Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ДВУМЕРНОГО ПАТТЕРНА

Реакционно-диффузионная система

Two-dimensional spatial patterning in developmental systems
Keiko U. Torii
Trends in Cell. Biol. Volume 22, Issue 8, August 2012, Pages 438–446

Multicellular organisms produce complex tissues with specialized cell types. During animal development, numerous cell–cell interactions shape tissue patterning through mechanisms involving contact-dependent cell migration and ligand–receptor-mediated lateral inhibition. Owing to the presence of cell walls, plant cells neither migrate nor undergo apoptosis as a means to correct for mis-specified cells. How can plants generate functional tissue patterns? This review aims to deduce fundamental principles of pattern formation through examining two-dimensional (2-D) spatial tissue patterning in plants and animals. Turing's mathematical framework will be introduced and applied to classic examples of de novo 2-D patterning in both animal and plant systems. By comparing their regulatory circuits, new insights into the similarities and differences of the basic principles governing tissue patterning will be discussed.



Principles of patterning


Многоклеточность делает возможной разделение труда между клетками, при этом индивидуальные клетки приспосабливаются к специфическим целям скорее, чем к исполнению всех процессов, необходимых для независимой жизни. Чтобы осуществлять разные функции многоклеточные организмы продуцируют сложные ткани, каждая из которых представлена специализированными типами клеток в соотв. пространственной конфигурации. Возникновение прекрасного тканевого паттерна из, судя по виду, униформных, недифференцированных клеток во время развития завораживает не только биологов, но и также математиков и др. Как растительные, так и животные клетки координируют пролиферацию и дифференцировку, чтобы сгенерировать функциональные ткани. Однако существуют фундаментальные различия между ними. Благодаря присутствию клеточных стенок, которые 'склеивают' соседние клетки на месте, развитие растений происходит в отсутствие клеточной миграции. Кроме того, растительные клетки не используют апоптоз в качестве средства для коррекции неправильно специфицированных клеток во время формирования паттерна тканей. Такие фундаментальные различия между растительными и животными клетками ставят вопрос, сравнимы ли базовая логика и молекулярные механизмы формирования тканевого паттерна в этих двух царствах.

Activator-inhibitor systems of reaction-diffusion equations: Turing pattern formation


Более 50 лет тому назад, Alan Turing предложил теоретические механизмы для формирования биологического паттерна [1]. Модель, известная как reaction-diffusion (RD) модель, может генерировать превосходные, динамические и само-организующиеся паттерны просто благодаря нестабильности гомогенного устойчивого состояния двух субстанций. В 1970s, Alfred Gierer и Hans Menhard описали специфический случай RD системы как модель активатор-ингибитор, определив две биоактивные субстанции как активатор (A) и ингибитор (I) (Figure 1) [2]. A и I оба диффундируют и взаимодействуют. Здесь, A умножает свой собственный синтез, а также индуцирует I, а I ингибирует A, и I диффундирует быстрее, чем A (Figure 1c; см. уравнения [i] и [ii]), вызывая латеральное ингибирование локально активированного домена (Figure 1). Этот механизм умножает инициальные крошечные флюктуации (шумы) в пространственные паттерны равновесных крупных амплитуд (large-amplitude equilibrium spatial patterns). Стохастический подъём A в некоторых регионах ведет к очень высоким уровням A благодаря его аутокаталитической само-активации. Любой участок высокого A, возникший таким образом является также местом с высокой скоростью синтеза I. I диффундирует значительно быстрее, чем A. Большая часть I, которая синтезируется в этом месте, утекает латерально в регионы, окружающие участок высокого уровня A и ингибирует синтез A. С помощью модифицирования констант диффузии и кинетики взаимодействий A-I, этот простой circuit генерирует стационарные волны и как результат формирование паттерна динамических равновесий de novo, проявляющийся в калейдоскопе ослепительных пространственных паттернов (Figure 1) [3].

Figure 1. The reaction-diffusion (RD) model and Turing patterns. (a) Turing's RD model possesses a minimum of two components, an activator (A) and an inhibitor (I). A autoactivates itself and induces expression of I, which in turn inhibits A. I diffuses at a faster rate than A. (b) Changing various parameters in Turing's model can produce dazzling arrays of two-dimensional spatial patterns, many of which resemble the spots and stripes found in nature, such as fish stripes and giraffe reticulation. Simulation images adapted with permission from [3] (© AAAS). (c) Turing's equations. Change of [A] and [I] per unit time is determined by the reaction (the relation between A and I) and the diffusion of A and I over unit space. For a Turing wave pattern to emerge, the function F is defined such that [I] is inversely proportional to [A] and the function G is defined such that [I] depends positively on [A]. Mathematical modeling often includes additional parameters, such as protein decay rates, in these functions.

RD модель не представляет клетку достаточно ясно; RD представляется моделью непрерывного поля, это предполагает, что химическое взаимодействие между A и I рассредотачивается по всему конинууму и не разбивается на участки клеточными мембранами или клеточными стенками. Turing также предложил модели, характеризующие дискретные клетки, расположенные в виде кольца (так, что каждая клетка имеет двух соседей) и показал, что два типа моделей продуцируют паттерны одного и того же типа. Молекулярные механизмы формирования тканевого паттерна, как было установлено, по-видимому, стремятся соперничать с моделью Turing's, поскольку включены в системы более сложные, чем он когда-либо рассматривал.

2-D spatial patterning in animals: stripe patterning in fish skin


RD модель, комбинирующая локальное само-усиление и латеральное ингибирование приложима к многочисленным биологическим системам [4]. Одним из примеров 2-D формирования пространственного паттерна, объясняемого с помощью механизма Turing это формирование паттерна кожи рыб. Напр., удивительный паттерн полос у аквариумной рыбки морского ангела, само-перестраивается по мере роста рыбки и эта динамика может быть смоделирована в точности с помощью RD модели [5]. Сходным образом, сложные точки и лабиринт полос у лососевых видов и их гибридов может быть воспроизведен путем изменения RD параметров [6].
Используя рыбок данио в качестве модели, оказалось возможным исследование динамики и автономности формирования паттерна полос7-9. Характерные светлые и темные полосы у взрослых рыбок данио формируются за счет упорядоченного расположения двух типов пигментных клеток: темных клеток (меланофоров) и желтых клеток (ксантофоров) (Figure 2) [7]. Серии экспериментов по лазерному устранению выявили не только мощное восстановление паттерна полос, но и уникальные свойства взаимодействия двух типов клеток (Figure 2) [10]. Когда черные и желтые клетки оказываются в тесной близи, они действуют взаимоисключающим способом. Однако черные клетки нуждаются в присутствии желтых клеток на удаленном расстоянии для выживания [10]. Эти находки можно суммировать в виде простого circuit, представляющего латеральное ингибирование, причем взаимное ингибирование черных и желтых клеток ведет к само-активации желтых клеток (A), которые активируют черные клетки (I) на расстоянии. И наоборот, черные клетки (I) ингибируют желтые клетки (A) (Figure 2) [10].

Figure 2. Skin stripe patterning in zebrafish. (a) Zebrafish stripes are formed by the interaction of black cells (melanophores) and yellow cells (xanthophores). (b) Interactions leading to stripe formation can be explained by the reaction-diffusion (RD) model. Mutual inhibition of black and yellow leads to autoactivation for yellow cells. Mutual exclusion of the two cell types is achieved by contact-dependent depolarization of black cells when touched by a yellow cell. The molecular nature of the long-range activation signal from the yellow cells is unknown. Zebrafish cartoon courtesy of David Parichy (University of Washington).

Что лежит в молекулярной основе такого circuit? Исследования паттерна полос у мутантных рыбок данио подтвердили роль передачи сигналов рецепторной киназы и ионных каналов собственно в формировании пигментного паттерна11-13. Исследования культур клеток in vitro продемонстрировали, что черные клетки подвергаются быстрой контакт-зависимой деполяризации, когда к ним 'прикасаются' желтые клетки, это, скорее всего, является механизмом отталкивания и, следовательно, взаимного исключения клеток двух типов [14]. Молекулярная идентификация дальнодействующего сигнала, необходимого для жизнеспособности melanophore, пока не осуществлена.

2-D spatial patterning in animals: contact-dependent lateral inhibition during neuroectoderm patterning


Сигнальный путь Notch-Delta регулирует 2-D формирование пространственного паттерна, обеспечиваемое с помощью межклеточных взаимодействий в сложном онтогенетическом контексте у животных15-17. Напр., во время эмбриогенеза Drosophila нейральные клетки специфицируются среди группы эквипотентных клеток в нейроэктодерме благодаря межклеточной системе активатор-ингибитор. Delta является связанным с мембраной лигандом для Notch. Клетка, воспринимающая Delta от своего соседа, репрессирует экспрессию своего собственного Delta (Figure 3a). В конечном счете, клетки с высокой активностью Delta воспринимают судьбу нейронов, тогда как клетки с низкой активностью Delta адоптируют эпидермальную судьбу15-17. Отсюда предположение, что Delta первоначально экспрессируется униформно (Figure 3b; ti), но стохастические различия в уровнях экспрессии Delta ведут к паттерну шашечной доски из двух типов клеток (Figure 3b). Математическая модель с простым допущением направленного взаимодействия Notch-Delta между контактирующими клетками может быть достаточной для воспроизведения пространственного распределения нейробластов, а изменение модельных параметров дает разные исходы распределения динамичного равновесия нейробластов (Figure 3b; tS1 and tS2) [18].



Figure 3. Neuroectoderm patterning by Notch-Delta mediated lateral inhibition. (a) Simplified lateral inhibition model that is capable of producing the spatial patterning of specialized cells entering neural differentiation. Two ordinary differential equations here describe: (upper) the change of activated Notch (Np) over unit time depending on the production of activated Delta (Dp) minus decay of activated Notch; and (lower) the change of activated Delta over unit time depending on Notch. Function F would be positive, but function G would be negative. These equations assume that the numbers of neighboring cells in direct contact determine the signal input strengths; therefore, no diffusion component is included in the equation. (b) Schematic diagram of modeling. The initial condition (ti) assumes that the concentrations of Notch and Delta are uniform; depending on the parameters, the model can create different stationary neural-epidermal patterns (e.g., tS1 and tS2). (c) Regulatory circuit of Notch-Delta pathway. Here, transcripts are italicized in ovals, proteins are in roman and in rectangles, and basic helix-loop-helix (bHLH) protein complex is in hexagons. Protein decay is indicated by the ground symbol; arrow, activation; T-bar, inhibition. In contrast to trans-Delta-Notch interaction, which leads to a signaling cascade to suppress Acs and hence Delta, cis-Delta-Notch interaction leads to suppression of Notch. Enhancer of Split (E(spl)) is promoted by other signaling pathways (+) and then self-regulates its expression via a negative feedback loop. (d) Dynamic view of lateral inhibition. Oscillation of Hes1/E(spl) causes oscillatory expression of proneural genes and Delta (green) in transient states (tUC1 and tUC2). Eventually the cell will commit to a stationary neural cell fate (tS, red).

Передача сигналов Notch запускает последовательную активацию и ингибирование basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов. Короче, Notch-инициированная сигнальная трансдукция активирует Enhancer of Split [E(spl)] bHLH белки, которые репрессируют Achaete-Scute complex (AS-C) нейрогенных bHLHs, тем самым принуждая выбирать эпидермальную (non-neural) клеточную судьбу (Figure 3c). Модель стержневой нейрогенной сети, вносящая строгую само-амплификацию с помощью Achaete and Scute, демонстрирует устойчивость к шумам (таким как изменения в параметрах препаттерна), при этом E(spl) действует как гомеостат [19].
Недавние исследования на живых клетках выявили сложное и динамическое поведение передачи сигналов Notch-Delta и пересмотрели классическую модель латерального ингибирования20,21. Наблюдалось, что хотя нормальная концентрация Delta активирует Notch, высокая концентрация Delta действует доминантно-негативным способом22,23. Эти противоречивые роли Delta обусловлены цис-ингибированием, причем Delta, соединяясь с Notch в той же самой клетке, ослабляет сигнальную трансдукцию и отклоняет исход латерального ингибирования (Figure 3c) 24,25. Анализ изображений вживую активации Notch посредством контролируемых уровней trans- в противоположность cis-Delta и последующее математическое моделирование показали, что cis-Delta-Notch взаимодействие образует сверхчувствительное переключение между двумя взаимоисключающими сигнальными состояниями [21].
Во время развития головного мозга млекопитающих ортолог E(spl) bHLH млекопитающих Hes1 обнаруживает осциллирующую экспрессию среди популяции нейральных предшественников. Поэтому экспрессия Delta осциллирует динамически (Figure 3d; tUC1, tUC2) перед детерминацией нейрональной дифференцировки (Figure 3d; tS) 20,26. Это наблюдение не может быть объяснено традиционной моделью латерального ингибирования (Figure 3a,b; ti). Хотя биологическое значение осцилляций Hes1-Delta остается неясным, предполагается, что осцилляции Hes могут предопределять временное состояние амплификации нейрального клона во время сложного развития головного мозга млекопитающих [26].

2-D spatial patterning in plants: leaf epidermis as a model


Два примера формирования 2-D пространственного паттерна во время развития животных подчеркивают критическую роль миграции и латерального ингибирования клеток при непосредственном контакте. Однако такие специфические клеточные механизмы вряд ли действуют во время формирования тканевого паттерна растений. Благодаря присутствию клеточных стенок, механизмы, специфицирующие паттерн полос в коже рыб (деполяризацией вызываемое отталкивание клеток и миграция), не встречаются у растений. Толстый матрикс клеточной стенки не позволяет клеткам растений использовать с мембраной связанные лиганды, такие как Delta; , следовательно, передача сигналов базируется на непосредственных межклеточных контактах, как в сигнальной сети Delta-Notch, и не оперирует у растений. Как же растения осуществляют формирование тканевого паттерна?
Тонкое, плоское полотнище листа является подходящей моделью для понимания формирования 2-D пространственного паттерна у растений. Листья формируются по флангу shoot apical meristem (SAM) посредством вегетативного развития. Наиболее наружный слой из недифференцированных клеток зачатка листка, известный как protoderm или L1, активно подвергается клеточной пролиферации и дифференцировке, давая три самостоятельных типа клеток: эпидермальные pavement клетки, устьица (парные замыкающие клетки) и trichomes (Figure 4a). Пазл-подобные и покрытые кутикулой pavement клетки защищают внутреннюю фотосинтезирующую ткань от высушивания повреждений УФЛ и проникновения патогенов. Устьица являются микроскопическими клапанами, которые эффективно обеспечивают газообмен для внутренней фотосинтезирующей ткани, минимизируют потерю воды27,28. Трихомы являются придатками, которые осуществляют защиту против травоядных животных и у некоторых растений специализированы накапливать и секретировать защитные химикалии (напр., эфирные масла, такие как ментолы) 29,30. У модельного растения Arabidopsis thaliana, как устьицы, так и трихомы равномерно распределены на плоскости листа для оптимального функционирования и их пространственное распределение находится под генетическим контролем (Figures 4a and 5a), подразумевая присутствие механизмов латерального ингибирования.


Figure 4. Stomatal pattering inArabidopsisleaf. (a) Cartoon of Arabidopsis leaf. Trichomes, stomata, and pavement cells are three differentiated cell types that comprise leaf epidermis. Stomata are evenly distributed in wild type (left). Loss of function of activators or constitutive activation of inhibitors results in an epidermis devoid of stomata (middle); conversely, loss of function of inhibitors or constitutive activation of activators results in a stomata-only epidermis. False-colored confocal images of cotyledon epidermis are shown. (b) Simplified lateral inhibition model. Initially, positive regulator EPIDERMAL PATTERNING FACTOR-LIKE (EPFL)9/Stomagen from the lower L2 layer (red) acts non-cell-autonomously to induce the expression of activators of stomatal lineage initiation - SPEECHLESS (SPCH) and SCREAM (SCRM) - in the protoderm (light green). Cells that highly accumulate activators (green) become signal-sending cells and inhibit neighboring cells from adopting a stomatal cell fate. Above an activation threshold, the signal-sending cell becomes a meristemoid mother cell (MMC) and initiates asymmetric entry division. Stomatal differentiation then follows a series of cell-state transitions through the transient amplifying meristemoid, the guard mother cell (GMC), and terminal differentiation of guard cells. (c) Hypothetical model of the regulatory circuit for MMC specification. Here, transcripts are italicized in ovals, proteins are in roman and in rectangles, and protein complexes (basic helix-loop-helix [bHLH] heterodimer, receptor complex, and MAPK cascade) are in hexagons. Protein decay is indicated by the ground symbol; arrow, activation; T-bar, inhibition. The molecular mechanism of SPCH and SCRM induction is unknown. Likewise, it is not known how SPCH-SCRM heterodimers are downregulated, aside from the observation that SPCH can be phosphorylated by MAPKs [69].


Figure 5. Trichome patterning inArabidopsisleaf. (a) Scanning electron micrographs of Arabidopsis primary leaves. Trichomes are evenly distributed in wild type (left). Loss of function of activators or constitutive activation of inhibitors results in an epidermis devoid of trichomes (middle); conversely, loss of function of inhibitors or constitutive activation of activators results in excessive trichomes in clusters. Adapted, with permission, from [53] (© The Company of Biologists). (b) Simplified lateral inhibition model. Initially, both activators and inhibitors are expressed uniformly throughout the protoderm. Cells with a high accumulation of activators (green) inhibit surrounding neighboring cells from adopting a trichome cell fate. Final trichome differentiation involves endoreduplication and outward cell expansion. Also, cells surrounding the trichome cells become accessory cells (not shown). (c) Regulatory circuit for trichome cell fate specification under the activator-inhibitor model. Here, transcripts are italicized in ovals and proteins are in roman: basic helix-loop-helix (bHLH) protein complex, hexagons; Myb protein, pentagons; WD40 protein, rectangles; HD protein, stars. Activation is indicated by arrows; inhibition, T-bar. The inhibitor Myb genes are induced directly by the GLABRA (GL)1-GL3/ENHANCER OF GL3 (EGL3)-WD40 transcriptional activator complex. Their gene products move into neighboring cells via plasmodesmata, where they inhibit the activator complex, thereby inhibiting the transcription of GL2, which specifies the trichome cell fate. (d) Activator depletion model. Unlike (c), here the WD40 scaffold protein TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG) is trapped in the incipient trichome cell by complex formation, resulting in depletion of free TTG pools in neighboring cells. The differential availability of TTG creates bimodal activation of GL2, thereby specifying the trichome cell fate.

Stomatal patterning


Т.к. и у многих dicot растений, развитие устьиц у Arabidopsis происходит посредством серии стереотипических асимметричных и симметричных клеточных делений и переходов в клеточных состояниях27,31. В развивающихся фотосинтезирующих органах избранная популяция протодермальных клеток приобретает качественные особенности meristemoid mother cell (MMC) и инициируют вступление в асимметричные деления. Это вступление в деления вызывает временную амплификацию клеток, наз. meristemoid, которые повторяют асимметричные умножающие деления до тех пор, пока не возобновят себя самих (Figure 4b). Эти meristemoid клетки в конечном итоге дифференцируются в guard mother cell (GMC), которая делится симметрично пока не сформирует парные замыкающие клетки (guard cells), образующие устьица (Figure 4b). Клон non-stomatal клеток предшественников может подвергаться асимметричным клеточным делениям, чтобы продуцировать вторичные meristemoids. Эти деления происходят вдали от предсуществующих устьиц, так что два устьица будут разделены минимум одной клеткой27,28.
Последовательные события дифференцировки устьиц позитивно регулируются комбинаторным и последовательным действием пяти bHLH транскрипционных факторов - SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, SCREAM (SCRM) и SCRM2 - а также Myb транскрипционными факторами (FOUR LIPS and Myb88)32-37. Активность этих транскрипционных факторов регулируется с помощью компонентов ингибирующей передачи межклеточных сигналов, обеспечиваемых с помощью EPIDERMAL PATTERNING FACTOR (EPF) секретируемых пептидов, ERECTA-семейства и TOO MANY MOUTHS (TMM) рецепторов и нижестоящего MAP киназного каскада38-44. Потеря активаторов (или избыточная активность ингибиторов) ведет к тому, что листья лишаются устьиц и, vice versa, потеря ингибиторов (или постоянная активация активаторов) дает листья с избыточными в виде кластеров устьицами (Figure 4a), указывая, что собственно пространственное распределение активаторов и ингибиторов является критическим для формирования паттерна устьиц.
Спецификация качественных особенностей MMC, полярность meristemoids, осуществляющих асимметрические умножающие деления, и ориентация асимметричных пространственных делений все вместе вносят вклад в униформное распределение устьиц в зрелом листе. Здесь мы сконцентрируемся на регуляторной петле (circuit) ведущей к событиям нарушения инициальной симметрии. Генетические исследования показали, что bHLH гетеродимеры SPCH и SCRMs активируют инициацию устьиц33-35. Первоначально SPCH промотор униформно активен по всей protoderm зачатка листа (Figure 4b) [34]. Стохастические различия в экспрессии SPCH могут вести к спецификации судьбы MMC (Figure 4b)33-34. SPCH не только необходим для экспрессии своего партнера активатора, SCRM, но и также для ингибитора EPF2, который кодирует секретируемый пептид (Figure 4c)35,40,41. Можно предсказать, что EPF2 продуцируется в клетках с высоким уровнем экспрессии SPCH и затем секретируется в соседние клетки, где он воспринимается с помощью ERECTA и TMM [45]. Путь сигнальной трансдукции в конечном итоге ингибирует активность SPCH в клетках, воспринимающих EPF2, тем самым супрессируется их клональная судьбы устьиц (Figure 4c).
Взаимоотношение SPCH-EPF2 напоминает Turing's RD модель (Figure 1a): активатор (A: SPCH) индуцирует др. активатор (A': SCRM) и ингибитор (I: EPF2). Для Turing паттерна ингибитор д. диффундировать быстрее, чем активаторы; поскольку EPF2 является секретируемым пептидом, a SPCH-SCRM являются гетеродимерами транскрипционных факторов, расположенными в ядре, то это это условие выполняется. Авто-активация SPCH, вторая потребность для RD модели, не была установлена.
Существует несколько вариантов молекулярного механизма SPCH-EPF2-обусловленного формирования 2-D пространственного паттерна. Классическая модель латерального ингибирования (Figure 3a) предполагает, что стохастические изменения в униформной экспрессии активатора усиливают клетки, испускающие сигналы. Установлено, что EPF-LIKE пептид, EPFL9/Stomagen, экспрессируется в L2 ткани, лежащей под эпидермисом и позитивно регулирует развитие устьиц46,47. Следовательно, клетки, изначально испускающие сигнал (MMC), могут быть специфицированы благодаря локально высокой концентрации пептида Stomagen, стоящего ниже (Figure 4b). Неизвестно, как передача сигналов Stomagen ведет к активации экспрессии SPCH.
Во вторых, TMM, LRR рецептор-подобный белок, обладает парадоксальной негативной или позитивной ролью в развитии устьиц в зависимости от регионального или генотип-специфического контекста42,48. Напр., в то время как tmm листья продуцируют кластеры устьиц, tmm стволы не продуцируют устьиц [48]. В отсутствие двух генов семейства ERECTA, tmm растущие на стебле листья не способны дифференцировать GMCs [42]. TMM нуждается в SPCH для экспрессии [41], предполагается, что помимо ингибитора EPF2 (I), SPCH (A) может также индуцировать TMM рецептор, которые обладает как позитивной, так и негативной активностью, Недавние генетические и биохимические исследования подтвердили, что TMM модулирует активности рецепторов семейства ERECTA посредством гетеродимеризации, усиления или смягчения EPF сигналов в зависимости от типа клеток и органов [45]. Более того, доказано, что среди 9 EPF-LIKE пептидов [41], по крайней мере, три экспрессируются в разных тканях и регулируют разные онтогенетические пути [49]. Интересно, что эти EPF-LIKE пептиды влияют на формирование паттерна устьиц только в отсутствие TMM50,51, указывая тем самым, что TMM может действовать в качестве 'буфера' наложения сигналов в пути формирования устьиц с помощью др. сигналов. Эти наблюдения указывают на сложные молекулярные взаимодействия вне 2-D пространства эпидермиса. Дальнейшие эксперименты с использованием высоко-разрешающих изображений для отслеживания динамики каждого EPF пептидного сигнала в реальном времени и пространстве, вместе с моделированием, позволит завершить картину регуляторных схем (circuitry) спецификации паттерна устьиц.

Trichome patterning


Трихомы у Arabidopsis однокле6точные и обладают тремя острыми веточками [29]. Выбор судьбы трихомной клетки специфицируется рано в развитии эпидермиса благодаря скоординированной активности позитивных и негативных регуляторов29,30,52. В листьях дикого типа трихомы распределены униформно. Потеря активаторов (или избыточная активность ингибитора) дают листья, лишенные трихом и vice versa, потеря ингибиторов (или постоянно активные активаторы) дают листья с избыточными, собранными в кластеры трихомами, указывая, что собственно пространственное распределение активаторов и ингибиторов необходимо также для формирования паттерна трихом (Figure 5a,b) [53]. Как только клетка детерминируется на судьбу трихомы, она осуществляет раунды эндоредупликаций, увеличение клетки и поляризация формируют характерные острые, разветвленные образования, выступающие с поверхности листа (Figure 4a) [29].
Позитивные регуляторы R2R3-Myb транскрипционный фактор GLABRA1 (GL1) и WD-40 каркасный белок TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1) формируют транскрипционный комплекс с bHLH белками GL3 и ENHANCER OF GL3 (EGL3) (Figure 5c) 53-56. Комплекс активирует экспрессию гомеодоменового транскрипционного фактора, GL2, который специфицирует клеточную судьбу трихом (Figure 5) [57]. Негативные регуляторы это 6 перекрывающихся с одиночным повтором Myb белки (CPC [CAPRICE], TRY [TRIPTYCHON], ETC1 [ENHANCER OF TRY], ETC2, ETC3 и TCL1 [TRICHOMELESS1]) [58]. Эти ингибирующие Mybs противодействуют активатору Myb GL1 путем образования непосредственного белкового комплекса и, следовательно, вмешиваются в транскрипцию GL2 (Figure 5c) [59].
Первоначально и позитивные и негативные регуляторы экспрессируются случайно по всей protoderm в раннем зачатке листка52,58,59. Во время развития их экспрессия становится ограниченной формирующейся трихомной клеткой [59], давая паттерн в виде шахматной доски, сходный с таковым экспрессии Delta во время спецификации нейроэктодермы Drosophila (Figure 5b).
Как взаимодействуют активаторы и ингибиторы, чтобы специфицировать судьбу клеток трихом? Основной транскрипционный circuit напоминает таковой спецификации клеточной судьбы устьиц (Figure 4). Однако, вместе секретируемого пептида, такого как EPF2, circuit спецификации трихом позволяет использовать непосредственные межклеточные перемещения транскрипционных факторов посредством plasmodesmata - цитоплазматических соединений между растительными клетками [60]. Во-первых, активаторы (GL1-GL3/EGL3-TTG1 комплекс) непосредственно индуцируют транскрипцию ингибиторов (CPC/TRY-семейство) путем соединения с их промоторны регионом. После транскрипции и трансляции эти ингибиторные белки перемещаются в соседние клетки через plasmodesmata59,61. В отличие от ингибиторов, активаторы GL1 и GL3 не перемещаются от клетки к клетке [62]. Комбинация этих регуляторных взаимоотношений, по-видимому, удовлетворяет основным circuitry системы Turing A-I ; A индуцирует I, который 'диффундирует' более быстро в соседние клетки(Figure 1). Эмпирические исследования и математическое моделирование указывают, что сила ингибиторов управляет связыванием с активаторами , скорее всего, влияя на финальный результат формирования паттерна трихом61,62.
В действительности история не столь проста. Во-первых позитивная обратная связь, или в качестве само-активации активатора, или как взаимное ингибирование двух факторов, является важной частью системы Turing (Figure 1). До сих пор исследования экспрессии и геномный ChIP анализ GL1 и GL3 непосредственных сайтов связывания окзался неспособным продемонстрировать авто-активацию GL1 и GL363,64. Во-вторых, мутантные аллели активатора, TTG1, обнаруживают противоположные эффекты, как позитивные или негативные регуляторы формирования паттерна трихом; тогда как ttg1 нулевой аллель не продуцирует трихом, его слабый аллель дает кластеры трихом [65]. Ситуация в чем-то аналогичная Delta в формировании паттерна у животных или TMM при формировании паттерна устьиц, подтверждающая существование дополнительного механизма.
Тщательные наблюдения динамики TTG1-YFP показали, что тогда как TTG1 транскрипты экспрессируются униформно в развивающемся эпидермисе листа, TTG1 белок уменьшается в клетках, окруженных трихомами изначально [66]. Такое истощение нуждается в активаторе - GL3. Базируясь на этих находках, предложена модель истощения активатора (Figure 5d) [66]. Здесь, TTG1 белок способен свободно перемещаться между клетками посредством plasmodesmata, но как только он сталкивается с GL3, то он инкорпорируется в неподвижный комплекс и тем самым обездвиживается. Клетки, становящиеся трихомными, экспрессируют дополнительные активаторы (GL1 и GL3), которые действуют, гася TTG1 усиливая их трихомную судьбу (Figure 5d). Хотя эта модель не объясняет механизма усиления активности активатора, математическая модель, базирующаяся на этом сценарии способна объяснить демонстрируемую двойную роль TTG1 как позитивного и негативного регулятора формирования паттерна трихом; путем изменения параметров, таких как скорость транспорта TTG1 между соседними клетками, модель способна предсказать образование кластеров трихом [66]. Модель истощения активатора учитывает хорошо известные межклеточные перемещения ингибиторов (CPC/TRY-family). Вообще-то, в настоящих растительных клетках, оба механизма вносят вклад в события формирования паттерна.

Future perspectives: basic circuitry and signal integration in plants


In this review, four specific examples of 2-D spatial patterning, two in animals and two in plants, were described and compared. These four disparate biological tissue patterning systems revealed a surprising conservation of molecular logic: use of regulatory circuits comprising activators and inhibitors. In these examples, activators are transcription factor complexes including bHLH proteins. These activators induce transcription of inhibitors that suppress the activators in neighboring cells. Therefore, the core circuitry of self-organizing tissue patterning resembles the RD system proposed by Turing, with additional regulation operating in each system. The molecular nature of inhibitors in plants reflects their unique cellular properties; instead of using contact-dependent mechanisms to generate specific patterns, plant cells use both extracellular ligands for cell-surface receptors and direct cell-to-cell macromolecular movement via plasmodesmata.
It becomes clear that the actual molecular mechanism of 2-D spatial patterning in the plant leaf epidermis is more complex than the RD model suggests and, in the case of stomatal patterning, involves three-dimensional signal perception and selective buffering of signal interference. It is worth mentioning that trichome patterning in the leaf epidermis and root hair patterning in root epidermis share both the Myb–bHLH–WD40 transcription activator complex and the inhibitor Mybs [67]. Although the effects of internal tissues on trichome patterning remain unknown, root hair patterning involves signals from internal cortex tissues perceived by receptor kinases [68], somewhat analogous to stomatal patterning. Exploration of 3-D spatial patterning may highlight a unique feature of plant development in which a 3-D body plan is generated without dynamic collective cell movement (such as gastrulation in animals) during embryogenesis.
In the protoderm of vegetative leaves, both stomatal and trichome differentiation genes are initially expressed uniformly. It is unknown whether these two regulatory programs influence each other. The constitutive activation of stomatal differentiation by the scrm-D mutation leads to a ‘stomata-only’ epidermis at the expense of normal trichome differentiation [35]. Further studies may reveal the intersection of the two regulatory circuits specifying two key cell types in the developing leaves.
Finally, as autotrophs capturing solar energy and subject to local stresses, plants display highly plastic development. Understanding how environmental signals influence the regulatory circuits specifying stomata and trichomes will provide a broader insight into signal integration during developmental patterning.