Хроническая боль превалирует почти у 20% жителей Европы [1] сходные подсчеты получены для Сев. Америки. Симптом плохо контролируется имеющимся лечением в результате персональная и социо-экономическая ноша значительны. Так, большинство обезболивающих лекарств происходят из двух классов лекарств, опиатов и нестероидных противовоспалительно подобных лекарств, и обладают или низкой эффективностью или значительными побочными эффектами. Существует поэтому существенная необходимость разработки новых обезболивающих воздействий. Использование человеческой генетики для идентификации внутренних факторов, которые вносят вклад в состояние хронической боли, является привлекательным по многим причинам. Состояние хронической боли, а также экспериментально вызываемая боль, как было установлено, обладают существенным генетическим компонентом [2]. Изучение близнецов показало наблюдаемую наследуемость приблизительно в 50% для разных признаков боли [3]. Проявление боли в ответ на экспериментальные стимулы, такие как ожоги кожи или клинические патологии, такие как дегенерация суставов, как известно, существенно варьируют. Ясно, что ряд факторов, включая личностные особенности, ожидаемость и ментальное состояние модулируют выраженность хронической боли и эти свойства сами по себе генетически обусловлены. Моделирование на близнецах, однако, показывает, что существуют два отдельных фактора генетической предрасположенности [4], включая варианты, которые модулируют чувствительность к боли, а также те, которые опосредуют страх и депрессию. Ряд подходов к генетике чувствительности к боли используется, включая проверку редких (моногенных) синдромов нечувствительности к боли (reviewed in [5]) и генов кандидатов, идентифицированных путем профилирования транскрипции у модельных животных [6]. Изучение генов кандидатов у людей с хронической болью оказалось неубедительным и подтвержденные ассоциации генов кандидатов всё ещё отсутствуют (reviewed in [4] and [7]). Целью исследования явилась проверка влияния генетической изменчивости, особенно редких вариантов, имеющих минимальную аллельную частоту менее 5%, в отношении чувствительности к боли у обычных добровольцев. Были протестированы две гипотезы, что одиночный редкий вариант, оказывающий большой эффект на чувствительность к боли и что величина изменчивости будет отличной у чувствительных и нечувствительных индивидов.

Попытки стандартизировать и оценить количественно чувствительность к боли у людей привели к введению стандартизированных термальных, механических или химических стимулов, которые активируют ноцицептивную систему (болевую передачу сигналов). Такое quantitative sensory testing (QST) было использовано, чтобы показать, что чувствительность индивидов к экспериментальной боли предсказывает риск развития хронической боли после хирургических вмешательств, таких как иссечение грыж [8] и артроскопии [9]. Предоперативная чувствительность к боли является основным фактором риска хронической послеоперационной боли подтверждает, что исследование генетической изменчивости, лежащей в основе экспериментальной боли, может быть важным подходом. Болевые стимулы, места их применения и методы оценки все были стандартизированы - в отличие от спонтанной боли при болезненном состоянии. Дальнейший успех, связанный с генетическим влиянием на чувствительность к боли, изучен скорее, чем с её влиянием на болезнь и прогрессирование болезни. В данном исследовании мы попытались определить, могут ли редкие варианты ассоциировать с крайними случаями болевой чувствительности у здоровых добровольцев. Используя тепловой стимул QST в большой выборке здоровых близнецов добровольцев (www.twinsuk.ac.uk), мы наблюдали нормальную изменчивость к боли, используя два объективных теста, heat pain threshold (HPT) и heat pain suprathreshold (HPST). В результате изучения популяции более чем из 2500 индивидов, с помощью QST, мы сравнили приблизительно 200 индивдов, отнесенных к категории с высокой и низкой чувствительностью к HPST (приблизительно по 100 каждой; TUK1 set) затем повторили процесс у дальнейших 200 индивидов (TUK2 set).

Наш первоначальный анализ направлен на идентификацию генов, обладающих single nucleotide variants (SNVs) у чувствительных и нечувствительных к боли субъектов, с особым упором на на несинонимные экзонные и нонсенс мутации. Большое число методов предлагается для такого анализа [40]-[44]. Мы использовали батарею таких тестов, включая как старые, так и новые техники, а также тесты, проверяющие ранги гипотез; различия между болевыми группами (чувствительные против нечувствительных) в популяции субъектов, обладающих редкими вариантами; различия в концентрации редких вариантов, взвешанных по функции; и многопараметрические различия в паттернах вариантов между двумя группами, позволяющие одновременный избыток в каждой болевой группе какого-либо одиночного редкого варианта в гене.

Мы не выявили одиночный редкий вариант, обнаруживающий статистически достоверную ассоциацию с чувствительностью к тепловому воздействию после множественных коррекций тестов. Наиболее сильный сигнал был выявлен для GZMM, серин протеазы из иммунных клеточных гранул. Однако наш сетевой анализ идентифицировал свыше 30 генов, обладающих редкими SNVs, относящихся к пути Angiotensin II, который ранее был увязан с болевым фенотипом в ряде исследований.

Discussion

Пациенты с хронической болью обнаруживают повышенную чувствительность к болевым стимулам, такими как воздействие высокой температурой, давлением по сравнению с контролем [19], а также к не болевым стимулам, таким как звук [20]. Эти наблюдения подтверждают мнение, что преобразование внешних стимулов усиливается или преувеличивается при состояниях хронической боли. Т.о., люди, обладающие вариантами генов, ассоциированными с большей чувствительностью к тепловым болевым воздействиям, обладают повышенным риском к возникновению хронической распространенной боли. Предпосылкой данной работы стало лучшее понимание генетического влияния на преобразование обычной боли в свете биологических путей, лежащих в основе патологии хронической боли. В этом проекте мы применили новые методы - биотехнологический и статистический - для идентификации редких вариантов последовательности, вносящих вклад в болевую чувствительность у нормальных индивидов. Появление высокопродуктивных технологий по генотипированию помогает распутывать этиологию многих сложных заболеваний и количественных признаков. В частности, исследования genome-wide association (GWA) открыли множество общераспространенных вариантов, ассоциированных с количественными фенотипами. Однако, GWA обладает недостаточной мощностью выявлять ассоциации редких вариантов, а идентифицированные общераспространенные варианты пока объясняют только часть наследуемых признаков. Секвенирование всего генома становится более рентабельным и теперь осуществимо для проверки эффекта редких вариантов. Гипотеза, что многие редкие варианты объясняют пропорцию отсутствия наследования, привлекает теперь больше внимания [21].

Редкие варианты с умеренной или высокой пенетрантностью оказываются ассоциированными с рядом экстремальных фенотипов (summarised in [22]). Для количественных фенотипов выборка и сравнение экстремальных признаков становится приемлемой стратегией для идентификации вызывающих болезнь редких вариантов при секвенировании экзома [23]. В таком новом экзомном проекте болевой чувствительности у нормальных индивидов не было идентифицировано генетических вариантов с крупными эффектами. Принимая во внимание, что сила статистики после применения строгого сложного теста коррекции ограничивается, мы не можем исключить умеренный или малый вклад индивидуальных SNVs в экспериментальный болевой фенотип. В самом деле, мы отметили разные вклады редких вариантов у субъектов с болевой чувствительностью и нечувствительностью (Figure S2), это предполагает обогащение множественными SNVs с небольшим эффектом на крайности при нормальном распределении. Данное исследование также предоставило подтверждение пригодности метода секвенирования экзома.

Такой подход был успешно использован, хотя и более ограниченно, в выявлении последовательностей генов ионных каналов при эпилепсии [24]. Авт. подчеркивают необходимость анализа клеток и сетей, чтобы оптимизировать информацию, получаемую в таких исследованиях. Различные статистические методы были разработаны для анализа ассоциаций редких вариантов при сложных признаках, но остается недостаточность данных относительно генетической архитектуры, лежащих в основе сложных признаков, таких как восприятие боли. По этой причине мы выбрали для использования разные тесты, базируясь на разных предположениях, чтобы ни один редкий вариант, ассоциированный с болью, не был пропущен.

GZMM был единственным геном, классифицированным ак имеющий "очень высокие" доказательства ассоциации с болевым восприятием температурных воздействий (Table 3 and Figure 2: see Methods: statistical analysis for classification definitions). Он кодирует granzyme M, одну из сериновых протеаз, продуцируемых и хранящихся в гранулах иммунных клеток, таких как лимфоциты и натуральные килеры клеток [25]. Поскольку мы не нашли сообщений об ассоциации с болью в литературе, а granzymes, как известно, играют важную роль при апоптозе [26] и при инициации воспаления: повышенные уровни были обнаружены в ревматоидной синовиальной жидкости [27], а экспрессия granzyme B увеличена при повреждающих атопических дерматитах кожи [28]. В категории "высоких" докзательств, энзим, кодируемый seventh геном, DDAH1, играет роль в генерации nitric oxide путем регуляции концентраций клеточного methylarginine, который в свою очередь ингибируют nitric oxide synthase. Хотя описаны и противоболевая и способствующая восприятию боли роли NO, избыточная продукция NO - вместе со свободными радикалами - вносят вклад в основу восприятия и патогенеза состояний аномальной боли путем ассоциации с NMDA рецептором, обеспечивающим сигнальные события. В подтверждение этого, циркулирующие NO, как было установлено, увеличиваются у пациентов с хронической распространенной болью [29]. Связи между болью и др. генами, представленные в Table 3 (такими как CCNJL и TBK1) пока незначительные.

Чтобы исследовать дальнейшие взаимоотношения между идентифицированными SNV-содержащими генами мы использоали алгоритм по выяснению прямых молекулярных взаимоотношений между биологическими единицами, чтобы идентифицировать вышестоящие регуляторы из набора input генов [30]. Мы идентифицировали 4 регуляторные сети, которые были номинально важны, одна из которых (angiotensin II) оставалась достоверной после коррекции с помощью множественных тестов (correctness p = 1.4Ч10-5, enrichment p = 3.8Ч10-4). Angiotensin II является пептидным гормоном, участвующим в контроле кровяного давления. Эта сеть соединяет 12 из идентифицированных нами генов в причинно-следственную сеть (Figure 3). Причастность Angiotensin II уже была отмечена в отношении центральной боли: он, как было установлено, облегчает связанное с болью поведение у экспериментальных животных [31], включая реакции на термальные стимулы, сходные с теми, которые были исследованы в данной работе. Механизм, по-видимому, осуществляется посредством модуляции нисходящих от головного мозга путей. Блокирование рецепторов к angiotensin II (т. наз. AT1 рецепторов) устраняет некоторое поведение, связанное с болью у моделей с хронической болью, подтверждая тем самым роль эндогенного angiotensin II. Напр., AT-1 рецептор антагонист telmisartan, как было установлено, устраняет боль у крыс, моделирующих боль при сдавливании седалищного нерва [32]. Данные от нескольких небольших клинических исследований на людях оказались противоречивыми [33], [34] , но недавняя фаза II клинических испытаний антагониста рецептора AT2 (AT2 рецепторы экспрессируются в первую очередь центростремительными nociceptors) выявила существенное улучшение проявлений боли в группе пациентов с пост-герпетической невралгией (http://www.spinifexpharma.com.au/DRUG-DI?SCOVERY.html).

Наш анализ причинно-следственных отношений выявил только одно взаимодействие выше генов в нашей базе данных. Однако он позволил выявил два взаимодействия с увеличившимся числом генов из этого исследования, которые могут быть причинно связаны с angiotensin II, до 30 генов. Angiotensin II может быть также причинно связан с известными процессами, имеющими отношение к боли. Напр., PTGS2, ген, кодирующий cyclooxygenase 2 (COX-2, мишень для нестероидных противовоспалительных лекарств) регулируется с помощью angiotensin II [35]. COX-2 продуцирует prostaglandin E2 (PGE2), который высвобождается поврежденными или воспаленными тканями и соединяется с болевыми нервными окончаниями посредством PGE2 рецепторов (т. наз. EP рецепторов), приводя к продукции цАМФ. Это ведет к посттрансляционной модификации нескольких белков мишеней в нервных окончаниях, которые регулируют возбудимость болевых рецепторов, включая контролируемые напряжением натриевые каналы [36]. Современные исследования с использованием методов секвенирования экзома подтвердили мнение, что путь angiotensin II важен для регуляции боли у человека и подтвердили, что генетическая изменчивость пути может влиять на чувствительность к боли, вызываемой высокой температурой, по крайней мере, в популяция Сев Европы.

Третья форма анализа, проведенная на генах мишенях в сети из межбелковых взаимодействий у человека из базы данных BioGRID. Мы задались вопросом, может ли какой-либо белок, кодируемый генами, идентифицированными в данной работе, взаимодействовать непосредственно с белками, играющими роль в восприятии боли. Мы установили известные физические взаимодействия с некоторыми белками. связанными с болью, включая ионные каналы (TRPV1 и Cav2.1), CGRP рецептор и kappa опиоидный рецептор. Ясно, что хотя мы не выявили каких-либо генов, непосредственно ассоциированных с восприятием боли, некоторые играют ключевую роль в процессах, связанных с восприятием и передачей болевых сигналов с помощью их физических и биохимических взаимодействий с важными боль опосредующими комплексами.

Данное исследование подчеркивает важность использования комбинации изощренных аналитических методов для идентификации ассоциаций, лежащих в основе редких вариантов количественных признаков. Поскольку предсказываемый эффект размера относительно невелик и нуждается в крупных выборках, мы достигли прогресса в понимании генетической архитектуры, лежащей в основе чувствительности к термальной боли. Несмотря на недавние успехи в технологии секвенирования ДНК и в статистических методах для анализа таких сложных баз данных, идентификация и последующий анализ ассоциаций индивидуальных вариантов генов остается сомнительным. Мы подтвердили мнение, что angiotensin II играет важную роль в сигнальной трансдукции боли и этот путь нуждается в дальнейшем исследовании.

G. Gregory Neely, Shuan Rao, Michael Costigan, Norbert Mair, Ildiko Racz, Giedre Milinkeviciute, Arabella Meixner, Swetha Nayanala, Robert S. Griffin, Inna Belfer, Feng Dai, Shad Smith, Luda Diatchenko, [ ... ], Josef M. Penninger (g.neely@garvan.org.au )
Construction of a Global Pain Systems Network Highlights Phospholipid Signaling as a Regulator of Heat Nociception
PLoS Genet 8(12): e1003071. doi:10.1371/journal.pgen.1003071

На инбредных линиях мышей и в исследовании когорты близнецов установлено, что боль имеет сильный генетический компонент [1]-[5], с подсчитанной наследственностью ~50%, меньше, чем это характерно для специфических генов, участвующих в регуляции чувствительности к боли. Кроме того, консервация генетических функций между видами и в ходе эволюции действует как пригодный инструмент для развития понимания основных генетических механизмов относительно более специализированных программ и их влияния на поведение [6]. Drosophila является прекрасным модельным организмом для характеристики генетических регуляторов поведения, такого как nociception [7]. Использование генетики Drosophila подчеркивает консерватизм роли для многих генов в детекции и избегании боли от ожогов [8], [9], недавняя работа по механочувствительности подтвердила генетику этого процесса, а также консервацию высокую консервацию внутри phyla [10]. ранее мы описали глобальный in vivo скрининг RNAi по избеганию болевых ощущений от тепловых воздействий у Drosophila и идентификацию сотен новых генов, необходимых у взрослых мух для их проявлений [8]. Теперь мы сконструировали глобальную системную сеть тепловой боли. Наша цель идентифицировать потенциально законсервированные гены и пути, участвующие в восприятии боли.

Один из путей выступает в этой глобальной системной сети, это передача сигналов phosphatidylinositol. Передача сигналов phosphatidylinositol - это каскад вторичного мессенджера, участвующего в последовательном фосфорилировании phosphatidylinositol 4-phosphate (PIP), чтобы генерировать phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) посредством PIP5' киназы (phosphatidylinositol-5-OH kinase; PIP5K), и затем в фосфорилировании PIP2 посредством PI3 киназы (phosphatidylinositol-3-OH kinase; PI3K) , чтобы генерировать phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). В системах млекопитающих передача сигналов фосфолипидов участвует в регуляции восприятия боли [11]-[13], TRPV1 функционирует [14]-[21] и itch [22], но как передача сигналов phosphatidylinositol участвует в восприятии боли у млекопитающих, предмет споров, при этом данные, напр., подтверждают, что PIP2 может или увеличивать или снижать функцию TRPV1 [23], [24]. Исходя из предположения вовлечения передачи сигналов фосфолипидов в наших консервативных функциональных болевых сетях и в контексте противоречивой роли передачи сигналов phosphatidylinositol в восприятии боли, мы разработали генетические подходы для оценки роли передачи сигналов phosphatidylinositol в восприятии боле у млекопитающих.

Способность воспринимать болевые стимулы является критической для выживания животных перед лицом средовых опасностей и поэтому восприятие боли, скорее всего, находится под сильным эволюционным давлением. Используя специфичную для нейронов RNAi нокдаун стратегию у взрослых Drosophila , мы недавно завершили геномную функциональную аннотацию болевого восприятия тепла (heat pain-like responses), что позволило нам идентифицировать a2d3 в качестве нового болевого гена. Одним из центральных узлов в этой сети боли является передача сигналов фосфолипидов, которая участвует, прежде всего, в процессинге боли. Чтобы далее исследовать роль передачи сигналов фосфолипидов в восприятии тепловой боли у млекопитающих, мы анализировали фенотипы PIP5Ka и PI3Kγ мутантных мышей. Интересно, что обе эти линии мышей обладают выраженной гиперчувствительностью к болевым тепловым воздействиям и к capsaicin-вызываемой боли, это было непосредственно картировано посредством PI3Kγ kinase-dead knock-in у мышей активности PI3Kγ липид киназы. Используя записи с одиночных сенсорных нейронов, PI3Kγ функция была механистически связана с негативной регуляцией трансдукции посредством TRPV1 канала.

Итак, мы идентифицировали критическую липидную киназу (PI3Kγ ) в качестве негативного регулятора передачи сигналов TRPV1 (рецептора болевого восприятия тепла и capsaicin, активного компонента перца чили (chili)). Это показывает, что наша, базирующаяся на мухах, генетическая карта болевой сети, является ценным инструментом для открытия новых "nociception genes" у млекопитающих.