomes) имеют парные придатки (плавники или конечности) с видо-специфическими размерами и позициями (Supp. Fig. S1, which is available online). Недавние исследования пролили свет на онтогенетические механизмы конечностей и плавников, но многое ещё осталось выяснить от механизмах, определяющих пропорции тела, включая положение и размеры конечностей у gnathostomes. Несмотря на важность Hox кода для региональной спецификации туловища у gnathostome позвоночных (Burke et al.,1995; Rancourt et al.,1995; Cohn et al.,1997; Cohn and Tickle,1999; Minguillon et al.,2005), всё ещё неизвестно, как Hox code транслируется в пропорции тела у эмбриона. Хотя некоторые гены, включая Hox гены, влияют на размер зачатка конечности, если экспрессируются эктопически, большинство причинных изменений в размере зачатка конечности наблюдается только вдоль проксимо-дистальной оси. В настоящее время, Tbx18 является единственным известным фактором, которые может изменять размер поля конечности вдоль передне-задней оси (Tanaka and Tickle,2004).
У эмбрионов кур специфические регионы латеральной пластинки мезодермы (LPM) дают мезенхиму зачатка конечности, которая, в свою очередь, индуцирует лежащую поверх эктодерму к образованию апикального эктодермального гребня (AER) на дорсо-вентральной границе зачатка конечности, путем секреции fibroblast growth factor 10 (FGF10; Ohuchi et al.,1997; Xu et al.,1998; Yonei-Tamura et al.,1999). Индуцированный AER секретирует FGF8 и FGF4, чтобы создать петлю позитивной обратной связи с экспрессией FGF10 из подлежащей мезенхимы и/или SHH из зоны поляризующей активности (ZPA). Эта петля поддерживает пролиферацию мезенхимных клеток, чтобы способствовать выпячиванию конечности (e.g., Saunders,1948; Rubin and Saunders,1972; Saunders et al.,1976; Laufer et al.,1994; Niswander et al.,1994; Capdevila and Izpisua Belmonte,2001; Fernandez-Teran and Ros,2008). Эти механизмы рассматриваются как общие среди gnathostome позвоночных. Фланкирующая область между передними и задними конечностями компетентна к формированию дополнительных конечностей в ответ на FGFs (Cohn et al.,1995; Crossley et al.,1996; Yonei-Tamura et al.,1999 [chick]; Tanaka et al.,2000 [mouse]; Abe et al.,2007 [zebrafish]; Yonei-Tamura et al.,2008 [cartilaginous fish] and references therein). Однако несмотря на свой потенциал формировать дополнительные конечности на флангах gnathostome виды с третьей парой конечностей никогда не появляются. Следовательно, некий механизм д. специфицировать размер полей конечностей внутри фланкирующей области и предупреждать образование дополнительных конечностей. Хотя нет ткани, которая бы непосредственно ограничивала бы развитие области limb/flank, осевая мезодерма и параксиальная мезодерма, как известно, отвечают за морфогенез конечностей (Stephens and McNulty,1981; Strecker and Stephens,1983; Stephens et al.,1991; Geduspan and Solursh,1992; Crossley et al.,1996; Dealy,1997) и качественные особенности конечностей (Saito et al.,2002,2006), и накапливаются данные, подтверждающие, что параксиальная мезодерма играет ключеву роль в позиционировании конечностей (Burke et al.,1995; for review, see Capdevila and Izpisua Belmonte,2001).
В данном исследовании мы изучали роль параксиальной мезодермы в региональной спецификации limb/flank у эмбрионов кур. Было установлено, что уровень пресомитной мезодермы (PSM), соответствующий передним конечностям, участвует в возникновении и росте зачатка конечности, но уровень PSM, соответствующий флангу, индуцирует апоптоз в фланговой LPM. Было также установлено, что дополнительный зачаток конечности, индуцируемый на фланге, предупреждает апоптоз фланговой LPM. Эти результаты подтверждают, что параксиальная мезодерма играет жизненно важную роль в регуляции размера конечности путем спецификации limb/flank полей в LPM, и предупреждения образования дополнительных зачатков конечностей в фланговой LPM.

RESULTS

Figure 1. A forelimb-level ablation of the presomitic mesoderm (PSM) results in the failure of limb-bud outgrowth in the adjacent lateral plate mesoderm. Schematic representations of the manipulations performed are shown at left. The approximate position of the PSM is indicated as the prospective somite number. Individually outlined numerals represent somites that are already segmented. The curved lines indicate the position of the control prospective limb field. The results of each manipulation and subsequent 36-hr incubation are shown at right. A–B?: Dorsal and ventral views of the forelimb region of the operated embryos. The apical ectodermal ridge (AER) is marked by fgf8 expression. These embryos showed poor outgrowth of the limb bud and decreased AER on the ablated side. The brackets show the extent of the fgf8-expressing AER. C,D:Sim1 expression in embryos incubated for 10 hr after ablation. Ablation had no effect on Sim1 expression in the adjoining intermediate mesoderm, when PSM ablation corresponding to one (C) or five (D) somites was performed. Asterisk indicates the ablated side. Arrowheads indicate Sim1 expression in the intermediate mesoderm adjoining the ablated site.

Figure 2. Ablation of the flank-level presomitic mesoderm (PSM; from the posterior end of the forelimb to the flank level) causes expansion of the limb bud. Schematic representations of the manipulations performed are shown on the left. The results of each manipulation are shown in A–C and D. A–D: Dorsal views of the operated embryos. A: The fgf8-positive apical ectodermal ridge (AER) was larger on the ablated side that on the contralateral control side. Brackets show the extent of the AER. B:Shh expression showed no difference between the control and ablated sides, although the limb bud was larger on the ablated side. C:Fgf10 expression was stronger and the limb bud was larger on the ablated side. D: To eliminate the effect of orientation of the developing embryo, the contralateral PSM was ablated, and fgf10 expression was examined. As with the right-side PSM ablation, left-side flank ablation resulted in increased limb bud protrusion. An asterisk indicates the ablated side.

Figure 3. Cell proliferation and death after presomitic mesoderm (PSM) ablation. A: Reduced proliferation of limb mesenchyme cells after forelimb-PSM ablation. The number of phospho-histone H3-positive cells decreased after part of the PSM at the forelimb level was ablated. Compare the manipulated limb bud at right (exp.) with the contralateral limb bud at left (cont.). B: Quantification (described in the Experimental Procedures section) of the phospho-histone H3 staining in (A). The ratio of positive cells (%) in a certain area of the limb bud was significantly decreased in the PSM-ablated (exp.) side compared with the control side (cont.). **P менее 0.001. C: Ablation of the flank-level PSM. Phospho-histone H3 staining shows that more cells were proliferating in the limb bud of the operated limb bud (right) than in the control side (left). D: The proportion (%) of proliferating cells 24 hours after the manipulation in (C). *P менее 0.05. B,D: The number of phospho-histone H3-positive cells from three or four tissue sections are summarized. The results are representative of five independent experiments. Student's t-test was used to determine significant differences. Error bars indicate SD. E: No change in apoptosis in the forelimb-level PSM-ablated limb bud. Only a few active caspase 3-positive cells were observed in either the manipulated limb bud (right) or the control (left).

Figure 4. Presomitic mesoderm (PSM) transplantation from the flank level to the forelimb level results in a smaller limb bud on the operated side. Schematic representations of the manipulations performed are shown on the left. The results of each manipulation after (A) 36-hr or (B) 48-hr incubation are shown on the right. Asterisk indicates the operated side. A: The fgf8-positive apical ectodermal ridge (AER) was narrower in the limb bud on the operated side. Arrowheads indicate the anterior and posterior ends of the forelimb buds. B: Each pair of lines drawn from the midline of the embryo (cr and cl) and from the base of the limb buds (rr and rl) are identical in length between the right and left sides, demonstrating that the length of the limb bud was reduced on the operated side. Asterisk indicates the manipulated side.

Figure 5. Presomitic mesoderm (PSM) transplantation from the forelimb level to the flank-level results in an enlarged forelimb bud on the operated side. Schematic representations of the manipulations performed are shown at left. A–C: The results of each manipulation and subsequent (A,A?) 24-hr, (B,B?) 36-hr, or (C,C?) 48-hr incubations are shown on the right. In (A?,B?), fgf8 expression shows the posterior extension of the AER for the limb bud on the operated side. (C,C?) The transplantation resulted in the limb bud being enlarged in both the width and length on the operated side. The asterisk indicates the operated side. Brackets show the extent of the fgf8-expressing AER. Arrowheads indicate the anterior and posterior ends of the forelimb buds. Asterisk indicates the manipulated side.

Figure 6. Transient apoptosis in the flank lateral plate mesoderm (LPM). A–D: Whole-mount TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated deoxyuridinetriphosphate nick end-labeling) staining of chick embryos at stage 16 (A), stage 17 (B), stage 18 (C), and stage 19 (D). TUNEL-positive cells were seen in the flank lateral region of stage 17–19 embryos (arrowheads). E: High-power view of a stage 19 embryo showing many TUNEL-positive cells in the posterior region of the flank LPM. F,G: Flank apoptosis was also detected in the limb-forming region of the gecko embryo. H,I: Transverse sections of chick embryos stained with anti-active caspase-3 at stage 17 (H: forelimb level, I: flank level). H?,I?: Merged images (DAPI [4?,6-diamidine-2-phenylidole-dihydrochloride] and caspase-3) are shown. Many active caspase-3-positive cells were distributed in the flank LPM at stage 17. J,K: Transverse sections of mouse embryos at the level of the forelimb bud (J) and the flank (K), stained with anti-active caspase-3 at the limb-forming stage. J?,K?: merged images (DAPI and caspase-3) are shown.

Figure 7. Flank-specific apoptosis can be suppressed by either fibroblast growth factor (FGF) application or the ablation of flank-level presomitic mesoderm (PSM). Schematic representations of the manipulations performed are shown at left. A,B: FGF inhibits flank apoptosis. A: Whole-mount TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase–mediated deoxyuridinetriphosphate nick end-labeling) analysis 24 hr after an FGF8-soaked bead was implanted into the lateral flank at stage 14. The head of the embryo (stage 18) is situated toward the left side of the picture. Note that the anterior flank region around the FGF-soaked bead is devoid of TUNEL-positive cells, compared with the contralateral side, which had received a phosphate buffered saline (PBS) -soaked bead. B: TUNEL staining of a section shows a decrease of apoptotic cells in the flank lateral plate mesoderm (LPM) on the FGF8-treated side (right side of the section). C,C?: Flank-level PSM ablation results in decreased apoptosis in the adjacent LPM. C: Apoptosis in the flank LPM is decreased at the level of the PSM ablation. A magnified view is shown in C?. The brackets indicate the level of PSM ablation. fl, forelimb bud.

Figure 8. Fibroblast growth factor (FGF)signaling is required for the survival of limb-forming cells. A,B: Apoptosis is induced by insufficient FGF in the limb bud. A: The FGF inhibitor SU5402 induced apoptosis in the prospective forelimb field lateral plate mesoderm (LPM). B: Apical ectodermal ridge (AER) ablation resulted in apoptosis of the underlying limb mesenchyme. C: Working hypothesis on the fate of the flank LPM. Left: In the prospective flank region of the normal embryo, FGF8-responsive cells are removed from the LPM by apoptosis. Right: In the prospective flank region of the presomitic mesoderm (PSM) -ablated embryo, FGF8-responsive cells remain in the flank LPM. D,E: Schematic representations of the manipulations performed are shown in the middle. The results of each manipulation are shown in D,D? and E,E?, and magnified views are shown in D? and E?. E,E?: FGF7 induced an extra limb bud in the flank of the PSM-ablated embryo.

DISCUSSION


Предполагалось, что параксиальная мезодерма ответственна за региональную спецификацию туловища, из-за своих четких границ экспрессии Hox и корреляции между специфическими границами экспрессии генов Hox и выпячиваниями конечностей (Burke et al.,1995). Многочисленные сообщения показали, что альтерации в экспрессии генов Hox ведут к антериоризации или постериоризации позвоночного столба и грудной клетки, а некоторые из этих мутаций обнаруживают сдвиг в позиции конечностей (Horan et al.,1995; Rancourt et al.,1995; Cohn et al.,1997; Chen et al.,1998; van den Akker et al.,2001; Wellik and Capecchi,2003; McIntyre et al.,2007; Wellik,2007, and references therein). Однако неясно, ответственны ли Hox гены в параксиальной мезодерме за спецификацию поля конечности, поскольку они экспрессируются также в др. тканях, включая саму LPM (Burke et al.,1995). Saito et al. (2006) непосредственно манипулировали с PSM и показали, что PSM участвует в спецификации передних и задних конечностей, но роль PSM's в региональной спецификации туловища не была исследована.
В данном исследовании мы изучали роль параксиальной мезодермы в региональной спецификации туловища. Мы установили, что PSM выполняет разные роль в возникновении и росте зачатков конечностей, в зависимости от их позиции воль передне-задней оси (Fig. 9A). PSM уровня передних конечностей способствует росту зачатка конечности и увеличивает AER, даже будучи трансплантированной на уровень фланга (Fig. 5). В соответствии с его функцией устранение PSM уровня передних конечностей вызывает снижение клеточной пролиферации (Fig. 3). PSM уровня фланга, напротив, супрессирует рост зачатка конечности в LPM, даже будучи трансплантированной на уровень передней конечности (Fig. 4), возможно посредством индукции апоптоза. Устранение PSM уровня фланга способствует клеточной пролиферации и дает более крупный зачаток конечности (Figs. 2-4). Немногие апоптические клетки обнаруживаются в зачатке конечности (Fig. 3 and not shown), но увеличение в размере может быть связано со снижением апоптоза на фланге (Fig. 7C,C?). У эмбрионов кур передне-задние перемещения клеток, как было установлено, происходят в LPM вокруг зачатка передней конечности (Wyngaarden et al.,2010). Некоторая популяция из клеток передней конечности может перетекать в область фланга. Устранение PSM уровня фланга и возникающее в результате снижение апоптоза в фланкирующей LPM может предупреждать этот исток клеток зачатка передней конечности, приводя к возникновению более крупного зачатка. Поскольку устранение PSM на уровне фланга в комбинации с действием FGF7 приводит к образованию эктопического зачатка конечности, апоптоз во фланговой LPM может удалять клетки, которые компетентны к формированию зачатка конечности.

Figure 9. Summary of the results. A: Both limb bud growth and flank apoptosis are induced by the paraxial mesoderm. Distinct regions of the paraxial mesoderm have different functions for limb induction. B: Fibroblast growth factor-8 (FGF8) -responsive cells are eliminated through apoptosis in the flank lateral plate mesoderm (LPM) field during the limb bud-forming period.

В этом исследовании мы выявили, что PSM важна для спецификации поля конечности, но это не исключает возможности вклада и др. тканей, включая аутокринный эффект LPM. Wnt2b, экспрессируемый в поле презумптивной передней конечности в LPM перед выростом зачатка конечности, достаточен для индукции дополнительной конечности на фланге (Kawakami et al.,2001), и этот фактор в LPM не может быть индуцирован за счет эктопической трансплантации параксиальной мезодермы в каудальную часть туловища (Saito et al.,2006). Хотя вышестоящая регуляция экспрессии wnt2b в LPM неизвестна, его экспрессия может регулироваться независимо от параксиальной мезодермы. Следовательно, возможно, что паракринные эффекты PSM и аутокринная регуляция в LPM одновременно и аддитивно специфицируют размер, позицию и рост конечности.
Мы определили экспрессию Sim1 после того как была устранена соседняя PSM, установили, что промежуточная мезодерма остается интактной, но всё ещё способна к тому, чтобы промежуточная мезодерма участвовала в спецификации поля конечности. Промежуточная мезодерма развивается в три ткани (пронефросы, мезонефросы и метанефросы) и дифференцируется в соответствии с сегментацией прилегающей параксиальной мезодермы (Hiruma and Nakamura,2003). У эмбрионов кур мезонефросы формируются позади сомита 15; эта позиция соответствует границе между шеей и зачатком передней конечности (Hiruma and Nakamura,2003). Параксиальная мезодерма, как было установлено, необходима для формирования пронефросов, а индукция пронефросов необходима для развития мезонефросов (Mauch et al.,2000). PSM на уровне передней конечности может влиять на соседнюю промежуточную мезодерму, чтобы индуцировать поле конечности в соседней LPM. Интересно, что уровень передней конечности в промежуточной мезодерме экспрессирует fgf8 и Wnt2b (Crossley et al.,1996; Kawakami et al.,2001), хотя функция промежуточной мезодермы в инициации конечностей всё ещё остается спорной (Geduspan and Solursh,1992; Crossley et al.,1996; Fernandez-Teran et al.,1997). Поскольку параксиальная мезодерма и LPM разделены с помощью промежуточной мезодермы, секретируемые факторы из параксиальной мезодермы д. влиять на LPM или непосредственно или косвенно посредством промежуточной мезодермы. Молекула. которая могла бы регулировать судьбу LPM это Growth and differentiation factor 11 (Gdf11), член сверхсемейства Transforming growth factor beta (Tgf-β) , который экспрессируется в задней части PSM и является регулятором экспрессии Hox генов (McPherron et al.,1999; Liu et al.,2001). Более того, Gdf11 нокаутные мыши обнаруживают постериоризацию зачатка задней конечности (McPherron et al.,1999), а начало экспрессии Gdf11 в задней части PSM слегка раньше, чем начало экспрессии Tbx5/4 в LPM (Liu et al.,2001; Saito et al.,2002), подтверждая. что этот ген является хорошим кандидатом на роль регулятора судьбы задней части LPM. Др. члены сверхсемейства Tgf-β могут быть регуляторами судьбы передней части LPM.
Время спецификации поля конечности в LPM также важно для понимания молекулярной природы её спецификации с помощью PSM. Tbx5, который в действительности не обладает специфичным для передней конечности доменом экспрессии, но также экспрессируется в передней части фланга (Saito et al.,2006), необходим для инициации зачатка передней конечности (Ng et al.,2002; Takeuchi et al.,2003; Rallis et al.,2003; Hasson et al.,2007). Tbx5 не экспрессируется в LPM до стадии 13 у эмбрионов кур (Saito et al.,2002), а судьба LPM для регионализации forelimb-flank-hindlimb может быть изменена после стадии 13 (Saito et al.,2002,2006). Также показано, что позиционирование зачатков конечностей специфицируется ещё до того, как LPM расщепится на соматический и спланхнический слои мезодермы (Yonei-Tamura et al.,2005), это завершается на ст. 20-сомитов (приблизительно ст. 13; Funayama et al.,1999). Наши результаты согласуются с выше приведенными сообщениями, поскольку эмбрионы не обнаруживают дефектов, когда сомиты удаляли на ст. 12 или позднее (data not shown), указывая тем самым, что индуктивные эффекты PSM и/или компетентность LPM могут исчезать после этой стадии.
В данном исследовании мы продемонстрировали, что сигналы от PSM участвуют в детерминации размера передних конечностей и соотв. в регионализации туловища. Так, недавно было показано Keyte and Smith (2010), широкое поле конечности может давать более крупную конечность. Новорожденные сумчатых имеют более крупные передние конечности, чем их eutherian аналоги. У эмбрионов опоссума 8 сомитов ассоциируют с полем передней конечности, тогда как 5-6 сомитов ассоциируют с таковым у мышей и др. плацентарных млекопитающих. Т.о., вариации в размере конечности могут быть приписаны различиям в количестве ассоциированных сомитов и организации PSM ткани у этих животных. Однако ящерицы и амфибии обнаруживают чрезвычайную изменчивость в количестве у них позвонков в туловище и относительном размере их конечностей. Мы может подсчитать количество сомитов на каждом уровне путем наблюдения спинальных нервнов у взрослых, поскольку плечевые нервы, по-видимому, индуцируются с помощью зачатка конечности (Ohuchi and Noji,1999; Turney et al.,2003), при этом один спинальный нерв, соответствует одному сомиту. Следовательно, количество корешков спинальных нервов, которые вступают в конечность указывают на количество сомитов, ассоциированных с полем конечности во время эмбриогенеза. У ящериц количество нервных корешков, которые вносят вклад в плечевое сплетение (обычно 4r) не обнаруживает корреляции с размером конечности (неопубликованные результаты, базирующиеся на наблюдениях у Bipes, Gerrhonotus, Chlacides, Paroedura и Ameiva). Вместо этого количество сомитов, ассоциированных с флангом у ящериц может вносить вклад в относительные пропорции конечностей и туловища. В самом деле, существует известная корреляция между уменьшением конечностей и удлинением туловища в некоторых линиях ящериц (e.g., Wiens and Slingluff,2001), а виды ящериц с маленькими конечностями и удлиненным туловищем обнаруживают тенденцию к большему числу туловищных позвонков (и, следовательно, к большему числу туловищных сомитов), чем их близкие родственники (e.g., Presch,1975; Greer,1987; Caputo et al.,1995).
Т.о., разные пропорции количества сомитов в поле конечности и фланга (т.e., относительные пропорции PSMs, вносящих вклад в эти поля) могут объяснить различия между видами с крупными и маленькими конечностями. необходимы дальнейшие исследования для проверки этой гипотезы, она предоставляет базу для будущих попыток выяснить механизм, с помощью которого разные пропорции тела используются у gnathostomes.
Сайт создан в системе uCoz