Большая часть нашего понимания поддержания, регенерации и репарации эпителиальных клеток легких у взрослых дедуцированы из систематического анализа нормального легочного развития и исследований гистоморфометрии отслеживания клонов эпителиальных клеток в норме и при патологии при избыточности и потере функции модельных животных. Однако, совокупный эффект разных факторов микросреды ограничивает нашу способность определять свойства стволовых клеток эпителия легких на уровне целого органа.

UNMASKING ADULT LUNG EPITHELIAL STEM/PROGENITOR CELLS IN THE MOUSE LUNG

Эпителий легких у взрослых представлен разными клеточными клонами с региональным распределением вдоль проксимо-дистальной оси респираторного древа (Fig. 1). Тархеобронхиальные воздушные пути легких взрослых мышей выстланы псевдостратифицированным эпителием, содержащим базальные, реснитчатые, нейроэндокринные, goblet и Clara клетки, с вкраплениями реснитчатых клеток и клеток собирающих протоков, которые вытягиваются в подслизистые железы (submucosal glands (SMGs)), выстланные серозными и мукоидными клетками.

Бронхиальные воздушные пути в дистальных частях легких выстланы цилиндрическим эпителием, содержащим преимущественно Clara и реснитчатые клетки с отдельными фокусами нейроэндокринных клеток (нейроэпителиальные тельца) и небольшим количеством бокаловидных (goblet) клеток, а альвеолы содержат Type I (сквамозные) иType II (кубовидные) клетки. Не удивительно, что легкие взрослых, как полагают, обладают разными эпителиальными стволовыми клетками и клетками предшественниками с функциональной специфичностью по всему респираторному д реву.

Figure 1. Lung epithelial cell lineages and their niche microenvironment in the adult mouse. The fate, specificity, and function of epithelial stem/progenitor cells in the lung are mediated by their intimate association with different niche microenvironments throughout the proximal and distal regions of the lung. Abbreviation: SMG, submucosal gland.

В трахее и в проксимальных частях бронхиальных воздушных путей исследования по картированию судеб выявили, что базальные клетки (p63pos, Krt5pos и/или Krt14pos), Clara клетки (Scgb1a1pos) и SMG клетки протоков (Krt14pos) функционируют как обновляемые стволовые клетки и клетки предшественники, способные к дифференцировке как в реснитчатый, так и секреторный клоны [2-6]. В бронхиолярных воздушных путях субнаборы из Clara клеток (Scgb1a1pos, CyP450neg и/или scgb3a2pos) находятся бок о бок с нейроэпителиальными клетками и способны давать Clara клетки и реснитчатые клетки, но не альвеолярные клетки [7-11]. Более дистально расположена популяция CCSPpos SP-Cpos бронхиоальвеолярных стволовых клеток (bronchioalveolar stem cells (BASCs)) при соединение бронхиоальвеолярных протоков обладает способностью деления и экспансии в ответ на повреждения [12-14] и уже давно было предположено, что Type II клетки функционируют как клетки предшественники для Type I клеток в альвеолах [15, 16]. Кроме того, недавно сообщалось, что p63pos Krt5pos Krt14pos клетки, обычно отсутствующие в дистальных частях легких мышей, способны к дифференцировке альвеолярного клона и вносят вклад в регенеративный процесс после H1N1 инфекции гриппа [17].

Эти исследования четко показали, что разные стволовые клетки и клетки предшественники ответственны за поддержание клонов эпителиальных клеток в разных компартментах легких взрослых. Удивительно низкая скорость оборота клеток в эпителии взрослых легких в стационарном режиме [18] обнаруживает зависимость от избранных повреждений и моделей пертурбаций, это указывает на характерные особенности, судьбы и специфичность взрослых стволовых клеток и клеток предшественников, ответственных за поддержание гомеостаза эпителиальных клеток in vivo. Используя этот подход, Giangreco et al. [19] показали, что стволовые клетки и клетки предшественники, обладающие разными пролиферативным и регенеративным потенциалами, ответственны за поддержание эпителия воздушных путей в устойчивом состоянии и после пертурбаций и повреждений. Однако, остается неясным, отражает ли пространственная дискриминация клональных взаимоотношений, наблюдаемая в этих моделях, клональный потенциал дискретных стволовых клеток и клеток предшественников или пространственно-временные изменения сигналов микроусловий, предопределяющих их судьбу. Выяснение точной иерархической организации стволовых клеток и клеток предшественников и понимание предопределяющих свойств стволовых клеток и клеток предшественников на уровне индивидуальных клеток д. иметь большое значение для терапевтического использования.

Prospective Isolation of Endogenous Mouse Lung Epithelial Stem/Progenitor Cells

Первым кандидатом самообновления популяций стволовых клеток и клеток предшественников в дистальных частях легких, идентифицированным с помощью ex vivo клоногенного анализа с помощью проточной цитометрии отсортированных не эндотелиальных (CD31^neg), не гематопоэтических (CD45^neg) клеток стали клетки Sca-1^pos [12]. Эта когорта Sca-1^pos легочных клеток представляет собой гетерогенную популяцию эпителиальных и мезенхимных стволовых клеток и клеток предшественников и дифференцированных клеток [12, 20-22]. Улучшенные стратегии сортировки, базирующиеся на дифференциальной экспрессии EpCAM и Sca-1, теперь позволяют выявлять разные эпителии (EpCAM^pos Sca-1^low) и мезенхимные (EpCAM^neg Sca-1^hi) клеточные клоны [23, 24]. Используя этот подход, мы показали, что эпителиальные стволовые клетки и клетки предшественники? это фракция, обогащенная EpCAM^pos Sca-1^low α6 integrin (α6)^pos β4 integrin (β4)^pos CD24^low, тогда как реснитчатые клетки обнаруживают высокие уровни экспрессии CD24, a Type II клетки лишены экспрессии β4 [23]. Будучи посеяны в трехмерную культуру эпителиальные стволовые клетки и клетки предшественники из этой фракции были способны к самообновлению и давали колонии, представляющие воздушные пути, альвеолярные или смешанные легочные эпителиальные клональные клетки, указывая тем самым, что существует иерархия эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников в лёгких взрослых мышей [23]. Параллельные исследования подтвердили, что экспрессия a6β4 integrin является определяющим биомаркером для легочных эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников и далее было показано, что SP-C^neg a6^pos β4^pos клетки спорадически распределены в альвеолярных стенках и обладают способностью пополнять SP-C^pos Type II клетками альвеолы, подтвердив, что поддержание альвеолярного эпителия использует пролиферацию и дифференцировку вкрапленных клеток предшественников, а не просто экспансию Type II клеток [25]. Кроме того, Zacharek et al. [14] недавно сообщили, что BASCs также обогащены EpCAM^pos Sca-1^low CD24^low фракцией (Fig. 1).

Перекрывание иммунофенотипических профилей этих независимо идентифицированных дистальных популяций эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников показывает, что каждый образец может содержать по-разному обогащенные популяции общих эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников скорее, чем обладать контекст зависимой дифференцировкой в зависимости от его локализации. Сходным образом, пространственно отличающиеся базальные клетки и SMG клетки протоков, которые обладают способностью генерировать mucous и реснитчатый клоны, были изолированы из проксимальных частей воздушных путей на базе экспрессии NGFR^pos a6^pos [4, 6, 26]. Соответственно характеристика изолированных клеточных популяций д. распознавать их гетерогенности и мы воодушевлены на последующие исследования клональных взаимоотношений между изолированными клеточными популяциями. Вопрос сортировки клеток на уровне одиночной клетки контролируемым и упрощенным способом in vitro позволит детально исследовать клональные взаимоотношения, и анализировать способ, при котором индивидуальные элементы сложных, многогранных микроусловий легких регулируют функцию эпителиальных эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников.

DELINEATING REGENERATIVE CELLS OF THE EPITHELIAL STEM/PROGENITOR CELL NICHE MICROENVIRONMENT

Легкие взрослых представлены, по крайней мере, 40-60 разными типами клеток энтодермального, мезодермального и эктодермального происхождения, которые очень точно организованы в детально разработанную 3D структуру с региональным разнообразием вдоль проксимо-дистальной оси. В дополнение к разнообразию эпителиальных клеток, оно включает хондроциты верхних частей воздушных путей, гладкомышечные клетки воздушных путей, интерстициальные фибробласты, миофибробласты, липофибробласты и перициты, а также сосудистые, микрососудистые и лимфатические эндотелиальные клетки и иннервирующие нервные клетки (Fig. 1). Возможно, что регенеративная способность легочных эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников в разных регионах легких предопределяется не только их внутренне присущим онтогенетическим потенциалом, но и также сложными взаимодействиями пермиссивных и ограничивающих сигналов, обеспечиваемых этими интимно ассоциированными клеточными клонами, а также циркулирующими клетками, растворимыми и нерастворимыми факторами и цитокинами внутри их микроусловий ниш.

Взаимодействия между разными клеточными клонами реципрокные, многонаправленные и взаимозависимые. Аутокринные и паракринные факторы, вырабатываемые мезенхимными и эндотелиальными клетками, необходимы для пролиферации и дифференцировки клеток легочного эпителия [27, 28], тогда как факторы, производимые эндотелиальными и эпителиальными клетками также регулируют пролиферацию и дифференцировку мезенхимных клеток, отложение и ремоделирование внеклеточного матрикса и адгезией обеспечиваемую передачу сигналов [29, 30]. Хемотактические факторы, вырабатываемые этими клеточными клонами, также руководят рекрутированием воспалительных клеток, которые участвуют в ремоделировании ниш и в регуляции пролиферации и дифференцировки их клеточных составляющих. Поскольку легочные эпителиальные стволовые клетки и клетки предшественники составляют главный фокус исследований легких для регенеративной медицины, использование клеточной терапии скорее всего нуждается в точном понимании организации, регуляции и регенеративного потенциала легочных мезенхимных и эндотелиальных клеток и того, как эти компартменты изменяются при инициации прогрессировании болезни.

Lung Mesenchymal Stem/Progenitor Cells

Давно известно, что мезенхима трахей и дистальных частей эмбриональных легких обладает индуктивными свойствами для региональной спецификации эмбрионального эпителия [31]. Во время развития легких мезенхимные стромальные клетки на дистальном кончике ветвящегося эпителия, как известно, секретируют fibroblast growth factor (FGF)-10, который влияет на судьбу и специфичность клеток предшественников раннего легочного эпителия [32, 33]. FGF-10 является критическим компонентом многогранной эпителиально-мезенхимной клеточной сигнальной сети с участием Bmp, Wnt и Shh путей, которые координируют пролиферацию и дифференцировку клеток предшественников в развивающихся легких (reviewed in [34]). Исследования по клональном отслеживанию также показали, что FGF-10^pos мезенхимные клетки, располагающиеся на кончике ветвления эпителия функционируют как стволовые клетки и клетки предшественники для гладкомышечных клеток, которые становятся распределенными вдоль удлиняющихся воздушных путей [35, 36]. В др. исследованиях мезенхимные стромальные клетки, соседствующие с трахеей и внелегочными бронхами, как было установлено, также дают бронхиолярные гладкомышечные клетки [37]. Итак эти исследования подтвердили, что , по крайней мере, две самостоятельные популяции мезенхимных стромальных клеток обладают свойствами модулирования эпителия во время развития.

C тех пор несколько исследований идентифицировали постоянно присутствующие мезенхимные стромальные клетки в легких взрослых со способностью адипогенной, хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировки. Эти клетки были клонально размножены из гетерогенных популяций из смешанных клеточных клонов, определяемых по их способности выделять Hoechst 33342 [38, 39], по их необходимости для роста легочных эксплантов в культуре [40] или по характерной для них экспрессии Sca-1 [21, 22]. Кроме того, дальнейшее обогащение CD45^neg CD31^neg Sca-1^pos мезенхимных стромальных клеток было достигнуто на базе отсутствия экспрессии у них EpCAM, который избирательно метит клетки эпителиального клона [23]. Важно, что разделение мезенхимных и эпителиальных клонов показало, что популяция эндогенных легочных мезенхимных стромальных клеток необходима и достаточна для поддержания пролиферации и дифференцировки бронхиолярных эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников в совместной культуре [23]. Это подтверждает, что мезенхимные стромальные клетки взрослых обладают сходными с эпителием индуктивными свойствами их эмбриональных аналогов и являются важным элементом ниш эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников во взрослых легких. Эта концепция подтверждается недавними исследованиями in vivo. показавшими, что после повреждения naphthalene клеток Clara, парабронхиальные мезенхимные клетки секретируют FGF-10, чтобы поддержать регенерацию эпителия из выживших эпителиальных стволовых клеток и клеток предшественников [41].

Lung Endothelial Progenitor Cells

Эндотелиально-эпителиальные взаимодействия клеток и ангиогенные и ангиокринные факторы, продуцируемые микроусловиями легочных стволовых клеток и клеток предшественников также играют интегральную роль в регуляции регенерации и репарации эндогенных легочных стволовых клеток и клеток предшественников [27-29]. Напр., недавнее исследование сообщило, что совместное культивирование человеческих сосудистых эндотелиальных клеток с человеческими бронхиальными эпителиальными клетками способствуют генерации разветвленных бронхиоальвеолярные эпителиальных структур в системе 3D культуры [42]. Поскольку существенный прогресс был достигнут в понимании гетерогенности, функционального разнообразия патофизиологического поведения легочных сосудистый и микрососудистых эндотелиальных клеток, то иммунофенотипическое профилирование, количественный анализ и функциональный анализ легочных endothelial progenitor cells (EPC) отстали. Так для EPC, происходящих из крови пупочного канатика человека, костного мозга и мобилизированной периферической крови [43], редкость EPC в легких, отсутствие у них отличительных маркеров и неспособность отличать циркулирующие EPC и располагающиеся в ткани EPC оказались основными препятствиями в оценке вклада эндогенных легочных EPC в репарацию легочных сосудов и в регенерацию и ремоделирование легких [44, 45].

Легочные макрососудистые и микрососудистые эндотелиальные клетки могут быть различены на базе их предпочтительного соединения с лектинами Helix pomatia и Griffonia simplicifolica, соотв. [46], но отсутствуют др. поверхностные маркеры, которые могут позволить отличать эндотелиальные клетки и EPC легких взрослых [45]. Кроме того, редкость EPC также требует ex vivo размножения и пассирования слипчивых гетерогенных легочных эндотелиальных клеток крыс [47] или мышей [48] в жидкой культуре перед количественным анализом и проточной цитометрией и функциональным анализом, происходящих из легких EPC in vitro. Эти испытания указывают на то, что легочные микрососуды являются богатым источником EPC. Однако необходимо отметить, что сфера действия, иммунофенотипические и функциональные свойства EPC в первичных эксплантированных эндотелиальных клетках по сравнению с их ex vivo обработанными, отобранными и размноженными аналогами остается неясной. Способность этих эндогенных легочных EPCs вносить вклад в репарацию и ремоделирование сосудов in vivo также не проверено [45]. Хотя недавние исследования указывают на то, что, скорее всего, как циркулирующие EPC, так и располагающиеся в легких EPC вносят вклад в регенерацию и репарацию эндотелиальных клеток [49-51].

CHALLENGES IN DELIVERING CELL-BASED THERAPIES FOR LUNG DISEASE

Упрощенные подходы, описанные выше идентифицировали эндогенный легочный эпителий, мезенхимные и эндотелиальные стволовые клетки и клетки предшественники в качестве популяций кандидатов, вокруг которых регенеративная терапия легочных болезней д. крутиться. Однако существует множество существенных затруднений и практических доводов, которые д. быть адресованы разработке терапии, базирующейся на стволовых клетках в регенеративной медицине легких.

Различные легочные болезни имеют разные патологии, затрагивающие разные клеточные клоны. Некоторые нуждаются в замещении или коррекции проксимальных или дистальных эпителиальных клеточных клонов, тогда как др. нарушения нуждаются в манипуляциях или регуляции разрегулированных субэпителиально-мезенхимных и микрососудистых клонов эндотелиальных клеток. Важно, что функциональная организация трофических единиц легких также д. быть точно скоординирована в отношении рекрутирования и пролиферации эпителиальных, мезенхимных и эндотелиальных клеточных компартментов для регенерации и репарации легких, чтобы продолжить их упорядоченным образом, избегая образования неэффективных респираторных единиц с нарушенным газообменом и персистирующими аномалиями [52].

Пластичность ниш стволовых клеток во время прогрессирования болезни также д. влиять на потенциал приживания трансплантата и регенерации эндогенных стволовых клеток и клеток предшественников, а также на свойства стволовых клеток и клеток предшественников по поддержанию мезенхимных и эндотелиальных клеток, элементов представляющих их ниши. Протоколы подготовки, разработанные для оптимизации репаративного потенциала трансплантированных и эндогенных стволовых клеток, могут быть необходимы для скоординированной доставки или совместной трансплантации мезенхимных и/или EPCs клеток для репарации ниш, чтобы нормализовать поведение регенеративного эпителия.

Недавние прототипические эксперименты по анализу приживания трансплантатов, пролиферации и дифференцировке определенных популяций легочных клеток, посеянных на бесклеточный легочный каркасный биоматрикс [53-55] предоставил ценную модель для определения критических микросредовых вариаций, которые специфицируют судьбы и регенеративную способность эндогенных стволовых клеток и клеток предшественников, поскольку этот подход доказан эффективностью биоинженерных трахейных и крупных бронхиальных имплантов при клинических трансплантациях [56, 57], затруднения труднопреодолимы при применении этого подхода к биоинженерингу дистальных частей легких.

CONCLUSIONS AND FUTURE DIRECTIONS

The cell separative strategies and clonogenic assays we have described provide powerful tools for monitoring the status of regenerative cells in the normal, diseased or injured lung and for identifying the factors, cytokines, and molecular pathways that can be manipulated to harness their potential in lung regenerative medicine. However, much still remains to be done in order to establish the origins, organization, and role of clonogenic cells identified in the surrogate stem/progenitor cell assays described in this review in maintaining the functional integrity of the adult lung throughout life.

Key issues that remain to be resolved in order to move the field forward include: the cross-referencing of candidate stem/progenitor cell targets prospectively isolated by different laboratories using similar but not identical biomarker repertoires and functional assays; the delineation of the properties of the permissive and/or restrictive stem/progenitor cell niche in which they reside; the development of “gold-standard” in vivo assays to determine the relationship between candidate stem/progenitor cells identified in in vitro clonogenic assay readouts and regenerative cells in vivo; and, the identification of biomarkers for the characterization of human homologs of candidate stem/progenitor cells identified in mouse models. These objectives will entail rigorous interrogation of well-characterized lung injury and loss-of-function and gain-of-function models combining lineage tracing and clonogenic analysis to understand the lineage relationship between candidate stem/progenitor cells identified in different contexts.

Because adult lung stem/progenitor cells are characterized by the expression of multiple markers, which collectively specify the stem cell state but are not unique to any individual candidate stem progenitor cell type it will also be important to establish whether the heterogeneous behavior of immunophenotypically homogeneous target cells in different functional in vitro assays is indicative of cofractionation of heterogeneous cells expressing common biomarkers, or the stochastic commitment of homogeneous stem/progenitor cells to different fates in response to different microenvironmental cues. In this context, the lack of gold-standard transplantation assays for evaluating the regenerative potential of candidate stem/progenitor cells in vivo means that their ability to contribute to lung regeneration and repair is unproven.

Studies thus far have largely focused on the analysis of candidate stem/progenitor cells in mouse models. Relatively few studies describe the prospective isolation and characterization of homologous human endogenous stem/progenitor cell targets, and these have largely analyzed unfractionated cells in liquid or air-liquid interface culture systems or devitalized tracheal xenograft models, which are not amenable to clonogenic analysis (reviewed in [58]).

Translational studies have also been impeded by the lack of biomarkers for the characterization of homologous targets in different species. For example, the Sca-1 antigen which has been used extensively to identify and prospectively isolate both epithelial and mesenchymal stem/progenitor cell targets in the mouse has no human homolog [59]. The analysis and prospective isolation of adult human lung stem/progenitor cell targets have also been impeded by the inherent biological variability encountered in processing human tissue as well as the difficulty in obtaining adequate amounts of normal human tissue to identify and prospectively isolate rare cell subpopulations. Importantly, human lung tissue representative of the normal steady state is often obtained from patients with diverse respiratory diseases. This will likely affect the relative expression of stem/progenitor cell associated biomarkers compromising the fidelity of cell separative strategies, the validation of surrogate stem/progenitor cell assays, and the identification and quantitation of candidate human lung stem/progenitor cell targets. While a recent study [60] has described the isolation of candidate human multipotent endogenous lung stem cells on the basis of their expression of the c-kit cell surface antigen, significant reservations have been raised about the rigor of the experimental designs used to characterize these cells and evaluate their regenerative capacity [61]. Their role in lung regeneration and repair awaits confirmation and validation in independent studies.

Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative PotentialJonathan L. McQualter, Ivan Bertoncello STEM CELLS Volume 30, Issue 5, pages 811–816, May 2012

Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential
Jonathan L. McQualter, Ivan Bertoncello
STEM CELLS Volume 30, Issue 5, pages 811–816, May 2012