Хотя Srrm4 широко экспрессируется в нервных тканях, мы не выявили дефектов сплайсинга в мозжечке и неокортексе P15 bv/bv мышей. Более того, если нейрогенез и был нарушен у эмбрионов bv/bv мышей, то следствия этого дефекта, не выявляются с помощью Nissl окрашивания на ст. P15. Тем не менее, нельзя исключить возможность, что сплайсинг пре-мРНК затрагивается в др. временные точки или в др. регионах головного мозга этих животных. Отметим, что недавнее исследование показало. что нейрогенез нарушается у E13/14 дикого типа мышей после того как нейральным предшественникам в вентрикулярной зоне были электропортированы вектора, кодирующие нацеленные на Srrm4 shRNA [37]. Также исследования головного мозга bv мышей, Matsuda and colleagues показали, что базирующаяся на иммунофлюоресценции визуализация parvalbumin-экспрессирующих GABAergic промежуточных нейронов [46] выявляет аномалии немногих parvalbumin-экспрессирующих клеток в слуховом кортексе, соматосенсорном кортексе и переднем поясе (cingulate), тогда как зрительный кортекс и комплекс amygdala оставались незатронутыми. Возможно, дефект Srrm4 у bv/bv мышей непосредственно нарушает дифференцировку промежуточных нейронов определенных областей головного мозга. Или напротив наблюдаемые изменения в ряде parvalbumin-экспрессирующих клеток могут быть вторичными по отношению к дефектам слуха и баланса у bv/bv мышей. Эта возможность согласуется с тем фактом, что врожденная глухота, как было установлено, предупреждает созревание GABAergic трансмиссии слухового кортекса [47], [48], а сенсорная потеря слуха ассоциирует со снижением числа parvalbumin-позитивных клеток в superior olivary complex [49]. Кроме того, отсутствие вестибулярных сигналов, как полагают, вызывает снижение экспрессии различных белков, связывающих кальций, включая parvalbumin, в медиальном вестибулярном ядре [50].

У рыбок данио, MO-обусловленный нокдаун Srrm4 оказывает очевидное влияние как нейральную дифференцировку [28] , так и развитие волосковых клеток (Figure 5). Почему дефицит Srrm4 оказывает более значительное воздействие на нейральную дифференцировку у рыбок данипо, чем у мышей? Одним из возможных объяснений является то, что сплайсинг белков иных, чем Srrm4, обнаруживает Srrm4-подобные функции в головном мозге мышей, но не у рыбок данио. Однако, более сложное объяснение предполагается двумя находками. Во-первых, в то время как приблизительно 70% IHCs погибает между E18 и P5 у bv мышей, эта тенденция не продолжается после P5 [27]. Во-вторых, выжившие IHCs скорее всего сохраняют функцию поскольку bv/bv мыши не полностью глухи. Итак, эти данные подтверждают, что Srrm4 не нужен во внутреннем ухе после критической фазы развития. Эта гипотеза "critical phase" подтверждается профилем экспрессии гена супрессора сплайсинга polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1), который, как было установлено, ингибирует постоянное включение , по крайней мере, некоторых Srrm4-регулируемых экзонов в клетках Neuro2A [28]. PTBP1 экспрессируется в нервных клетках только во время ранних фаз дифференцировки [51]. Т.о., Srrm4 может быть не нужен во время поздних фаз развития, когда нервные клетки не содержат больше PTBP1. Мы полагаем, что хотя дефицит Srrm4 возможно может приводить к дефектам сплайсинга в нейронах мышей и рыбок данио в раннем развитии, Srrm4-независимые регуляторные механизмы достаточны для поддержания дифференцировки нейронов вплоть до конца критической фазы у мышей, но не рыбок данио.

Наша находка, что Srrm4-зависимое исключение экзона нуждается в присутствии GC мотива вблизи 3' конца полипиримидиновых треков подтверждает, что этот мотив служит цис-регуляторным элементом для Srrm4-зависимого сплайсинга. Цис-регуляторные элементы это мотивы из коротких последовательностей, которые рекрутируют РНК-связывающие белки [52]; они могут или усиливать или супрессировать включение экзона в зависимости от того какие сплайсинг факторы рекрутируются и - в некоторых случаях - от позиции цис-регуляторного элемента относительно экзона [53], [54]. Пре-мРНК регулируются совместно с помощью одного и того же РНК-связывающего белка, обычно при этом они содержат тот же самый цис-регуляторный элемент. Т.о., присутствие того же самого мотива рядом почти с каждым затрагиваемым экзоном у Srrm4 мутантных мышей подтверждает, что включение этих экзонов в мРНК регулируется с помощью того же самого Srrm4-зависимого механизма.

Наши эксперименты с РНК подтвердили, что GC мотив необходим для взаимодействия между Srrm4 и РНК. Осуществляется ли это взаимодействие непосредственно или посредством др. белков предстоит определить. Важно, что мотив GC является не только последовательностью в пре-мРНК, который важен для регуляции Srrm4-зависимых событий сплайсинга. Предыдущие исследования показали, что pyrimidine-rich мотивы часто присутствуют в интронах, которые фланкируют регулируемые Srrm4 экзоны [28] и что эти pyrimidine-rich мотивы являются сайтами для PTBP1 [28]. Поскольку GC мотивы расположены вблизи 3' конца полипиримидиновых последовательностей, то можно предположить, что рекрутирование или Srrm4 или Srrm4-связывающих белков на пре-мРНК может сталкиваться со связыванием PTBP1.

Тот факт, что Srrm4-регулируемые экзоны обнаруживаются чаще всего в транскриптах белков, которые обозначаются GO термином 'transmission of nerve impulse' и 'secretion by cell', чем в транскриптах случайного набора белков указывает на то, что белковые продукты с Srrm4-регулируемых пре-мРНК функционально связаны. Мы исследовали эту возможность путем сбора данных PubMed по субклеточной локализации и взаимодействиям среди затрагиваемых белков; принимая во внимание, что мы желали максимизировать количество доступной информации, мы не ограничились этими поисками в PubMed публикаций, связанных с волосковыми клетками. Базируясь на собранной информации, мы предпочли скорее субклеточную локализацию затрагиваемых белков на схематической модели базолатеральной порции волосковых клеток (Figure 6). Эта модель иллюстрирует, что большинство белков, кодируемых с помощью Srrm4-регулируемых транскриптов, может быть ассоциировано с синаптическими пузырьками и пресинаптической клеточной оболочкой. Отметим, что 42% белков в этой модели, кодируются с помощью Srrm4-регулируемых пре-мРНК и имеют известных белок-белок связывающих партнеров в базе данных PubMed, взаимодействующих др. с др. (see reference list in Table S3). Т.о., как анализ GO аннотаций, так и паттернов межбелковых взаимодействий подтверждают, что Srrm4-зависимые модификации кластера преимущественно в одиночном функциональном модуле протеома и что этот модуль ответственен за секрецию и нейротрансмиссию на пресинаптической стороне синапсов. Этот анализ также подтвердил, что Srrm4-регулируемые белки с неохарактеризованными молекулярными функциями (напр. Plekha6, 6330403A02Rik, и C230096C10Rik) скорее всего вовлечены в секрецию или нейротрасмиссию, чем др. биологические процессы.

Figure 6. Diagram illustrating the known and predicted subcellular localizations of proteins encoded by validated Srrm4-regulated mRNAs. The proteins encoded by the validated mRNA targets of Srrm4-dependent splicing are shown in blue. The references for the protein localization and interaction data are listed in Table S3. For 8 of the proteins encoded by Srrm4-regulated mRNAs, the subcellular localization either falls outside of the depicted area or is unknown. Proteins that are not known to be regulated by Srrm4 but link Srrm4-regulated proteins to each other or a membrane are shown in green. Arrows indicate the direction of each transport event.

Устойчиво высокие скорости нейротрансмиссии от IHCs и VHCs к их соотв. афферентным нервам нуждаются в специализированных пресинаптических структурах, наз. синаптическими ribbons. Большинство OHCs содержат синаптические ribbons лишь временно во время дифференцировки; только OHCs, в которых синаптические ribbons сохраняются, расположены наиболее апикально [55]. Интересно, что у bv/bv мышей OHCs являются единственными волосковыми клетками, которые остаются интактными и многие из белков с дефектами сплайсинга располагаются на синаптических ribbons (напр., Cacna1d, Cask, Erc2, Rims2, Snap91, и Synj1 [56]). Т.о., вполне правдоподобно, что для типов клеток специфичность дефектов синаптогенеза обусловлена отсутствием белковых изоформ, которые специфически необходимы для формирования синаптических ribbons. Альтернативно, возможно, что механизм, который поддерживает включение Srrm4-регулируемых экзонов в мозжечок и неокортекс bv/bv мышей, также защищает OHCs от дегенерации. Эту гипотезу необходимо проверить путем анализа сплайсинга пре-мРНК в эмбриональных OHCs у bv/bv и контрольных мышей. Однако сбор РНК избирательно из эмбриональных OHCs технически затруднен из-за физической близости OHCs и IHCs в развивающемся внутреннем ухе. Следовательно, анализ сплайсинга пре-мРНК в OHCs у bv/bv дело будущего.

Хотя мы установили, что большинство дефектов сплайсинга у bvмышей ассоциирует с секреторным и синаптическим аппаратом, альтернативный сплайсинг, по крайней мере, двух белок-кодирующих мРНК ресничек (т.e. Bbs9 и Wdr35) такж был изменен. Кроме того, Srrm4 мутация ведет к снижению экспрессии рецептор-подобной inositol phosphatase Ptprq, которая необходима для развития пучков стереоцилий в улитке [57]. Srrm4-зависимый сплайсинг также затрагивает, по крайней мере, 3 мРНК, которые кодируют ядерные белки (т.e. Rest, Bhc80 и Mef2d). Две из них (т.e. Rest и Bhc80), как было установлено, оказывают противоположные эффекты на экспрессию генов и, как было установлено, контролируют процессинг и экзоцитоз пузырьков посредством регуляции трансляции [41], [58], [59]. Мы нашли, что гены, регулируемые с помощью Rest- и Bhc80 - но не те, что регулируются с помощью Mef2d - были избыточно представлены среди 44, чья экспрессия была в большинстве своем редуцирована в вестибулярных macula у bv/bv мышей. Т.о., Srrm4-зависимый сплайсинг Rest и Bhc80 пре-мРНК подкрепляет нашу гипотезу, что Srrm4 играет роль в созревании регулируемого секреторного аппарата в волосковых клетках. Изменение сплайсинга Rest мРНК и снижение экспрессии Rest генов мишеней в контексте снижения функции Srrm4 был описан ранее для Neuro2A клеток, подвергнутых RNA interference [37]. Т.о., in vivo и in vitro данные подтверждают, что потеря функции Srrm4 ведет к каскаду альтераций транскриптома, которые влияют как на сплайсинг пре-мРНК, так и экспрессию генов. Дальнейшие исследования определят важность индивидуальных Srrm4-регулируемых экзонов в развитии волосковых клеток и позволят нам вычленить детально патогенез дегенерации волосковых клеток у bv/bv мышей.

In summary, in analyzing the bv mouse line we have identified Srrm4 as a regulator of alternative splicing that is required for the differentiation of hair cells in the hearing and balance organs. We propose that a Srrm4-regulated cascade of transcriptome modifying events adjusts the proteome of differentiating hair cells such that they take on neuron-like functions. Our study adds alternative splicing to the list of mechanisms that are critical for hair-cell differentiation. Given that some deafness-causing mutations are known to be localized to alternative exons (i.e. R643X in PCDH15 [60] and R500X in TRIC [61]), understanding the regulation of alternative exon choice in the inner ear is expected to create therapeutic opportunities for the prevention of deafness.